Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.
Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.
Бактериологический метод исследования включает:
1. посев исследуемого материала в питательные среды
2. выделение чистой культуры
3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).
Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:
I этап (работа с нативным материалом)
Цель: получение изолированных колоний
1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре
2. Подготовка материала к исследованию
3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний
4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов
II этап
Цель: получение чистой культуры
1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).
2. Микроскопическое изучение изолированных колоний
3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).
4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.
III этап
Цель: идентификация выделенной чистой культуры
1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:
· морфология и тинкториальные свойства
· культуральные свойства (характер роста на питательных средах)
· биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)
· серологические свойства (антигенные)
· вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)
· патогенность для животных
· фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)
· чувствительность к антибиотикам
· другие индивидуальные свойства
IV этап (Заключение)
По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре
Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.
При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.
Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.
Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.
Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Так как материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырастает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии, очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изучают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет; полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).
Таблица 11. Схема изучения колоний
| № | Признак | Возможные характеристики колоний |
| 1. | Форма | Плоская, выпуклая, куполообразная, вдавленная, круглая, розеткообразная, звездчатая |
| 2. | Величина, мм | Крупные (4-5 мм), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм), карликовые (< 1 мм) |
| 3. | Характер поверхности | Гладкая (S-форма), шероховатая (R-форма), слизистая (М-форма), исчерченная, бугристая, матовая, блестящая |
| 4. | Цвет | Бесцветные, окрашенные |
| 5. | Прозрачность | Прозрачные, непрозрачные, полупрозрачные |
| 6. | Характер краев | Ровные, зазубренные, бахромчатые, волокнистые, фестончатые |
| 7. | Внутренняя структура | Гомогенная, зернистая, неоднородная |
| 8. | Консистенция | Вязкая, слизистая, крошковидная |
| 9. | Эмульгирование в капле воды | Хорошо, плохо |
Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.
Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют небольшое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).
Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для этого из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).
При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые культуры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.
Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического положения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия культивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).
Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.
Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают пробку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.
Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут пробирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.
При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°С на сутки.
Заключение
Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.
Вид - совокупность микроорганизмов, имеющих общее эволюционное происхождение, близкий генотип (высокую степень генетической гомологии, как правило более 60%) и максимально близкие фенотипические характеристики. Штамм – выделенная культура данного вида бактерий («конкретный образец данного вида) Колония – видимая глазом изолированная структура, образующаяся в результате размножения и накопления м/о за определенный срок инкубации и из одной родительской клетки или из нескольких идентичных клеток.
Методы лабораторной диагностики Ø Микроскопический – обнаружение м/о непосредственно в клиническом материале Ø Бактериологический – выявление м/о путем посева материала на питательные среды Ø Биологический – выделение м/о из предварительно зараженного лабораторного животного Ø Серологический –выявление специфических иммунных антител в сыворотке крови больного Ø Аллергический –постановка кожно-аллергических проб (узко специфичен – туберкулез, туляремия и др.)
Ø Культуральные - характер роста микроорганизма на питательных средах. Ø Биохимические - способность ферментировать различные субстраты (углеводы, белки и аминокислоты и др.), образовывать в процессе жизнедеятельности различные биохимические продукты за счет активности различных ферментных систем и особенностей обмена веществ. Ø Антигенные - зависят преимущественно от химического состава и строения клеточной стенки, наличия жгутиков, капсулы, распознаются по способности макроорганизма (хозяина) вырабатывать антитела и другие формы иммунного ответа, выявляются в иммунологических реакциях.
Физиологические- способы углеводного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) и других видов питания, тип дыхания (аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы). Ø Подвижность и типы движения. Ø Способность к спорообразованию, характер спор. Ø Чувствительность к бактериофагам, фаготипирование. Ø Химический состав клеточных стенок - основные сахара и аминокислоты, липидный и жинокислотный состав. Ø Белковый спектр (полипептидный профиль). Ø Ø Чувствительность к антибиотикам и другим лекарственным препаратам. Ø Генотипические (использование методов геносистематики).
Бактериологический метод включает посев клинического материала на искусственные питательные среды, выделение чистых культур микробов и их последующую идентификацию.
Бактериологические методы используются: в диагностике инфекционных заболеваний; Ш При профилактических обследованиях на носительство бактерий кишечной группы, дифтерийной палочки и др. ; Ш при изучении санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды (вода, воздух, почва, продукты питания и др.) и исследовании их по эпидемиологическим показаниям на зараженность патогенными видами микроорганизмов. Ш
Физиологическая характеристика Отношение к температуре Дыхание Питание Ферменты Метаболизм белков и аминокислот (желатиназа, коллагеназа, декарбоксилазы, уреаза) Другие ферменты (гемолизины, липазы, лецитиназа, ДНКаза) Конечные продукты метаболизма (хроматография) Устойчивость/чувствительность к АМП
Элементы, которые в первую очередь необходимы для роста микроорганизмов и должны включаться в состав питательной среды, определены из химического состава микробных клеток, который, в принципе, одинаков у всех живых организмов. Основная часть общей массы клеток представлена водой (80 – 90%) и только 10 – 20% приходится на сухое вещество. По количественному содержанию в сухом веществе выделяют макро- и микроэлементы. К числу первых относятся: углерод, кислород, азот, водород, сера, фосфор, калий, натрий, магний, кальций, железо. К микроэлементам –– марганец, молибден, цинк, медь, кобальт и др. , большинство из которых необходимо в следовых количествах. По этой причине в состав многих сред микроэлементы не добавляют, так как потребность в них может быть удовлетворена за счет примесей в солях макроэлементов. Кроме того, не все микроорганизмы нуждаются в микроэлементах. 14
В отличие от животных и растительных организмов, микроорганизмы характеризуются разнообразием и типов питания, которые выделяют по трем основным критериям –– источник углерода, источник энергии и донор электронов (водорода). В зависимости от природы источника углерода все микроорганизмы разделены на 2 большие группы –– автотрофы, использующие углекислоту, и гетеротрофы, требующие для роста и размножения готовых органических веществ. С учетом разнообразия источников энергии и доноров электронов эти группы подразделены на подгруппы, в результате чего у микроорганизмов выделены 8 типов питания. Каждый тип питания характерен для определенных микроорганизмов и отражает их физиологобиохимические свойства. Большинство микроорганизмов, в том числе и патогенных, имеют тип питания, при котором источником углерода, энергии и донорами электронов являются органические вещества. 16
Потребности микроорганизмов в органических источниках углерода весьма разнообразны. Некоторые виды являются ≪всеядными≫ и могут потреблять различные по химической природе вещества, другие отличаются большей избирательностью и используют лишь некоторые из них. Специфичность набора органических соединений, свойственного каждому виду микроорганизмов, учитывается при создании элективных и дифференциально-диагностических сред, широко применяемых в санитарной и клинической микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов. При выборе углеродсодержащего субстрата необходимо учитывать, что усвояемость органических веществ в значительной степени зависит и от их свойств –– растворимости, степени окисленности атомов углерода, пространственной конфигурации и полимеризации их молекул. Обычно микроорганизмы усваивают определенные оптические изомеры –– сахара, относящиеся к D-ряду, аминокислоты –– к L-ряду. Очень мало микроорганизмов обладают ферментами, под действием которых один оптический изомер превращается в другой. Использовать такие биополимеры как крахмал, полисахариды, белки, жиры могут только те микроорганизмы, у которых синтезируются определенные гидролитические ферменты –– амилазы, протеазы, липазы в форме экзоферментов, т. е. ферментов, выделяемых клеткой в среду обитания. 17
Для подавляющего большинства гетеротрофных микроорганизмов основными, легко доступными источниками углерода и энергии являются углеводы, аминокислоты, белки, органические кислоты. Характеризуя потребность микроорганизмов в органических источниках углерода следует отметить, что наибольшая степень гетеротрофности присуща патогенным микроорганизмам, приспособившимся к жизни в организме человека и животных. Состав питательных сред для их культивирования особенно сложен. Они содержат белки или продукты их неглубокого гидролиза (пептиды), витамины, фрагменты нуклеиновых кислот и др. Для приготовления таких сред используют различного типа гидролизаты и экстракты мяса, кровь или сыворотку, дрожжевые и растительные экстракты и многое другое. Эти среды пригодны для культивирования самых разных видов и особенно удобны в тех случаях, когда неизвестна потребность микроба в факторах роста или он нуждается во многих факторах роста одновременно. Недостатком таких сред является сложность или невозможность достижения их стандартности из-за нестандартности и ограниченной контролируемости состава и свойств исходного сырья. 18
Конструктивный метаболизм микроорганизмов в целом направлен на синтез четырех основных типов биополимеров –– белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Для биосинтеза белков и нуклеиновых кислот важнейшим элементом, кроме углерода, является азот. Самым доступным источником азота для большинства микроорганизмов являются ионы аммония, которые они могут получать из солей органических и неорганических кислот, аминокислот, белков и других азотсодержащих веществ. Для многочисленной группы бактерий, главным образом патогенных, в качестве источников азота необходимы азотсодержащие органические вещества. Если таким источником азота являются аминокислоты, микроорганизмы могут их использовать непосредственно для синтеза белков, либо предварительно осуществить их дезаминирование, а выделившиеся при этом аминогруппы использовать для синтеза собственных аминокислот, белков. 19
Однако, для роста некоторых микроорганизмов необходимы определенные аминокислоты, которые они не могут синтезировать сами. К числу микроорганизмов, нуждающихся в таких ≪незаменимых≫ аминокислотах, относятся золотистый стафилококк, гемолитический стрептококк, молочнокислые бактерии и некоторые другие. В зависимости от физиологических особенностей микробов, количество ≪незаменимых≫ аминокислот различно –– для золотистого стафилококка обязательно наличие в питательной среде лишь триптофана и цистина, а для гемолитического стрептококка –– 17 аминокислот. Белки, как источники азота, доступны только тем микроорганизмам, которые образуют протеолитические ферменты, выделяемые в среду (т. е. в экзоформе). Под действием этих ферментов белки расщепляются до более низкомолекулярных веществ –– пептонов и аминокислот. 20
Энергетический метаболизм микроорганизмов, как и конструктивный, характеризуется разнообразием биохимических механизмов. В этом метаболизме различают три основных типа ––аэробное дыхание, анаэробное дыхание и брожение, наиболее распространенным из которых является аэробное дыхание. В этом процессе органическое вещество окисляется до углекислоты и воды с максимальным выделением энергии, заключенной в этом веществе. Многие микроорганизмы с аэробным дыханием –– строгие аэробы, однако некоторые из них относятся к факультативным аэробам, поскольку они могут образовывать АТФ и в анаэробных условиях ––путем брожения. Некоторые микроорганизмы, главным образом бактерии, получают энергию в анаэробном дыхании, т. е. в результате окисления веществ, где в качестве акцепторов электронов выступает не кислород, а неорганические соединения. Так, отдельные виды рода Bacillus, E. coli осуществляют анаэробное дыхание, в процессе которого нитрат (NO 3) восстанавливается до аммиака; Clostridium aceticum окисляет молекулярный водород, используя в качестве акцептора электронов углекислоту. 21
Простейшим по метаболизму типом энергетического метаболизма является брожение. Процессы брожения протекают в анаэробных условиях и сопровождаются выделением энергии. Основным субстратом брожения являются углеводы, однако бактерии могут сбраживать органические кислоты, в том числе и аминокислоты, а также пурины и пиримидины. Известно много типов брожения, каждый из которых вызывается особой группой микроорганизмов и в соответствии с механизмом сопровождается образованием специфических конечных продуктов. Конечными продуктами брожений обычно являются различные органические кислоты –– молочная, уксусная, янтарная, лимонная и др. , а также спирты (этиловый, бутиловый, пропиловый), углекислый газ и водород. По выходу основного конечного продукта выделяют и соответствующие типы брожения. В силу того, что при брожении не происходит полного окисления субстрата и в среду выделяются частично окисленные вещества, еще содержащие энергию –– органические кислоты, спирты и др. , общий выход АТФ в этом процессе на 1 моль сбраживаемого субстрата значительно (~ в 30 раз) ниже, чем при метаболизме того же субстрата в процессах дыхания. 22
Особая роль принадлежит Роберту Коху. Постулировав необходимость выделения чистой культуры микроба, он тем самым определил необходимость создания условий для решения этой задачи. Важнейшим из них явилась питательная среда, на которой можно было бы получить рост микроорганизма. С именем Коха связывают внедрение в микробиологическую практику в 1881 г. плотных питательных сред. Сама идея их использования возникла раньше и принадлежит немецкому исследователю Бредфельду. Более того, еще в 1877 г. Шретер культивировал бактерии на ломтях картофеля, что также может трактоваться как применение питательной среды. Заслуга Коха заключается в глубоком научном подходе к проблеме, широком использовании питательных сред в собственных исследованиях. Им же предложен первый отвердитель –– желатин, как компонент плотной среды. 25
Привычный для современных микробиологов агар-агар был внедрен Фростом в повседневную практику значительно позже, в 1919 г. , хотя справедливо было бы вспомнить, что еще в 1881 г. Немецкая исследовательница Хессе предложила агар-агар. Более того, в 1913 г. русский микробиолог В. Л. Омелянский, отдавая должное питательным средам с желатином, отмечал, что агаризованные питательные среды предпочтительнее в тех случаях, когда микроб разжижает желатин. Идеи и практическая деятельность Коха получили в конце 19 и первой четверти 20 столетий интенсивное развитие. Именно в этот период исследователи ряда стран предложили питательные среды различного назначения, роль которых для практической микробиологии была и остается весьма значительной. Современный микробиолог каждый день в своей работе вспоминает их имена. В эти немногие годы японец по происхождению Ш. Эндо предложил свой агар для дифференциации энтеробактерий, австриец Э. Левенштейн –– среду для микобактерий, англичанин А. Мак. Конки –– селективную и дифференциально-диагностическую среду для кишечных микроорганизмов, немец Т. Китт и итальянец Д. Тароцци –– среду для облигатно анаэробных бактерий, француз Р. Сабуро, чех Ф. Чапек и американец А. Докс ––– среды для грибов, бразилец Р. Хоттингер –– среды широкого назначения на основе перевара мяса и т. д. 26
Общие требования Содержание всех элементов для построения микробной клетки Достаточная влажность Обеспечение изотонии Определенная концентрация водородных ионов Окислительно-восстановительный потенциал Стерильность
Основные фазы роста периодической культуры: начальная (лаг-) – 1, экспоненциальная (або логарифмическая) – 2 , стационарная - 3 отмирания – 4 (рис. 12) Рис. 12. Основные фазы роста микробной популяции на жидких питательных средах.
Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах Ø Ø Ø Рост бактерий с равномерным помутнением среды, цвет которого не изменяется или изменяется в соответствии с цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре микроба; Придонный рост бактерий – образование осадка (скудного или обильного, крошковидного, гомогенного, волокнистого и др.); Пристеночный рост с сохранением прозрачности питательной среды; Поверхностный рост бактерий – пленка на поверхности среды (тонкая, нежная, бесцветная или влажная, толстая хорошо видимая невооруженным глазом, плотная сухая со сморщенной, а иногда бородавчатой поверхностью); Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмента, вырабатываемого растущей культурой микроба.
Характер роста микроорганизмов на полужидких питательных средах Исследуемая культура засевается в столбик 0, 2 – 0, 5% полужидкий агар. Определяется способность микроорганизма к движению – распространение от места посева (укола) в среду уколом в непосредственной близости от стенки пробирки.
Среда Эндо Дифференциально-диагностическая Состав: Основа – питательный агар Диф. фактор – лактоза Индикатор – основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия Рост лактозо + колоний красного цвета с металлическим блеском
Среда Плоскирева Селективная, дифференциально-диагностическая Состав: Основа – питательный агар Элективный фактор – желчные соли, бриллиантовый зеленый, йод Диф. фактор – лактоза Индикатор – нейтральный красный Рост лактозо + колоний брусничного цвета
Солевой агар Элективная среда Состав: Основа – питательный агар Элективный фактор – соль 10% Индикатор – нет Рост колоний, устойчивых к соли
Желточно-солевой агар (Чистовича) Элективная, диагностическая Состав: Основа – питательный агар Элективный фактор – соль 10% Диф. фактор –желток яйца Индикатор – нет Рост колоний, устойчивых к соли, + помутнение вокруг колоний за счет лецитовителлазной активности
Тетратионатная среда Мюллера-Кауфмана Среда предназначена для селективного обогащения при выявлении бактерий рода Salmonella Состав: Основа – питательный бульон Элективный фактор – соль селинистой кислоты Индикатор – нет Рост бактерий, устойчивых к селинисто-кислому натрию
Солевой бульон Элективная среда Состав: Основа – питательный бульон Элективный фактор – 6. 5% Na. Cl Индикатор – нет Рост микроорганизмов, устойчивых к соли
Характер роста микроорганизмов на плотных питательных средах. Основные признаки: ü Размер – точечные (≤ 1 мм) – крупные (4 – 6 мм и более); ü Форма - правильная(круглая); неправильная (амебовидная), ризоидная; ü Контуры края – ровные или неровные(фестончатые, волнистые и др.) ü Рельеф колоний (куполообразные, плоско-выпуклые, колонии с вдавленным центром и др. ü Поверхность колонии (матовая или блестящая (S- R- формы); ü Цвет колонии (пигментообразование); ü Структура колонии (мелко- или грубо зернистые); ü Консистенция (вязкие, слизистые, пастообразные и др.
Пигментообразование бактерий Красно-коричневый (продигиозин) Serratia marcessens Желто-оранжевый, (каратиноиды) Рода Staphylococcus, Sarcina, M. tuberculosis Черный, бурый (меланин) B. cubtilis, Грибы рода Candida Синий (пиоцианин) P. aeruginosa Флюоресцирующий Желто-зеленый (пиовердин) Род Vibrio
Выделение чистых культур: посев на элективные среды Элективная среда Бэйд-Паркера для стафилококков. Рост микроорганизмов, устойчивых к теллуриту калия. Они превращают его в металлический теллур, и колония окрашивается в черный цвет
Выделение чистых культур: фильтрация через мембранные фильтры Микроорганизмы на фильтре Металлические обоймы для ядерных фильтров
26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.
Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя является основным методом бактериологического исследования
Изучение свойств микроорганизмов в бактериологической лаборатории с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (виду, роду) и называется их идентификация.
В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.
При бактериологическом методе в анаэростат помещают посевы анаэробов. Из аэростата удаляют воздух и заменяют его газовой смесью, которая не содержит кислород.
Основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое происходит на первом этапе исследования. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.
При бактериологическом методе применяют по возможности среды, на которых растет только конкретный вид бактерий - элективные среды, или среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов или по-другому дифференциально-диагностические среды.
При бактериологическом методе посев материала на питательные среды производят либо стеклянным или металлическим шпателем, либо бактериальной петлей таким образом, чтобы находящиеся в исследуемом материале бактерии рассеять по поверхности питательной среды. В результате такого рассеивания каждая бактериальная клетка попадает на свой участок среды.
В том случае, если в результате бактериологического метода исследования предполагается в исследуемом материале содержание малого количества возбудителя, посев производят на жидкую питательную среду для его накопления, так называемую среду обогащения, которая оптимальна для данного микроорганизма. Далее осуществляют пересев из жидкой питательной среды на плотные среды, разлитые в чашках Петри. Засеянную возбудителем среду помещают в термостат обычно при определенной температуре, что важно для бактериологического метода.
На втором этапе бактериологического метода исследования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.
Отмечают культуральные свойства колоний: их форму, величину, цвет, характер краев и поверхности, структуру, консистенцию. Далее для приготовления мазков используют часть каждой из намеченных колоний. Окрашивают мазки по Граму, микроскопируют, определяя тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства выделенной культуры и проверяя одновременно ее чистоту.
Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирки с оптимальной для данного вида средой, например, скошенным агаром, с целью накопления чистой культуры для более полного ее изучения. Пробирки перемещают на 18–24 часа в термостат. На втором этапе, кроме перечисленных исследований, нередко подсчитывают количество выросших колоний.
Для того чтобы провести такое исследование готовят последовательные разведения взятого исследуемого материала, из которых на чашки с питательной средой производят высев, подсчитывают количество выросших колоний, умножают на разведение, из чего определяют содержание микроорганизмов в материале.
Идентификация выделенной чистой культуры возбудителя и определение для этой культуры чувствительности к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам - третий этап бактериологичестого метода. Идентификацию выделенной бактериальной культуры производят по тинкториальным, морфологическим, биохимическим, культуральным, токсигенным, антигенным свойствам.
Первым делом берут мазок из культуры, выросшей на скошенном агаре, исследуют морфологию бактерий и проверяют чистоту культуры выросших бактерий. Далее осуществляют посев выделенной чистой культуры бактерий на среды Гисса. Желательно провести посев и на другие среды для определения биохимических свойств.
С помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином in vivo или in vitro определяют токсинообразование микробов. В ряде случаев изучают и другие факторы вирулентности. Вышеперечисленные исследования, которые проводятся в бактериологической лаборатории, позволяют определить род или вид возбудителя.
Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений химический препарат - антибиотик с жидкой питательной средой разводят в пробирках, после чего засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. В результате бактериологического метода исследования для определения идентичности штаммов, полученная антибиотикограмма может служить и эпидемиологическим целям.
Могут проводиться повторные исследования при выявлении бактерионосительства т. к. можно не обнаружить возбудителя в одной порции материала.
10385 0
Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.
В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию.
К основным требованиям , предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:
- взятие материала до начала этиотропного лечения;
- соблюдение условий стерильности при сборе материала;
- техническую правильность сбора материала;
- достаточное количество материала;
- обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
- сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.
Транспортировка материала в лабораторию должна быть осуществлена по возможности немедленно, но не более чем в течение 1—2 ч после его взятия. Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме; в частности, стерильные в норме материалы (кровь, спинномозговая жидкость) хранят и доставляют в лабораторию при 37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1-2 ч или не более суток при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставки проб в лабораторию в регламентированные сроки рекомендуют использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.
Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3-4 пробы крови, взятые с интервалом 4-6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры, если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.
Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1-2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1-2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.
Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3-5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.
Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят per rectum на глубину 5-6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае - в транспортную среду.
Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3-5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.
Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.
Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20-50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами - лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).
Мокрота . Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.
Промывные воды бронхов . При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.
Отделяемое глотки, ротовой полости и носа . Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.
Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.
Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов.
Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют , т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.
Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае реконвалесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства.
Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.
Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред , а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма.
Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.