Кардинальное влияние на течение ряда патологических процессов в организме может оказывать как ускорение, так и замедление апоптоза . Вещества, участвующие в регуляции апоптоза, как правило, являются белками, а их синтез контролируется соответствующими генами . Одинаковые гены, регулирующие уровень апоптоза, можно обнаружить у живых существ, стоящих на самых различных ступенях эволюционной лестницы. К числу генов, стимулирующих апоптоз относятся гены p53, Bax, bcl-xS. С другой стороны, были описаны гены, синтезирующие белки, ингибирующие апоптоз (Bcl-2, Ced-9, BHRF1, MCL-1). Про- и антиапоптозные белки способны объединяться друг с другом, формируя гомо- и гетеродимеры. Например, при объединении ингибитора апоптоза белка Bcl-2 c белком активатором апоптоза Bax итог (торможение или активация апоптоза) будет определяться тем, какой белок будет преобладать в этом объединении .
Наиболее яркими и информативными белками, отражающими протекающие синтетические процессы в клетках и тканях, являются белки семейства Bcl-2, которые занимают центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза. Механизм регуляции этого процесса целесообразно рассматривать с позиции структурно – функциональных взаимоотношений между белками этого семейства, которые позволяют объединить их в одно семейство – белков Bcl-2 . Белки этого семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо- и гетеродимеры, что в конечном счёте влияет на развитие апоптоза клеток . Поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяет равновесие между жизнью и смертью клетки.
К настоящему времени известно, что белки семейства Bcl-2 относятся либо к индукторам апоптоза (Bad, Bax, J3ik, Bid, Bak), либо к ингибиторам (Bcl-2, Bcl-X). Белок семейства Bcl-2 относится к классу G – белков . Белок с молекулярной массой 26 кДж, кодируемый геном Bcl-2, содержит трансмембранный домен и локализуется в митохондриальной мембране, перинуклеарном эндоплазматическом ретикулуме, ядерной мембране и в митотических хромосомах .
Bcl-2 является фактором выживания клетки, защищая её от программированной гибели, и проявляет онкогенное свойство, так как препятствует апоптозу . Ген Bcl-2 выполняет функцию негативного регулятора апоптоза. Установлено, что уменьшение концентрации Bcl-2 приводит к апоптотической гибели клеток, тогда как сверхэкспрессия его защищает клетки от смерти .
Наиболее хорошо изучена последовательность событий, приводящих клетку к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства TNF со специфическими рецепторами. Ярким представителем этой группы белков является система Apo-1/Fas/FasL. Следует отметить, что для этой системы не известны другие функции, кроме как индукции апоптоза клетки.
Apo-1/Fas/CD-95 – рецептор, по структуре, относящийся к рецепторам семейства TNF . Взаимодействие Apo-1/Fas (рецептор) с FasL (лиганд) или с моноклональными антителами приводит к апоптозу клетки. Apo-1/Fas конститутивно экспрессируется на поверхности клеток многих типов: на тимоцитах, лимфобластоидных клеточных линиях, активированных Т- и В-лимфоцитах, а также на фибробластах, гепатоцитах, кератиноцитах, миелоидных клетках. Человеческий Apo-1/Fas состоит из 325 аминокислотных остатков и относится к мембранным белкам I типа. Т.е. в его структуре можно выделить внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический домены. Гомология аминокислотной последовательности среди рецепторов семейства TNF высока. Примерно 80 аминокислотных остатков образуют домен смерти (DD), который вовлекается в белок-белковое взаимодействие с цитоплазматическими белками, генерируя сигнал смерти. Ген Apo-1/Fas у человека локализован в длинном плече хромосомы 10 и состоит из 9 экзонов .
FasL является цитокином и относится к семейству цитокинов TNF. FasL экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и натуральных киллерах, а также на клетках Сертоли и паренхимных клетках передней камеры глаза, что позволяет этим клеткам убивать любую Fas-экспрссирующую клетку, в том числе и активированный Т-лимфоцит. Этот механизм определяет появление защищённых от иммунной системы мест. FasL существует в двух формах – нерастворимой или мембраносвязанной и растворимой, отщепляемой от клетки с помощью металлопротеиназы. Растворимая форма человеческого sFasL сохраняет свою активность. Подобно другим лигандам рецепторов семейства TNF, sFasL – гомотример связывается с 3 молекулами Apo-1/Fas.
При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков, таких как DD (домен смерти), относящего к рецептору, адапторного белка – FADD (Fas-ассоциированный домен смерти), содержащего DED – эффекторный домен смерти и прокаспазы-8. В результате этого процесса происходит активация апоптоз-специфической протеазы – каспазы-8 и развиваются характерные для апоптоза процессы. Мутации в гене fas или в гене FasL приводят к развитию аутоиммунных заболеваний.
Apo-1/Fas – это белок, который содержит 1 трансмембранную область, которая связываясь с FasL, индуцирует апоптоз в клетках-мишенях. Существует также не имеющая трансмембранного участка, растворимая, форма Apo-1 (sApo-1/Fas), которая присутствует в сыворотке крови и других биологических жидкостях. Согласно данным литературы, эта секреторная форма (sApo-1/Fas) может защищать клетки от Apo-1/лиганд индуцированного апоптоза и образуется путём отщепления аминокислотного остатка от трансмембранного домена .
В последние годы идентификацию апоптоза часто проводят, определяя активность каспаз, как инициаторных, так и эффекторных. В большинстве работ, проводимых с изучением активности каспаз, рассматривается каспаза-3, т.к. различные пути апоптотической гибели сходятся на ней, и её активация указывает на наличие апоптоза. Однако, если в исследование вводится определение активности каспазы-8, то помимо выявления программированной клеточной гибели как таковой, можно определить и путь её запуска, т.к. активация каспазы-8 указывает на рецепторный (внешний) механизм инициации процесса. Именно это является серьёзным преимуществом данного метода .
На сегодняшний день разработано более 60 различных методов выявления и изучения апоптотических клеток in vitro . В литературе описано несколько методических подходов к прижизненному выявлению апоптотических клеток in vivo. Эти методы базируются на качественной или количественной оценке событий, вызванных изменениями в наружной мембране клеток, избирательной фрагментацией ядерной ДНК, изменениями структуры внутриклеточных компонентов или их перераспределением, а также уменьшением pH цитоплазмы. Кроме того, встречаются атипичные формы апоптоза, при которых отсутствуют маркёрные апоптотические изменения .
По понятным причинам изучение механизмов апоптоза ГКС при ПОУГ у человека in vivo невозможно. В качестве косвенного показателя при изучении роли апоптоза в патогенезе ПОУГ проводилась оценка апоптотических маркёров в лимфоцитах периферической крови, характеризующих готовность последних к апоптозу . Для определения апоптотических клеток используются: лазерная сканирующая и проточная цитометрия, однофотонная эмиссионная компьютерная томография, магнитно – резонансная томография (МРТ), магнитно – резонансная спектроскопия, позитронно – эмиссионная томография . Также, для идентификации апоптотической гибели клеток применяются световая и флуоресцентная микроскопия с применением обычных методов фиксации и окрашивания, электронно – микроскопические методы, выявление олигонуклеосомной деградации ДНК in situ, иммуногистохимическое выявление белков – маркёров, участвующих в программированной гибели клеток, или фрагментированной ДНК, определение активности каспаз .
Изучение апоптоза на окрашенных стандартными способами препаратах применяется очень широко ввиду относительной простоты этих методов. Полученные при подсчёте апоптотически измененных клеток результаты выражают в виде так называемого апоптотического индекса. Критериями программированной гибели клеток могут выступать маргинация и пикноз хроматина, изменение контуров ядра, изменение контуров и фрагментация клеток, появление свободно лежащих ядер.
Для выявления программированной клеточной гибели в качестве субъективного метода часто используется флуоресцентная микроскопия. Исследуют как витально окрашенные клетки во взвеси, так и фиксированные препараты. При работе с живыми клетками широко применяется мечение аннексином V, позволяющим обнаружить на внешней стороне плазматической мембраны появляющийся в процессе апоптоза фосфатидилсерин.
При анализе клеток в условиях флуоресцентной микроскопии учитывают следующие признаки: размеры ядра (уменьшение), характер распределения хроматина (конденсация в глыбки неправильной формы, уплотнение), хроматиновые тела (сохранность мембранной изолированности), характер свечения ДНК. Апоптотическая ДНК выглядит конденсированной ярко-желто-зеленой. В жизнеспособных клетках акридин оранж вызывает диффузную зеленую флуоресценцию.
С помощью иммуногистохимических исследований определяют наличие белков, формирующих каскад биохимических процессов, приводящих к апоптозу. Часто к этой группе методов относят TUNEL и ИФА .
Многие исследователи отводят апоптозу ведущую роль в структурных изменениях диска зрительного нерва (ДЗН), обусловленных потерей ГКС . Роль апоптоза при развитии дегенеративных заболеваний, не вызывает сомнений. Имеется убедительный экспериментальный материал, свидетельствующий об участии апоптотического процесса в механизме ГОН при ПОУГ . Однако, в целом, клинические исследования факторов апоптоза у пациентов с разными стадиями глаукомы весьма ограничены, что затрудняет изучение их роли в патогенезе ГОН.
Страница источника: 265
1Обследовано 45 детей в возрасте 3–15 лет. Целью исследования явилось определение готовности к апоптозу лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови с помощью определения маркеров апоптоза – CD95, CD95L, BSL2. При оценке апоптоза иммунокомпетентных клеток установлено снижение готовности к программированной клеточной гибели лимфоцитов и увеличение – нейтрофильных гранулоцитов. Наиболее выраженные изменения регистрируются в возрастной группе 7–15 лет со стажем заболевания более 3-х лет. Полученные данные могут быть признаком подавления программированной гибели аутореактивных лимфоцитов в ткани поджелудочной железы, что способствует пролонгации иммунного ответа. Увеличение доли лейкоцитарных клеток, экспрессирующих CD95L, может способствовать усилению процессов запрограммированной клеточной гибели в островковых β-клетках поджелудочной железы, инфильтрированных иммунокомпетентными клетками.
апоптоз нейтрофилов
апоптоз лимфоцитов
сахарный диабет 1 типа
1. Пекарева Е. В. Маркеры апоптоза у больных сахарным диабетом 1 типа в дебюте заболевания / Е. В. Пекарева и др. // Сахарный диабет. – 2009. – № 4. – С. 86-89.
2. Пекарева Е. В. Роль апоптоза в патогенезе сахарного диабета 1 типа / Е. В. Пекарева, Т. В. Никонова, О. М. Смирнова // Сахарный диабет. – 2010. – № 1. – С.45-48.
3. Adeghate E. An update on the etiology and epidemiology of diabetes mellitus / E. Adeghate, P. Schattner, E. Dunn // Ann NY. Acad Sci, 2006. – Vol. 1084. – P. 1–29.
4. Clinical significance of neutrophil apoptosis in peripheral blood of patients with type 2 diabetes mellitus / С. Sudo et al. // Lab Hematol. 2007; 13(3):108-12 (снижена).
5. Filep J. G. Neutrophil apoptosis: a target for enhancing the resolution of inflammation / J. G. Filep, E. l. Kebir // J. Cell Biochem. – 2009. – Vol. 108. – P. 1039–1046.
6. Human polymorphonuclear neutrophil responses to Burkholderia pseudomallei in healthy and diabetic subjects / S. Chanchamroen et al. // Infect Immun. – 2009. – Vol. 77. – P. 456–463 (снижен апоптоз).
7. Impact of Lymphocyte Apoptosis in Diabetes mellitus / K. А. Awadhesh et al. // Asian Journal of Medical Sciences. – 2011. – № 2. – P. 1-6.
8. Inflammation is more persistent in type 1 diabetic mice / D. T. Graves et al. // J. Dent. Res., 2005. – Vol. 84. – P. 324–328.
9. Juliana C. Alves Infections in patients with diabetes mellitus: A review of pathogenesis / C. Juliana, C. Janine, C. Alves // Indian J. Endocrinol. Metab. – 2012 March. – Supp l1. – № 16. – P. 27–36.
10. Luo H. R. Constitutive neutrophil apoptosis: mechanisms and regulation / H. R Luo, F. Loison // Am. J. Hematol. – 2008. – Vol. 83. – P. 288–295.
Введение
Сахарный диабет 1 типа (СД1) является полигенным, мультифакторным заболеванием, связанным с образованием аутоантител и аутореактивных Т-лимфоцитов к β-клеткам поджелудочной железы .
Ведущими звеньями в патогенезе аутоиммунных поражений являются дисрегуляция иммунитета и программированной гибели клеток .
Контролируемый апоптоз рассматривается сегодня как главный механизм поддержания оптимального баланса клеток в очаге воспаления , ограничивающий экспансию активированных клонов и препятствующий развитию аутоиммунных реакций . При возникновении дефекта в его реализации активированные иммунные клетки могут аккумулироваться, что ведет к возникновению аутоиммунных заболеваний.
Цель исследования : изучение активационных маркеров апоптоза CD95, CD95L, Bsl2 на лимфоцитах и нейтрофилах периферической крови при сахарном диабете 1 типа у детей.
Материал и методы исследования
Выполнено обследование 45 детей c сахарным диабетом 1 типа в возрасте 3-15 лет. В группу I вошли 20 детей в возрасте 3-6 лет (дошкольники), в группу II - 12 детей в возрасте 7-15 лет (школьники) с длительностью заболевания менее 3-х лет, в группу III - 13 детей 7-15 лет (школьники) со стажем заболевания более 3-х лет. Контрольную группу составили 30 здоровых детей 3-6 (15) и 7-15 (15) лет. Исследование проведено на базе эндокринологического отделения ДГКБ им. Г. К. Филиппского г. Ставрополя.
Для оценки программируемой клеточной гибели выявляли количество лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих маркеры апоптоза. Лимфоциты выделяли на градиенте плотности Ficoll-Paque, нейтрофилы - на двойном градиенте плотности Ficoll-Paque и фиколл-урографин (GE Healthcare, Швеция). Суспензию клеток трижды отмывали в среде RPMI-1640 (Вектор-Бест, Россия). В культурах лимфоцитов и нейтрофилов оценивали количество клеток, экспрессирующих CD95, CD95L, Bsl2 методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (Invitrogen, США).
Для статистического анализа данных использовали пакет программ «Primer of Biostat 4,0», Attestat 10.5.1.». Для оценки межгрупповых различий применяли дисперсионный анализ повторных измерений с вычислением критериев Ньюмена - Кейлса, Данна.
Количественные значения характеризовались ненормальным распределением и были представлены в виде медианы и интерквантильного (25 и 75 процентили) размаха (Me (Q1-Q)). Достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты и их обсуждение
В работе было установлено уменьшение количества лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецепторы (CD95) у пациентов всех групп по сравнению со здоровыми детьми (табл. 1). Минимальные показатели отмечены у детей 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет (табл. 1).
Таблица 1
Показатели апоптоза лимфоцитов у детей с сахарным диабетом 1 типа
|
Клинические группы |
||||
|
3-6 лет |
СД1 (I) (n=20) |
17,7(15,9-19,43) * ** |
7,4(5,81- 8,94) * ** |
70,2(68,56-71,76) * ** |
|
Контрольная группа |
28,0(26,08-30,0) |
9,2(8,04- 10,25) |
65,9(62,82-69,05) |
|
|
7-15 лет |
20,5(17,94-23,02) * ** |
11,6(10,12-13,14) * ** |
70,3(65,72-74,9) * ** |
|
|
13,9(10,04-17,73) * ** |
15,6(14,26-16,87) * ** |
79,5(75,47-83,59) * ** |
||
|
Контрольная группа |
26,5 (24,20-28,84) |
8,14 (6,49-9,78) |
60,3(56,97-63,66) |
*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой
При оценке уровня экспрессии антиапоптотических маркеров (Bsl2) выявлено его увеличение на лимфоцитах детей всех групп, более выраженное у школьников с длительностью заболевания более 3-х лет, что также свидетельствует о нарушении Fas-зависимого апоптоза у детей с сахарным диабетом 1 типа, приводящего к замедлению процессов клеточной смерти аутореактивных форм лимфоцитов .
Полученные нами результаты могут быть косвенным признаком подавления программированной гибели активированных лимфоцитов в ткани поджелудочной железы, что способствует пролонгации иммунного ответа.
Уровень апоптотической готовности лимфоидных клеток зависит от длительности заболевания и уменьшается у детей со стажем СД1 более 3-х лет.
Ранее было показано, что при сахарном диабете выявляется резистентность лимфоцитов к апоптозу, что, возможно, объясняет характер и продолжительность аутоиммунного ответа .
В культуре лимфоцитов детей, больных сахарным диабетом, установлено увеличение процентной доли лимфоцитов, экспрессирующих CD95L, (табл. 1), по сравнению с группой здоровых детей. Наиболее высокие показатели определялись у детей 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет (табл. 1).
Известно, что при СД1 островки поджелудочной железы инфильтрированы иммунными клетками, продуцирующими широкий спектр цитокинов, что сопровождается аберрантной экспрессией мембранных рецепторов. Под влиянием повышенной концентрации глюкозы и цитокинов β-клетки начинают экспрессировать CD95 на своей поверхности, практически отсутствующий в норме .
Повышение экспрессии CD95L на лимфоидных клетках возможно обусловливает более выраженный апоптотический процесс в β-клетках поджелудочной железы и их последующее удаление.
В последние годы показано, что нейтрофильные гранулоциты принимают активное участие в формировании аутоиммунного воспаления. Реакция нейтрофилов, направленная на локализацию и элиминацию аутоантигенов во многом зависит от силы и длительности антигенного воздействия на иммунную систему, а также исходного уровня функциональной активности клеток.
Нами установлено, что течение сахарного диабета у детей сопровождается увеличением процента нейтрофилов, экспрессирующих маркеры апоптоза (CD95), и уменьшением доли клеток, имеющих на своей поверхности антиапоптотические белки Bsl2 (табл. 2).
Таблица 2
Показатели апоптоза нейтрофилов у детей с сахарным диабетом 1 типа
|
клинические группы |
||||
|
3-6 лет |
СД1 (I) (n=20) |
75,1(71,49-78,72) * ** |
9,5 (8,63- 10,32) * ** |
3,68 (3,46-3,90 * ** |
|
контрольная группа |
59,2 (56,31- 62,01) |
7,35 (6,58- 8,12) |
||
|
7-15 лет |
СД1, стаж заболева-ния менее 3-х лет (II) (n=12) |
77,6(71,15-83,99) * ** |
9,5(8,14-10,92) * ** |
3,99(2,9- 5,08) * ** |
|
СД1, стаж заболева-ния более 3-х лет (III) (n=13) |
87,9(84,24-91,63) * ** |
12,1(10,22-13,96) * ** |
2,78(2,36-3,19) * ** |
|
|
контрольная группа |
58,43(54,95- 1,90) |
*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой III (критерий Ньюмена - Кейлса, критерий Данна).
При сравнительной межгрупповой характеристике максимальные показатели CD95 (p<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.
Выявлено увеличение процента полиморфноядерных лейкоцитов, имеющих на своей поверхности CD95L. Наиболее высокие показатели отмечены у детей школьников со стажем заболевания более 3-х лет.
Результаты исследования апоптоза ПМЯЛ при сахарном диабете, представленные в литературных источниках, носят противоречивый характер. Существуют данные об увеличении скорости апоптоза нейтрофилов периферической крови при СД1 и СД2 .
Однако в ряде исследований установлено снижение апоптоза нейтрофильных гранулоцитов у больных с СД1 , особенно в условиях гипергликемии, что вероятно инициирует процессы хронического воспаления с повреждением тканей, а также предрасполагает к затяжным бактериальным инфекциям у больных сахарным диабетом 1 типа .
Полученные нами результаты позволяют считать, что у больных СД1 отмечается повышенная предрасположенность ПМЯЛ к апоптозу, что может быть проявлением защитной реакции, направленной на устранение «излишка» активных нейтрофилов, формирование которого усиливает повреждение тканей.
Увеличение апоптотического потенциала нейтрофильных гранулоцитов является отражением активного вовлечения ПМЯЛ в иммунопатогенез заболевания.
Повышение экспрессии CD95L на нейтрофильных гранулоцитах у больных сахарным диабетом, вероятно, может способствовать элиминации не только клеток поджелудочной железы, но и собственных лейкоцитарных клеток.
Таким образом, при оценке апоптоза иммунокомпетентных клеток у детей, больных сахарным диабетом 1 типа, установлено снижение готовности к программированной клеточной гибели лимфоцитов и увеличение - полиморфноядерных лейкоцитов.
Наиболее выраженные изменения регистрируются в возрастной группе 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет. У детей всех групп выявлено увеличение доли лейкоцитарных клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD95L.
Известно, что ПМЯЛ являются связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом и выполняют главенствующую роль в антибактериальной защите.
Повышение их апоптотической активности может становиться причиной низкой возрастной устойчивости ребенка, его подверженности инфекционным заболеваниям.
Снижение количества лимфоидных клеток, чувствительных к индукции апоптоза, является косвенным признаком подавления программированной клеточной гибели и нарушения элиминации активированных форм лимфоцитов.
Выводы
1. У детей, страдающих сахарным диабетом 1 типа, отмечается снижение готовности к апоптозу лимфоцитов периферической крови, повышение - нейтрофильных гранулоцитов, что сопровождается изменением экспрессии CD95 и Bsl2 и зависит от стажа заболевания.
2. Увеличение экспрессии CD95L на лимфоцитах и нейтрофильных гранулоцитах при СД1 может способствовать усилению процессов запрограммированной клеточной гибели в островковых β-клетках поджелудочной железы, инфильтрированных иммунокомпетентными клетками.
Рецензенты:
Щетинин Е.В., д.м.н., профессор, проректор по научной и инновационной работе СтГМУ, заведующий кафедрой ГБО ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г.Ставрополь.
Голубева М.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой детских инфекционных болезней ГБО ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г.Ставрополь.
Библиографическая ссылка
Барычева Л.Ю., Эрдни-Горяева Н.Э. МАРКЕРЫ АПОПТОЗА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 1 ТИПА У ДЕТЕЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 4.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=9953 (дата обращения: 18.07.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания» Деление клеток в целом представляет собой достаточно однообразный процесс, называемый клеточным циклом. В нем существует большое число «контрольных точек», в которых осуществляется управление переходом клетки от одной фазы цикла к другой. Разрушение одной или нескольких «контрольных точек» может привести как к неуправляемой пролиферации, так и к гибели клеток, в частности к апоптозу. Морфологическая картина апоптоза со всеми характерными признаками (хроматолизом, отсутствием воспалительной реакции, клеточным каннибализмом и т. д.) была описана L. Graper и названа «физиологической элиминацией клеток». В 1971 г. J. Kerr предложил термин «апоптоз» (от лат. аро - с, ptosis - падать) по аналогии с опадающими с дерева то здесь, то там листьями. В течении апоптоза выделяют три фазы - раннюю (уменьшение размеров клетки, фрагментация DNA на большие фрагменты), промежуточную (дальнейшая фрагментация DNA) и позднюю (апоптозные тельца). Апоптоз играет важную роль в развитии плаценты человека. С течением беременности отмечается нарастание апоптозных изменений в нормально функционирующей плаценте.
Tertemiz et al.
в своей работе показали, что апоптоз вовлечен в механизмы физиологической регуляции васкулогенеза плаценты. Вас-кулогенез плаценты начинается с 21-го дня беременности и включает в себя появление гемангиобластов и ангиогенных клеточных островков. Был изучен васкулогенез плаценты с использованием гистологического (препараты, окрашенные гематоксилином и эозином), иммуногистохимического (выявление CD31), молекулярно-генетического (CD31-TUNEL - TdT-mediated X-dUTP nick end labeling) методов и трансмиссионной электронной микроскопии. В исследовании показано, что в ангиогенных клеточных островках отсутствуют CD31-положительные клетки. Однако, в клетках примитивных капилляров и в ряде стромальных клеток, расположенных между васкулогенными областями, была выявлена экспрессия CD31. При морфологическом исследовании препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в этих клетках были выявлены признаки апоптоза - кариопикноз и апоптозные тельца. Степень выраженности апоптоза и васкулогенеза в плаценте была прямо пропорциональна.
Уровень апоптоза повышен при нарушениях беременности, таких как прерывание беременности на ранних сроках, эктопическая беременность, преэклампсия.
Пролиферация и дифференцировка цитотрофобласта и развитие сосудов в строме ворсин требуют адекватного обеспечения кислородом и питательными веществами, получаемыми из межворсинчатого пространства. Среди осложнений беременности задержка внутриутробного развития является одной из ведущих причин перинатальной смертности. Нарушение регуляции апоптоза приводит к снижению числа клеток синцитиотрофобласта, что влечет за собой уменьшение поступления питательных веществ к плоду и к задержке внутриутробного развития плода. Levy et al. связывают задержку внутриутробного развития с преэклампсией и табакокурением - состояниями, приводящими к кислородному голоданию ткани плаценты. В работе S. Y. Dai et al. были исследованы плаценты женщин без вредных привычек и гестоза, но у которых отмечалась задержка внутриутробного развития плодов. Авторы предположили, что апоптозные изменения клеток плаценты, находящихся в условиях кислородного голодания, могут регулироваться факторами, активирующимися в условиях гипоксии (hypoxia-inducible factor), - HIF-la, HIF-2a, HIF-1 p.
HIF-1 является основным фактором, обеспечивающим адаптацию клеток к гипоксии.
Он может изменять экспрессию ряда генов, ответственных за эритропоэз, гликолиз и ангиогенез. В то время как гетеродимер HIF-lp выявляется во всех клетках плаценты при любых условиях, HIF-la выявляется только при гипоксии. Реже в условиях кислородного голодания в клетках выявляется HIF-2a, также известный как EPAS-1. HIF-la и -2a mRNA выявляются в плаценте в течение всей беременности, но уровень их значительно варьирует в зависимости от срока беременности. Если уровень HIF-la mRNA остается постоянным, то уровень HIF-2a mRNA нарастает с течением беременности. В противоположность HIF-la HIF-2a в основном экспрессируется в клетках эндотелия, играя важную роль в ангиогенезе и гемопоэзе. В плаценте человека экспрессия HIF-la и HIF-2a максимально выражена на ранних сроках, что обеспечивает устойчивость клеток к физиологической гипоксии, имеющей место в этом периоде беременности. Кроме того, повышенная экспрессия этих факторов отмечена при преэклампсии.
Следствием стимулирующего влияния этих факторов на апоптоз является задержка внутриутробного развития плода.
Так, в исследовании S. Y. Dai et al. апоптозный индекс в синцитиотрофобласте ворсин составил 1,45+1,26% в группе с задержкой внутриутробного развития и 0,18±0,16 - в контрольной группе, где задержки внутриутробного развития плодов не отмечалось (р
В то же время макроскопически выявляемые инфаркты достоверно чаще отмечались в плацентах группы с задержкой внутриутробного развития (50%), чем в контрольной группе (22%). Степень отложения фибриноида в межворсинчатом пространстве также была незначительно выше в группе с задержкой внутриутробного развития. Митотическая активность элементов трофобласта и клеток крови и сосудов на сроках беременности 6 и 12-14 недель были изучены Challier et al. Авторы отметили при сроке беременности 6 недель наличие фигур митоза и присутствие Кд67-позитивных ядер в клетках цитотрофобласта и эритробластах. В цитотрофобласте ворсин число Ki67-позитивных ядер уменьшалось к 12-14 неделям беременности, сохраняясь лишь в клеточных островках экстравиллезного цитотрофобласта. В эритробластах к этому периоду Ki67 уже не выявляется. В эндотелиальных клетках в 6 недель беременности митотические фигуры и экспрессия Ki67 отсутствовали, в 12-14 недель беременности выявлялся лектин UEA1. Отсутствие на сроке беременности 6 недель митотических фигур и экспрессии Ki67 в клетках эндотелия и периваскулярных клетках указывает на прямую зависимость васкулогенеза от стромальных клеток, причем в большей степени, чем от трофобласта.
Контроль за клеточным циклом эукариотических клеток осуществляется семейством киназ, в частности циклин-зависимыми киназами. С первого триместра беременности в ядрах цитотрофобласта и эндотелии прилегающих к нему сосудов выявляется циклин D1, экспрессия которого прогрессивно нарастает к третьему триместру беременности. CDK4 выявляется в ядрах цитотрофобласта как в первом, так и в третьем триместре беременности, в то время как СОК4-позитивные клетки эндотелия отмечаются только в конце третьего триместра. Это позволяет предположить, что D1/CDK4 комплекс участвует в регуляции пролиферации клеток цитотрофобласта в течение всей беременности, а в контроле над ангиогенезом - в третьем триместре беременности. Нарушения эндокринного, иммунологического баланса, накопление свободных радикалов приводят к усилению апоптоза в тканях плаценты. Так, при преэклампсии нарушается дифференцировка цитотрофобласта и процесс его инвазии в матку, что во многом обусловлено апоптозом. Известно, что апоптоз значительно чаще встречается в зрелой плаценте при беременности, осложненной задержкой роста плода, причем в регуляции этого процесса главную роль играет белок р53, а протеин Вс1-2 в нем не участвует. Многочисленные исследования указывают на гиперэкспрессию р53, а следовательно, и на увеличение апоптозных клеток в цитотрофобласте при хорионкарциноме и пузырном заносе.
CAD (caspase activated DNase) на фрагменты размером, кратным 180-200 нуклеотидам . В результате апоптоза происходит образование апоптичних телец - мембранных везикул , содержащих целостные органеллы и фрагменты ядерного хроматина . Эти тельца поглощаются соседними клетками или макрофагами в результате фагоцитоза . Так как внеклеточный матрикс не поражается клеточными ферментами , даже при большом количестве апоптозных клеток, воспаление не наблюдается.
Процесс апоптоза является необходимым для физиологического регулирования количества клеток организма, для уничтожения старых клеток, для формирования лимфоцитов , которые не являются реактивными к своим антигенов (аутоантигенов), для осеннего опадения листьев растений , для цитотоксического действия Т-лимфоцитов киллеров, для эмбрионального развития организма (исчезновение кожных перепонок между пальцами у эмбрионов птиц) и других.
Нарушение нормального апоптоза клеток приводит к неконтролируемому размножению клетки и появления опухоли.
1. Значение апоптоза
Апоптоз - неотъемлемая часть жизнедеятельности большинства многоклеточных организмов. Особенно важную роль он играет в процессах развития. Например конечности четвероногих закладываются как лопатообразные вырасти, а формирование пальцев происходит благодаря гибели клеток между ними. Также подлежат апоптоза больше не нужны клетки, таким образом частности разрушается хвост у головастиков при метаморфозу. В нервной ткани позвоночных во время эмбрионального развития более половины нейронов погибают путем апоптоза сразу же после образования .
Также апоптоз является частью системы контроля за "качеством" клеток, он позволяет разрушать те из них, которые неправильно расположены, поврежденные, нефункциональные или потенциально опасные для организма. Примером могут служить и B-лимфоциты , которые погибают, если не несут полезных антиген -специфических рецепторов или несут автореактивни. Путем апоптоза также умирает большинство лимфоцитов аткивованих при инфекции после его преодоления .
У взрослых организмов одновременная регуляция пролиферации клеток и апоптоза позволяет поддерживать стали размеры целой особи и ее отдельных органов. Например, после вживавання препарата фенобарбитал , что стимулирует пролиферацию гепатоцитов, у крыс увеличивается печень . Однако, сразу же после прекращения действия этого вещества все лишние клетки подлежат апоптоза, в результате чего размер печени возвращается к нормальному .
Также апоптоз происходит, когда клетка "чувствует" большое количество внутренних повреждений, которые она не может репаруваты. Например, в случае повреждения ДНК клетка может трансформироваться в раковую, чтобы этого не произошло она, при нормальных условиях, "кончает жизнь самоубийством". Также погибает путем апоптоза большое количество клеток инфицированных вирусами .
2. Маркеры апоптических клеток
Маркеры апоптоза
Выявление фрагментации ДНК в апоптичних клетках методом TUNEL Препарат ткани печени мыши, ядро апоптичнои клетки имеет коричневую окраску, оптическая микроскопия.
Выявление фрагментации ДНК в апоптичних клетках с помощью электрофореза в агарозном геле. Слева: ДНК выделенной из апоптических клеток - видно "лесенку ДНК"; посередине: маркеры; дело: контрольный образец ДНК из необработанных клеток. Клеточная линия H4IIE (гепатома крыс), индуктором апоптоза - паракват, визуализация с помощью етидий бромида.
Сверху: выявление конденсации и фрагментации хроматина путем закрашивания флуоресцентным красителем (Hoechst 34580). Посередине: выявление транслокации фосфадидилсерину в наружный листок плазмалемме путем закрашивания аннексином V. Снизу: Микрофотография апоптических клеток в светлом поле. Клеточная линия - Jurkat, индуктор апоптоза - TRAIL, конфокальной и свитлопильна оптическая микроскопия .
Клетки, погибают путем апоптоза, можно распознать по ряду морфологических признаков. Они становятся меньше и более плотными (пикноз), округляются и теряют псевдоподии , в них разрушается цитоскелет , распадается ядерная мембрана , хроматин конденсируется и фрагментируется. На поверхности клеток появляется большое количество пузырьков, если клетки достаточно велики, то они распадаются на окружены мембранами фрагменты - апоптические тельца .
В апоптичних клетках кроме морфологических происходит также большое количество биохимических изменений. Частности ДНК разрезается специальными нуклеазами в линкерних участках между нуклеосомы на фрагменты равной длины. Поэтому при разделении всей ДНК апоптичнои клетки с помощью электрофореза можно наблюдать характерную "лесенку". Другой метод выявления фрагментации ДНК - метки ее свободных концов с помощью метода TUNEL ( T erminal deoxynucleotidyl transferase d U TP n ick e nd l abeling ) .
Изменения претерпевает также и плазматическая мембрана апоптичних клеток. При нормальных условиях отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин содержится только в ее внутреннем (возвращенном к цитозоля) слое, однако во время апоптоза он "перескакивает" в наружный листок. Эта молекула служит сигналом "съешь меня" для ближних фагоцитов . Фосфатидилсерин-индуцированное поглощение апоптических клеток, в отличие от других типов фагоцитоза, не приводит к выделению медиаторов воспаление . Описанная изменение плазмалемме лежит в основе еще одного метода выявления клеток, погибающих путем апоптоза - окрашивание анексином V, специфически связывается с фосфатидилсерина .
3. Каспаз - медиаторы апоптоза
Клеточные системы, которые обеспечивают прохождение апоптоза, аналогичные у всех животных, центральное место в них занимает семья белков каспаз. Каспаз - это протеазы , имеющие в активном центре остаток цистеина , и разрезают свои субстраты по специфическому остатка аспарагиновой кислоты (отсюда название: c от cysteine и asp от aspartic acid ). Каспазы синтезируются в клетке в виде неактивных прокаспаз, которые могут становиться субстратами для других, уже активированных каспаз, что режут их в одном или двух местах по остатку аспартата. Два образованы фрагменты - больший и меньший - соединяются между собой, формируя димер, что ассоциирует с таким же диммером. Сформированный таким образом тетрамер и является активной протеазой, что может разрезать белки-субстраты. Кроме участков, соответствующих большей и меньшей субъединиц, прокаспазы иногда также содержат ингибиторные продомены, которые деградируют после отщепления.
В результате расщепления и активации одних каспаз другими формируется протеалитичний каскад, который существенно усиливает сигнал и делает апоптоз с определенного момента необратимым процессом. Те прокаспазы, которые начинают этот каскад называются инициаторным, а их сусбтраты - эффекторными. После аткивации эффекторные каспазы могут расщеплять другие эффекторные прокаспазы или белки-мишени. До мишеней эффекторных каспаз, которые разрушаются во время апоптоза относятся в частности белки ядерной ламины, розщелення которых приводит к распаду этой структуры. Также деградирует белок, при нормальных условиях подавляет эндонуклеазы CAD, вследствие этого начинается фрагментация ДНК. Расщепляются каспаз и белки цитоскелета и межклеточной адгезии , вследствие чего апоптические клетки округляются и отсоединяются от соседних клеток, и таким образом становятся легче мишенью для фагоцитов .
Набор каспаз, необходимый для прохождения апоптоза зависит от типа ткани и пути, по которому активируется клеточная смерть. Например у мышей при "выключении" гена, кодирующие эффекторные каспазы-3, апоптоз не происходит в мозге, однако нормально протекающей в других тканях .
Гены прокаспаз активны в здоровых клетках, а следовательно белки необходимы для протекания апоптоза постоянно присутствующие, нужна лишь их активация для запуска клеточного суицида. В состав инициаторных прокаспаз входит длинный продомен, содержащий CARD ( caspase recruitment domain , Домен привлечения каспаз). CARD позволяет инициаторным прокаспазы присоединяться к адаптерных белков образуя активационные комплексы, когда клетка получает сигнал, что стимулирует апоптоз. В активационных комплексах несколько молекул прокаспаз оказываются непосредственно вблизи друг друга, чего достаточно для их перехода в активное состояние, после чего они разрезают друг друга .
Два лучше изучены сигнальные пути активации каскада каспаз в клетках млекопитающих называются внешний и внутренний (митохондриальный), каждый из них использует собственные инициаторным прокаспазы .
4. Пути активации апоптоза
4.1. Внешний путь
Клетка может получать сигнал, индуцирующего апоптоз, извне, например, от цитотоксических лимфоцитов. В таком случае активируется так называемый внешний путь ( extrinsic pathway ), Начинающийся с рецепторов смерти. Рецепторы смерти - это трансмембранные белки , принадлежащие к семейству рецепторов фактора некроза опухолей (ФНО), например сам рецептор ФНО и рецептор смерти Fas. Они формируют гомотримеры, в которых каждый мономер имеет внеклеточный лиганд-Связной домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен смерти, через адаптерные белки привлекает и активирует прокаспазы .
Лиганды рецепторов смерти также гомотримерамы. Они родственны между собой и принадлежат к семейству сигнальных молекул фактора некроза опухолей. Например, цитотоксические лимфоциты несут на своей поверхности лиганды Fas, которые могут присоединяться к рецепторам смерти Fas на плазмалемме клеток-мишеней. В таком случае внутриклеточные домены этих рецепторов соединяются с адаптерного белка ( FADD, Fas-associated death domain ), А те в свою очередь привлекают инициаторным прокаспазы 8 и / или 10. Вследствие этой серии событий формируется сигнальный комплекс, индуцирующего смерть, - DISC ( death inducing signaling complex ). После активации в этом комплексе инициаторным каспазы разрезают эффекторные прокаспазы и запускают апоптичнои каскад .
Многие клетки синтезируют молекулы, в определенной степени защищают их от активации внешнего пути апоптоза. Примером такой защиты может быть экспрессия так называемых рецепторов-приманок ( decoy receptors ), Имеющих внеклеточные домены связывания лигандов, однако не цитоплазматических доменов сметри, а следовательно не могут запускать апоптоза и конкурируют с обычными рецепторами смерти за лиганды. Клетки также могут продуцировать белки, блокирующие внешний путь апоптоза, например FLIP, похожий по структуре прокаспаз 8 и 10, однако не протеалитичнои активности. Он подавляет связывание инициаторных прокаспаз с комплексом DISC .
4.2. Внутренний путь
Апоптосома
Апоптоз также может запускаться изнутри клетки, например в случае ее травмирования, повреждения ДНК, недостатка кислорода , питательных веществ или внеклеточных сигналов выживания. У позвоночных этот сигнальный путь называется внутренним ( intrinsic pathway ) Или митохондриальной, ключевым событием в нем является высвобождение определенных молекул с межмембранном пространстве митохондрий. До таких молекул зокрема належить цитхром c, що за звичайних умов входить до електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, проте у цитоплазмі виконує іншу функцію - приєднується до адаптерного білка Apaf ( apoptotic protease actiuating factor-l ), Вызывая его олигомеризации в колесоподибну семичленну структуру, которая называется апоптосома. Апоптосома привлекает и активирует инициаторным прокаспазу-9, которая затем может активировать инициаторным прокаспазы .
В некоторых клетках внешний путь апоптоза должен активировать внутренний для того чтобы эффективно уничтожить клетку. Внутренний путь строго регулируется белками семьи Bcl-2 .
4.2.1. Регуляция внутреннего пути белками семьи Bcl-2
К семейству Bcl-2 относятся эволюционно консервативны белки, главной функцией которых является регуляция высвобождения цитохрома c и других молекул с мижмебранного пространства митохондрий. Среди них есть про-апоптические и анти-апоптические молекулы, которые могут взаимодействовать между собой в различных комбинациях, подавляя друг друга, баланс между их активностью и определять судьбу клетки .
Сейчас известно около 20 белков из этой семьи, все они содержат хотя бы один из четырех альфа-спиральных доменов гомологии Bcl2, называемых BH1-4 ( bcl2 homology ). Антиапоптични белки семьи Bcl2 содержат все четыре домены, к ним относятся сам Bcl-2, а также Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 и A1. Проапоптични белки делятся на две группы, члены первой из которых содержат три BH-домены (BH1-3), это в частности Bak, Bax и Bok (последний экспрессируется только в тканях репродуктивных органов). Наиболее многочисленной среди семьи Bcl-2 является вторая группа проапоптичних белков, которые содержат только домен BH3 (BH3-only), к ней относятся Bim, Bid, Bad, Bik / Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma .
При нормальных условиях (т.е. когда клетка не проходит апоптоза) антиапоптични белки, такие как Bcl-2 и Bcl-X L, связываются с проапоптичнимы белками BH123 (Bax и Bak) и не позволяют им полимеризоваться во внешней мембране митохондрий образуя поры. В результате действия определенного апоптичнои стимула в клетке активируются или начинают синтезироваться проапоптични белки, содержащие только домен BH3. Они в свою очередь ингибируют антиапоптични белки, снимая угнетающее действие на Bak и Bax, либо напрямую взаимодействуют с последними и способствуют их олигомеризации и образованию пор. Вследствие пермеабилизации наружной мембраны в цитозоль попадает цитохром c , а также другие медиаторы апоптоза, такие как AIF (англ. apoptosis inducing factor ).
Например, при недостатке сигналов выживания в клетке при посредничестве MAP-киназы JNK активируется экспрессия BH3 белка Bim, запускающий внутренний путь апоптоза. В случае повреждения ДНК происходит накопление супрессора опухолей p53 , который стимулирует транскрипцию генов, кодирующих BH3 белки Puma и Noxa, которые также обеспечивают прохождение апоптоза. Еще один BH3 белок - Bid обеспечивает связь между внешним и внутренним путями апоптоза. После активации рецепторов смерти и, как следствие, каспазы-8, последняя разрезает Bid с образованием усеченной формы tBid (truncated Bid), которая перемещается в митохонрий, где подавляет Bcl-2 .