Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.
1.) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.
Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.
Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке. Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).
2.) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.
Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям.
Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.
Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.
3.) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.
В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.
Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры:
ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией);
ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);
ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);
незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).
Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга.
Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.
Владельцы патента RU 2612018:
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может использоваться для автоматического подсчета количества ретикулоцитов на анализаторах мазков крови. Сущность изобретения: после первоначального суправитального окрашивания ретикулоцитов бриллиантовым крезиловым синим, мазки дополнительно фиксируют и окрашивают краской - фиксатором Май-Грюнвальда в течение 1 минуты, промывают проточной водой, высушивают и выполняют подсчет ретикулоцитов на автоматическом анализаторе мазков крови. Технический результат: повышение точности и ускорение подсчета ретикулоцитов. 2 ил., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может использоваться для автоматического подсчета количества ретикулоцитов на анализаторах мазков крови.
Количество и качественный состав ретикулоцитов являются одними из важных показателей, характеризующих эффективность кроветворения, а их подсчет широко используется при проведении массовых профилактических осмотров и регламентируется рядом приказов. Использование автоматических анализаторов мазков крови позволяет автоматизировать оценку клеточного состава мазка крови, окрашенного по Романовскому-Гимза. Однако подсчет ретикулоцитов в таких мазках невозможен, из-за того, что при окраске по Романовскому-Гимза ретикуло-филаментарная субстанция не выявляется.
Известен метод подсчета количества ретикулоцитов после суправитального окрашивания в специально подготовленном мазке крови [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делкторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.; Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, - 368 с.: ил., стр. 118-119]. Для этого кровь, забранную с антикоагулянтом (этилендиамидтетраацетатом, гепарином или цитратом натрия), смешивают с раствором красителя бриллиантового крезилового синего (бриллиант-крезил блау), смесь инкубируют в течение 30 минут и готовят тонкий мазок. Однако при использовании автоматических анализаторов мазков крови данный способ окраски ретикулоцитов дает неточные результаты подсчета ретикулоцитов. Это связано с тем, что при этом способе окраски эритроциты окрашиваются бледно, в различные оттенки желто-синего цветов, что затрудняет автоматическое распознавание клеток и идентификацию ретикулофиламентарной субстанции, которая также окрашивается в сине-зеленый цвет (фиг. 1).
Технический результат: повышение точности и ускорение подсчета ретикулоцитов.
Указанный результат достигается путем изменения в протоколе окраски и использования автоматических анализаторов мазков крови.
Способ пояснен на фотографиях, где на первой фотографии (фиг. 1) показан результат традиционной окраски ретикулоцитов (прототип); эритроциты окрашены в различные оттенки зеленовато-синего цветов, в двух заметна синяя ретикуло-филиментарная субстанция ретикулоцитов. На другой фотографии продемонстрирован результат использования заявляемого способа подготовки мазка крови: эритроциты окрашены в ярко-красный цвет на фоне которого, ретикуло-филаментарная субстанция ретикулоцитов окрашена в ярко синий цвет (фиг. 2).
Способ осуществляется следующим образом.
У обследуемого забирают кровь с антикоагулянтом, например калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты. Выполняют суправитальную окраску ретикулоцитов с помощью бриллиантового крезилового синего (бриллиант-крезил блау). К 0,1 мл цельной крови добавляют 0,4 мл раствора красителя и инкубируют 30 минут. Затем из полученной смеси готовят тонкий мазок. После высыхания мазка, его дополнительно фиксируют и докрашивают краской-фиксатором Май-Грюнвальда. Для этого высушенный мазок помещают на 1 минуту в контейнер с краской-фиксатором, затем извлекают из контейнера и промывают проточной водой. После высушивания препарат исследуют на анализаторах мазков крови, например, Vision Hema ® (FIRM MEDICA PRODUCT, Россия). Эритроциты окрашиваются в красный цвет, на фоне которого в ретикулоцитах четко видна синяя ретикуло-филаментарная субстанция (фиг. 2). Собирают и анализируют эритроциты, не менее 1000 штук. Подсчитывают количество эритроцитов, содержащих ретикуло-филаментарную субстанцию по отношению ко всем собранным эритроцитам. Результат выражают в процентах.
Для окраски мазков крови используют следующие растворы:
1) раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте. Для приготовления абсолютного спирта необходимо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного сульфата меди (до прекращения окрашивания порошка безводного сульфата меди в синий цвет). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски (Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под редакцией проф. А.И. Карпищенко. - Санкт-Петербург; Интермедика, 2002. - 408 с. С.284).
2) краска-фиксатор Май-Грюнвальда - 1 г сухой краски нужно растворить в 1 л метилового спирта. (Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под редакцией проф. А.И. Карпищенко. - Санкт-Петербург; Интермедика, 2002. - 408 с. С. 277).
Примеры конкретного выполнения:
Пример 1. Пациент И., 48 лет. Проходил периодический осмотр, как работник нефтеперерабатывающего предприятия. У пациента была забрана кровь с антикоагулянтом (калиевой солью этилендиаминуксусной кислоты) и подготовлены 2 мазка. Ретикулоциты в одном мазке окрашивали традиционным методом, только с использованием бриллиантового крезилового синего. Ретикулоциты во втором мазке окрашивали по предложенному способу. Для этого 0,1 мл крови смешивали с раствором бриллиантового крезилового синего и инкубировали 30 минут. Затем делали тонкий мазок крови. После высыхания мазок крови дополнительно фиксировали и окрашивали, погружая его в краску-фиксатор Май-Грюнвальда. В мазках определяли количество ретикулоцитов на анализаторе мазков крови Vision Hema ® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Россия) и ручным методом под световым микроскопом (Meiji, Япония).
Количество ретикулоцитов, подсчитанных на анализаторе мазков крови при традиционной окраске составило 1,5%, что превысило референсный диапазон нормы, а в мазке, окрашенном предложенным способом, составило - 0,9%, что соответствует нормальным значениям для взрослого человека. При ручном подсчете ретикулоцитов их количество в этих же мазках составило 0,8% и 0,9%, соответственно. Это указывает на повышение точности подсчета на анализаторах мазков крови при использовании предложенного способа подготовки мазков. При этом скорость исследования ретикулоцитов на анализаторе мазков крови составила 48 и 54 секунды, в то время как на ручной подсчет ретикулоцитов затрачивалось 270 и 238 секунд.
Таким образом, данный пример демонстрирует, что предложенная окраска ретикулоцитов при использовании анализаторов мазков крови ведет к увеличению точности результатов и ускорению подсчета ретикулоцитов.
Пример 2. Пациентка З. Госпитализирована в гематологическое отделение КМСЧ 1 г. Перми с диагнозом апластическая анемия. В рамках протокола обследования выполнен подсчет ретикулоцитов. У пациентки был выполнен забор крови с антикоагулянтом (калиевой солью этилендиаминуксусной кислоты) и подготовлены 2 мазка. Ретикулоциты в одном мазке окрашивали традиционным методом, только с использованием бриллиантового крезилового синего. Ретикулоциты во втором мазке окрашивали по предложенному способу. Для этого 0,1 мл крови смешивали с раствором бриллиантового крезилового синего и инкубировали 30 минут. Затем делали тонкий мазок крови. После высыхания мазок крови дополнительно фиксировали и окрашивали, погружая его в краску-фиксатор Май-Грюнвальда. В мазках определяли количество ретикулоцитов на анализаторе мазков крови Vision Hema ® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Россия) и ручным методом под световым микроскопом (Meiji, Япония).
Количество ретикулоцитов, подсчитанное на анализаторе мазков крови в мазке, окрашенном традиционно, составило 0,3%, в мазке, окрашенном модифицированным способом - 0,2%. При ручном подсчете результат 0,2% и 0,2%. При этом скорость подсчета ретикулоцитов на анализаторе мазков крови составила 58 и 52 секунды, в то время как на ручной подсчет ретикулоцитов затрачивалось 302 и 338 секунд.
В данном случае из-за низкого содержания ретикулоцитов существенных различий в результатах не обнаружено, однако, обращает внимание несколько завышенный результат, полученный на анализаторе мазков крови при исследовании мазка окрашенного обычным способом. Так же, как в предшествующем примере, продемонстрировано значительное (почти в 5 раза ускорение подсчета ретикулоцитов).
Пример 3. Пациент К. Госпитализирована в отделение патологии новорожденных ДГКБ №13 г. Перми с диагнозом гемолитическая болезнь новорожденных. В рамках протокола обследования выполнен подсчет OAK с подсчетом ретикулоцитов. У пациента была выполнен забор крови с антикоагулянтом (калиевой солью этилендиаминуксусной кислоты) и подготовлены 2 мазка. Ретикулоциты в одном мазке окрашивали традиционным методом, только с использованием бриллиантового крезилового синего. Ретикулоциты во втором мазке окрашивали предложенным способом. Для этого 0,1 мл крови, смешивали с раствором бриллиантовым крезиловым синим и инкубировали 30 минут. Затем делали тонкий мазок крови. После высыхания мазок крови дополнительно фиксировали и окрашивали, погружая его в краску-фиксатор Май-Грюнвальда. В мазках определяли количество ретикулоцитов на анализаторе мазков крови Vision Hema ® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Россия) и ручным методом под световым микроскопом (Meiji, Япония).
Количество ретикулоцитов, подсчитанное на анализаторе мазков крови в мазке, окрашенном традиционно, составило 30,3%, в мазке, окрашенном модифицированным способом, - 21,2%. При ручном подсчете результат 20,6% и 22,4%. При этом скорость подсчета ретикулоцитов на анализаторе мазков крови составила 52 и 51 секунды, в то время как на ручной подсчет ретикулоцитов затрачивалось 298 и 304 секунд.
На данном примере продемонстрировано снижение точности подсчета ретикулоцитов на анализаторах мазков крови в стеклопрепаратах, окрашенных традиционным методом, особенно при высоком содержании ретикулоцитов. Использование нового способа окраски мазков привело к практически полному совпадению результатов подсчета ретикулоцитов на автоматическом анализаторе и ручным способом, при этом скорость подсчета ретикулоцитов увеличилась более чем в 5 раз.
Способ подготовки мазков крови для подсчета ретикулоцитов путем суправитального окрашивания ретикулоцитов бриллиантовым крезиловым синим, отличающийся тем, что после окрашивания бриллиантовым крезиловым синим мазки дополнительно фиксируют и окрашивают краской - фиксатором Май-Грюнвальда в течение 1 минуты, промывают проточной водой, высушивают и выполняют подсчет ретикулоцитов на автоматическом анализаторе мазков крови.
Похожие патенты:
Изобретение относится к диагностике, а именно к способу прогнозирования развития гнойных осложнений панкреонекроза. Способ прогнозирования развития гнойных осложнений панкреонекроза заключается в том, что у пациента со стерильным панкреонекрозом, начиная с пятых суток от начала заболевания, определяют активность альфа-амилазы в крови, содержание в крови общего белка, лимфоцитов, моноцитов, отношение альбуминов и глобулинов в сыворотке крови, тяжесть состояния пациента по следующим шкалам SAPS, SOFA, SIRS, наличие парапанкреатического инфильтрата, пареза желудочно-кишечного тракта, острого скопления жидкости в сальниковой сумке или забрюшинной клетчатке и вычисляют индекс инфицирования панкреонекроза (ИИПН) по формуле.
Группа изобретений относится к определению концентрации аналита в биологической жидкости на основании полученных зависимостей величины тока от времени. Способ определения концентрации аналита в физиологической жидкости включает размещение реактива для взаимодействия с аналитом в физиологической жидкости между первым электродом и вторым электродом, нанесение физиологической жидкости на реактив, трансформацию аналита в физиологической жидкости и возбуждение нестационарного тока от каждого из первого и второго электродов, определение пика нестационарного тока для каждого из первого и второго электродов, измерение значения нестационарного тока при заданном временном смещении от пика каждого нестационарного тока от каждого из первого и второго электродов, при этом временное смещение для первого электрода содержит первое смещение по времени от пика нестационарного тока первого электрода, а временное смещение от пика нестационарного тока второго электрода содержит второе смещение по времени, отличное от первого смещения по времени, и вычисление концентрации аналита на основе измеренных значений тока первого и второго электродов на этапе измерения.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ определения болевого синдрома при полинейропатии у больных вибрационной болезнью, включающий забор венозной крови, получение сыворотки крови и определение в ней количественного содержания серотонина.
Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и касается способа выбора длительности терапии Церулоплазмином у пациентов с бронхиальной астмой. Сущность способа заключается в том, что у пациентов с бронхиальной астмой определяют в крови супкроксиддисмутазу (СОД) и малоновый альдегид (МА) и их соотношения МДА/СОД после лечения Церулоплазмином в дозе 100 мг внутривенно 1 раз в сутки в течение 7 дней.
Изобретение относится к ихтиологии и рыбоводству и представляет собой способ тестирования физиологического состояния осетровых рыб, включающий исследование сыворотки крови рыб, отличающийся тем, что сыворотку крови исследуют методом краевой дегидратаци в аналитических ячейках и производят морфологический анализ образовавшихся структур в режиме обычной микроскопии при различных увеличениях, при этом дендритные и переходные формы являются показателями нормы гомеостаза, а наличие пластинчатых структур указывает на изменения, происходящие в организме рыб.
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике. Через 3-4 недели после трансплантации печени в плазме крови у детей измеряют концентрацию трансформирующего фактора роста бета 1 (TGF-β1) в нг/мл.
Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики степени тяжести атаки у пациентов с болезнью Крона. Сущность способа заключается в том, что определяют скорость оседания эритроцитов (СОЭ), концентрацию С-реактивного белка (СРБ), уровень васкулоэндотелиального фактора (ВЭФ) в сыворотке, рассчитывают количество десквамированных эндотелиоцитов (ДЭЦ) в плазме крови, оценивают концентрацию микроальбумина (МАУ) в моче.
Изобретение относится к запорной арматуре, применяющейся для газообразных сред, и может быть использовано, в частности, в пробоотборных емкостях. Клапан газоплотный содержит основание 1, корпус 2, по меньшей мере четыре уплотнительных кольца 5, 6, 7 и 8 из полимерного упругого материала и шпиндель 3 с золотником 3а.
Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями
Принцип метода:Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.
Можно использовать один из следующих красителей: Раствор азура I;Раствор азура II;
Ход определения: Окраску проводят либо на стекле, либо в пробирке.
Окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II
В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут. Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.
Окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I
В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.
Приготовленные мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).
Ретикулоциты являются важным показателем регенераторной способности костного мозга. Увеличение их в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается при гемолитических анемиях, при гемолитических кризах, при острых кровопотерях, малярии, при лечении железом железодефицитных анемий, при остром недостатке кислорода. Наличие повышенного количества ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных брюшным тифом, язвенной болезнью).
Снижение количества или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается при арегенераторных апластических и гипопластических анемиях; анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты; при метастазах рака в кость; лучевой болезни; лучевой терапии; лечении цитостатиками.
Техника проведения пробы Ривальта.
Про́ба Рива́льта - биохимический тест для дифференцировании транссудата и экссудата.
Методика заключается в следующем: Экссудаты содержат серомуцин (соединение глобулиновой природы), дающий положительную пробу (денатурацию) со слабым раствором уксусной кислоты. В цилиндр наливают 100-150 мл дистиллированной воды, подкисляют 2-3 каплями ледяной уксусной кислоты и добавляют по каплям исследуемую жидкость. Падающая капля экссудата образует помутнение в виде белого облачка, опускающегося до дна сосуда. Капля транссудата не образует помутнения, или оно бывает незначительным и быстро растворяется. Несмотря на указанные различия экссудатов и транссудатов, разграничить их на практике не всегда легко, так как иногда приходится иметь дело с рядом переходных жидкостей, а также экссудатами, которые по содержанию белка и относительной плотности стоят близко к транссудатам.
Ретикулоциты - это молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер.
Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие зернисто-сетчатой субстанции, которая проявляется при суправитальной окраске, т. е. без предварительной фиксации клеток.
Электронно-микроскопически показано , что зернисто-сетчатые структуры представляют собой остатки эндоплазматической сети, рибосом и митохондрий, содержащие РНК. В ретикулоцитах в незначительной степени осуществляется синтез белка (глобина), гема, пуринов, пиримидиннуклеотидов, фосфатидов, липидов, однако РНК в них не синтезируется. В течение 2 дней ретикулоцит остается в кровеносном русле, после чего по мере уменьшения РНК становится зрелым эритроцитом.
В мазках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цвета - полихроматофильны, т.е. окрашены разными красителями.
Методы подсчета ретикулоцитов
В настоящее время используется унифицированный метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их
- бриллиантовым крезиловым синим,
- азуром I или
- азуром II непосредственно на стекле или в пробирке.
1. Принцип метода
Выявление зернисто-сетчатой субстанции эритроцитов при окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.
2. Реактивы:
а) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96% в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса): 1,2 г краски на 100 мл спирта;
б) раствор азура I : азур I - 1 г, аммония оксалат - 0,4 г, натрия хлорид - 0,8 г, этиловый спирт 96% - 10 мл, дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2–3 дня в тер- мостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать;
в) раствор азура II : азур II - 1 г, натрия цитрат - 5 г, натрия хлорид - 0,4 г, дистиллированная вода - 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15–20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.
3. Окраска
Окраска на стекле:
- хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте;
- на приготовленные подобным образом стекла наносят каплю крови, делают тонкий мазок и сейчас же помещают стекло во влажную камеру. Для этого используют чашку Петри с крышкой, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты;
- во влажной камере мазки выдерживают 3–5 мин, а затем высушивают на воздухе. Зернисто-сетчатая субстанция ретикулоцитов окрашивается в фиолетово-синий цвет, четко выделяясь на зеленовато-голубоватом фоне эритроцитов.
Окраска в пробирке:
- метод 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краску добавляют 40 мкл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки;
- метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20– 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки;
- метод 3: в пробирку помещают 0,3–0,5 мл раствора краски 2 и 5–6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1–1½ ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1½ ч –3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.
4. Подсчет ретикулоцитов
В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в синий или синевато-фиолетовый цвет.
- Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом;
- необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения;
- практически для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр ×7, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.
Количественное содержание ретикулоцитов
НОРМА: 0,5–1,2 % (30–70 × 10 9 /л)
Повышение количества ретикулоцитов наблюдается при:
- кровопотерях (особенно острой);
- гемолитических анемиях, особенно в период криза (до 20–30 %);
- на фоне лечения мегалобластной анемии витамином В12 (ретику- лоцитарный криз - подъем числа ретикулоцитов на 4–8-й день лечения).
Понижение количества ретикулоцитов характерно для:
- апластических и гипопластических анемий;
- нелеченной мегалобластной анемии;
- лучевой болезни;
- приема цитостатических препаратов.
Ретикулоциты - показатель количества клеток, предшественников эритроцитов, образующихся в костном мозге. Ретикулоциты - молодые эритроциты отражают регенеративную способность костного мозга. Подсчет ретикулоцитов используют для оценки интенсивности кроветворения. Исследование проводят при: уменьшении количества эритроцитов, подозрении на гемолиз, оценке эритропоэза, при лечении анемий препаратами железа и витамином В 12 , эритропоэтином.
Ретикулоциты - это безъядерные, незрелые эритроциты, созревание которых происходит в течение 24-48 ч после выхода в периферическую кровь из костного мозга. Количество образовавшихся ретикулоцитов отражает эритропоэтическую активность костного мозга. Иными словами, содержание ретикулоцитов отражает скорость образования эритроцитов и служит показателем ответа костного мозга на анемизацию.
Помимо общепринятых параметров ретикулоцитов - абсолютного и относительного (%) содержание ретикулоцитов, появление новых гематологических анализаторов (окраска специальными красителями для нуклеиновых кислот) дало возможность получать дополнительные ретикулоцитарные параметры:
Ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией);
ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);
ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);
незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).
Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга.