☰

Основы пцр. Полимеразная цепная реакция. применение ПЦР в практике службы крови

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Метод полимеразной цепной реакции был открыт почти тридцать лет назад американским учёным по имени Кэрри Мюллис . Методика широко распространена в медицине в качестве диагностического инструмента, и суть её состоит в копировании участка ДНК при помощи специального фермента (полимеразы ) искусственным путём в пробирке.

В каких областях медицины применяется этот метод?

Для чего выполняется копирование ДНК и как это может послужить медицине?
Данная методика позволяет:
  • Выделять и клонировать гены.
  • Диагностировать генетические и инфекционные заболевания.
  • Определять отцовство. Ребенок частично наследует от своих биологических родителей генетические особенности, однако имеет при этом свою собственную уникальную генетическую идентификацию. Наличие у него некоторых генов, идентичных родительским генам – позволяет говорить об установлении родства.
Полимеразная цепная реакция применяется также в криминалистической практике.

На месте преступления судмедэксперты собирают образцы генетических материалов. К ним относятся: волосы, слюна, кровь. Впоследствии, благодаря методике полимеразной реакции, можно амплифицировать ДНК и сравнить идентичность взятой пробы с генетическим материалом подозреваемого человека.

В медицине эффективно используется полимеразная цепная реакция:

  • В пульмонологической практике – для дифференциации бактериальных и вирусных видов пневмонии , туберкулёза .
  • В гинекологической и урологической практике – для определения уреаплазмоза , хламидиоза , микоплазменной инфекции , гарднереллеза , герпеса , гонореи .
  • В гастроэнтерологической практике.
  • В гематологии – для определения онковирусов и цитомегаловирусной инфекции .
  • В экспресс-диагностике таких инфекционных заболеваний как вирусные гепатиты , дифтерия , сальмонеллёз .


В настоящее время наиболее распространен данный метод в диагностике инфекционных болезней (гепатитов вирусной этиологии, ВИЧ , венерических заболеваний , туберкулёза, клещевого энцефалита ).

Что происходит во время протекания реакции?


Сама реакция является химически несложной. Источником ДНК для реакции может послужить капля крови, волос, кусочек кожи, и т.д. В теории, для проведения реакции требуются нужные реагенты, пробирка, проба из биологического материала и источник тепла.

Полимеразная реакция позволяет выявить инфекцию, даже если в пробе с биологическим материалом находится всего одна или несколько ДНК-молекул возбудителя.

Во время протекания реакции, благодаря ферменту ДНК-полимеразы, происходит удвоение (репликация ) участка ДНК. Сама же дезоксирибонуклеиновая кислота (сокращенно ДНК ) важна для нас тем, что обеспечивает хранение и передачу дочерним клеткам генетической информации. ДНК имеет вид спирали, которая состоит из повторяющихся блоков. Эти блоки составляют нуклеотиды, которые являются наименьшей частицей ДНК. Нуклеотиды образуются из аминокислот.

Процесс репликации участков ДНК происходит во время повторяющихся циклов. В каждый такой цикл копируется и удваивается не только исходный фрагмент ДНК, но и те фрагменты, которые уже удвоились в прошлый цикл амплификации. Все это напоминает процесс геометрической прогрессии.

Существует:

  • Естественная амплификация (то есть процесс копирования и размножения ДНК ), которая происходит в нашем организме и является детерминированным, предопределённым процессом.
  • Искусственная амплификация, которая происходит благодаря полимеразной цепной реакции. В этом случае процесс копирования является управляемым и позволяет удвоить даже короткие участки нуклеиновой кислоты.
После завершения каждого цикла копирования, количество фрагментов нуклеиновой кислоты возрастает в геометрической прогрессии. Именно поэтому сам процесс называют «цепной реакцией».

Спустя тридцать - сорок циклов число фрагментов достигает нескольких миллиардов.

Для амплификации in vitro (в пробирке ) необходимо, чтобы в биосреде, взятой для диагностики, присутствовал специфический чужеродный фрагмент ДНК (то есть ДНК не пациента, а возбудителя ). Если в созданном растворе не будет находиться специфический фрагмент – цепная реакция под действием полимеразы не пойдет. Этим и объясняется факт высокой специфичности ПЦР.

Этапы ПЦР-диагностики

1. Из исследуемого материала выделяют ДНК.
2. Добавляют ДНК в специальный раствор из нуклеотидов.
3. Нагревают раствор до температуры 90 - 95 градусов Цельсия, для того, чтобы белок ДНК свернулся.
4. Снижают температуру до 60 градусов.
5. При повторении циклов повышения-понижения температуры количество участков нуклеиновой кислоты возрастает.

6. Путём проведения электрофореза подводится итог, и подсчитываются результаты удвоения.

Какие преимущества имеет данная диагностика?


  • Универсальность: для этого метода подходят любые образцы нуклеиновой кислоты.
  • Высокая специфичность: возбудитель имеет уникальные последовательности цепочек ДНК, которые свойственны именно ему. Поэтому результаты проведённой ПЦР будут достоверными, в них невозможно спутать ген одного возбудителя с геном другого возбудителя.
  • Чувствительность к наличию даже единичной молекулы возбудителя.

  • Маленький объем материала, нужного для исследования. Подойдет даже капля крови. Возможность получить результат, использовав минимальный объём пробы, очень важна для педиатрических, неонатологических, неврологических исследований, а также в практике судебной медицины.
  • Возможность определения вялотекущей, хронической инфекции, а не только острой.
  • Многие болезнетворные культуры очень сложно культивировать в пробирке другими методиками, а полимеразная реакция позволяет размножить культуру в нужном количестве.

Какие недостатки имеет данная диагностика?

  • Если в материале, предназначенном для проведения ПЦР, находится ДНК не только живого возбудителя, но и погибшего – будет происходить амплификация обеих ДНК. Соответственно, лечение после диагностики может быть назначено не совсем верное. Через некоторое время лучше пройти контроль эффективности проведённого лечения.
  • Повышенная чувствительность к наличию микроорганизмов тоже может считаться, в некотором роде, недостатком. Ведь в норме в человеческом организме присутствует условно-патогенная микрофлора, то есть это микроорганизмы, которые живут в кишечнике , желудке , других внутренних органах. Эти микроорганизмы могут принести вред человеку только при определенных неблагоприятных условиях – несоблюдение гигиенических требований, загрязненная питьевая вода и т.д. ПЦР-методика амплифицирует ДНК даже этих микроорганизмов, хотя они и не приводят к патологии.
  • ПЦР разных тест-систем может показывать результаты, которые будут разниться между собой. Существует много модификаций данной методики: «вложенная », «ассиметричная », «инвертированная », «количественная » ПЦР и другие.

В конце статьи см.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
  • два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
  • термостабильная ДНК-полимераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
  • ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
  • буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе - приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.
Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией - разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии - 0,5 - 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это - стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках - долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.


РНК– рибонуклеиновая кислота - биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев - нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.


Нуклеоти́ды - основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) - гуанин, цитозиновый (C) - цитозин, тиминовый (Т) - тимин, урациловый (U) - урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов - A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа - A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК - рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.


Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.


Литература
  1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с., илл. ISBN 5-03-003328-9
  2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. - 496 с.; илл. ISBN 5-94087-098-8
  3. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы - М.: Наука, 2005 - В 2 т. - ISBN 5-02-033278-X

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR - polymerase chain reaction) - метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.

Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro . Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация». Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).

Основные принципы

Итак, ПЦР - это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают "праймеры" (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:

  1. денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) - 95°С - 1 или 2 минуты;
  2. отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) - 60°С (к примеру) - 1 минута;
  3. элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) - 72°С - 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).

Приборная база для применения метода полимеразной цепной реакции в лаборатории должна состоять из:

  1. (или, как его еще называют, термоциклера);
  2. системы для с (для визуализации результатов ПЦР);
  3. системы (для анализа результатов ПЦР);
  4. (для пробоподготовки);
  5. набора (механических или электронных).

Помимо основного и вспомогательного оборудования для полноценного функционирования ПЦР-лаборатории, необходимы некоторые расходные материалы: стерильные наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов.

Реагентная база в обычной ПЦР-лаборатории для проведения полноценной полимеразной цепной реакции включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером, праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК, комплементарные началу и концу анализируемого участка ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также абсолютно необходима очищенная вода.

Достоинства метода ПЦР

Высокая чувствительность исследования

Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 10 5 клеток.

Специфичность анализа

ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Специфически подбирая компоненты реакции (праймеры), Вы можете одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Универсальность метода ПЦР

Дело в том, что для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний, либо наследственных заболеваний человека можно использовать одно и то же оборудование, следовать универсальным процедурам подготовки образцов (проб) и постановки анализа, а также однотипные наборы реактивов.

Экономия времени

Важное преимущество ПЦР - отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован. Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов.

Эффективность метода ПЦР

Широта исследуемого клинического материала

В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое.

Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода - высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы - позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях.

Применение ПЦР

Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать (практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования), а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР:

клиническая медицина

  • диагностика инфекционных заболеваний
  • диагностика наследственных заболеваний
  • выявление мутаций
  • генотипирование
  • клеточные технологии
  • создание генетических паспортов

экология

  • мониторинг состояния окружающей среды
  • анализ продуктов питания
  • анализ генетически-модифицированных организмов (ГМО)

судебная медицина и криминалистика

  • идентификация личности
  • установление отцовства

фармакология

ветеринария

научные исследования (молекулярная биология, генетика)

Организация лаборатории ПЦР

Информация для заказа
Наименование Объем Производство Метод Кат.Номер

Содержание

Тем, кто интересуется новыми способами диагностики, следует узнать, что такое метод ПЦР. Современные технические возможности в области лабораторных исследований предоставляют возможность выявлять множество заболеваний на начальных стадиях. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) считается на данный момент самым точным и новым методом.

Анализ методом ПЦР

ПЦР анализ - что это такое? Это метод использует принципы молекулярной биологии. Для исследования материала применяются особые ферменты, которые многократно и быстро копируют ДНК, РНК фрагменты возбудителей болезни. Существует разные виды ПЦР анализа в зависимости от исследуемого материала (кровь, моча, кал и т.д.). После обработки сотрудники лаборатории сравнивают с базой данных полученный результат, выявляют концентрацию, тип возбудителя.

Анализ на ПЦР помещают в специальный амплификатор (прибор), который нагревает и охлаждает пробирки с биоматериалом. Изменения температуры нужны для репликации фрагментов. Точность результата будет зависеть от точности температурного режима. Метод полимеразной цепной реакции помогает выявить:

  • инфекционный мононуклеоз;
  • цитомегаловирусную инфекцию;
  • вирусные гепатиты G, C, B, A;
  • инфекции/заболевания, передающиеся половым путем (ИППП/ЗППП): гарднереллез, трихомониаз, уреаплазмоз;
  • герпетическую инфекцию;
  • онкогенные вирусы;
  • листериоз;
  • хеликобактерную инфекцию;
  • клещевой энцефалит, боррелиоз;
  • туберкулез;
  • кандидоз.

Крови

На данный момент из-за новизны технологии анализ крови методом ПЦР все еще имеет высокую цену. Для подготовки биоматериала не нужно соблюдать определенные требования. Даже вызванные физическими нагрузками, стрессами, сменой рациона питания изменения состава не влияют на результат исследования. ПЦР анализ крови может испортить только прием антибактериальных средств, поэтому перед сдачей необходимо выдержать паузу между лечением и тестом.

ПЦР исследование крови – самый распространенный вариант диагностики хронических, острых инфекционных патологий при вирусном или атипичном проявлении. Серологические методы исследования имеют определенную трудность при проведении – определение наличия возбудителя проводится по наличию антител в организме человека. Результат мог быть ложноотрицательным, если состояние больного не давало время для их выработки.

Мазка

В сфере гинекологии для исследования наличия инфекционных микроорганизмов используют ПЦР анализ мазка. Работа с материалом проводится по тому же принципу, что и с кровью: многократное увеличение фрагментов ДНК возбудителя, чтобы с легкостью его идентифицировать. Это же помогает обнаружить скрытые инфекции у женщины. Для проведения анализа могут быть взяты разные биологические жидкости: слюна, мокрота, моча, кровь. В гинекологии для точности определения чаще используется мазок со слизистой влагалища из цервикального канала.

Для проведения ПЦР существуют определенные показания. Нередко его нужно сделать, чтобы выявить устойчивый к антибиотикам вид возбудителя. У женщин основными показаниями для диагностики по этому методу выступают:

  • беременность, которая протекает тяжело;
  • острая фаза ИППП;
  • если есть подозрение на переход ИППП в хроническую стадию;
  • поиск причин бесплодия.

Кала­

Для выявления инфекции может быть назначен со стороны врача анализ кала на ПЦР. Для того, чтобы получить максимально достоверные результаты после теста, необходимо придерживаться следующих правил перед забором биоматериала:

  • за несколько суток прекратить прием слабительных препаратов: масла, свечи;
  • исключить медикаменты, которые дают специфическую окраску калу, к примеру, с содержанием железа.

Мочи

При необходимости для проведения теста врач может взять для исследования мочу. Высокая точность открывает возможность работать с любой биологической жидкостью, из которой удается извлечь ДНК вируса. Чтобы сдать анализ мочи ПЦР, нужно придерживаться таких ограничений перед забором материала:

  • минимум за 1 день до процедуры прекратить половые контакты;
  • за 3 недели до сдачи должно быть окончено любое антибактериальное лечение, потому что медикаменты смажут картину;
  • сдавать анализ нужно натощак (жидкость тоже запрещена);
  • брать нужно первую утреннюю порцию материала.

Результаты анализов ПЦР

Из вышенаписанного понятно, что такое ПЦР анализ и видны явные преимущества такого метода исследования. Еще один плюс данной диагностической процедуры – простота расшифровки результатов. Учитывая, сколько делается анализ ПЦР (сам процесс занимает около 5 часов, но лаборатория выдает данные через 1-2 суток), данный метод диагностики становится лучшим вариантом для определения множества инфекций. По результатам врач может сказать вам, что тест:

  1. Отрицательный – в исследуемом материале не было искомого возбудителя.
  2. Положительный – были найдены РНК, ДНК возбудителя.

Иногда проводится количественное определение микроорганизмов. Это необходимо при заболеваниях, которые вызывают условно-патогенные возбудители. Особенность этих вирусов в том, что проявляются они только при избыточном количестве и найти их обычными исследованиями крайне проблематично. Этот фактор важен для выбора терапевтической тактики, чтобы эффективно лечить вирусные инфекции, к примеру, гепатит, ВИЧ.

На 12 инфекций

Чтобы понять до конца, что такое ПЦР диагностика инфекций и насколько она эффективна, нужно узнать, что она способна выделять до 12 возбудителей. Проводится текст только в лабораторных условиях. Для исследования применяют специальные ферменты, которые увеличивают во много раз количество РНК, ДНК фрагментов вируса. Анализ ПЦР на 12 инфекций способен выявить:

  • микобактерии туберкулеза;
  • цитомегаловирус;
  • гепатит C, G, B, A;
  • герпес 1, 2 типа;
  • вирус Эпштейн-Барра (инфекционный мононуклеоз);
  • инфекции, которые передаются половы путем, к примеру, хламидии;
  • листериоз;
  • кандидозную инфекцию;
  • хеликобактер пилори;
  • боррелиоз, клещевой энцефалит.

На гепатит С

Этот диагностический метод помогает определить наличие вируса в крови. Это дает врачам возможность говорить о его наличии или отсутствии. Анализ ПЦР на гепатит С бывает двух видов: качественный и количественный. Первый вариант указывает только на его наличие и может иметь формулировку «обнаружен»/«не обнаружен». Этот вид теста имеет чувствительно в 10-500 МЕ/мл. Это говорит о том, что при низком содержании возбудителя в организме анализ будет «не обнаружено».

Количественный анализ более точный и покажет концентрацию инфекции в крови. Обозначается этот показатель как «вирусная нагрузка», измеряется в количестве вирусной РНК на конкретный объем крови. Расшифровка в разных лабораториях может отличаться. Помимо измерения в МЕ/мл используются единицы измерения «копии». Пересчитать копии на МЕ можно по формуле: 1 МЕ = 4 копии. Если в расшифровке значение присутствие вируса превышает 800 000 МЕ/мл (или 800*103), это говорит о высоком содержании возбудителя.

На туберкулез

Делать тест следует в утреннее время. Это важно для того, чтобы не дать всему массиву мокроты, который образовался за ночь, выйти из желудка. Анализ ПЦР на туберкулез так же важен как ИФА, Манту, томографе. Тест помогает выделить наличие микобактерий, состояние мочи, общий иммуноглобулин, СОЭ, определить состояние легких на данный момент. Для точности получения результатов при анализе ПЦР необходимо проводить его с соблюдением следующих правил:

  1. Осуществляется посев 3 раза, но полную аспирацию содержимого желудка следует проводить только в условиях стационара.
  2. Выявляет микобактерии посев наличествующих масс в желудке менее чем в 50% диагнозов. Даже при получении оптимальных условий рекомендуется вместо них УЗИ.
  3. Даже при отрицательном характере результата не может быть полностью исключена вероятность развития туберкулеза с изменением СОЭ, иммуноглобулина или других показателей.
  4. Посев материалов при ПЦР менее восприимчив на патологические состояния, если получен он в рамках бронхоскопического обследования, который исключает подозрения на ТБ у ребенка.

На ВИЧ

Для многих людей данный диагноз считается смертельным приговором. По этой причине после частых половых связей человек становится более внимателен к сигналам, которые подает его тело (а иногда придумывает их). Самый надежный вариант получить подтверждение или опровержение данного заболевания – ПЦР анализ на ВИЧ. Тест можно использовать для определения следующих возможных проблем со здоровьем:

  1. Опровержение/подтверждение наличия ВИЧ в период серонегативного кона.
  2. Определение генотипа ВИЧ-1, ВИЧ-2.
  3. Уточнение описания патологического процесса при сомнительном результате иммуноблота.
  4. Заражение после переливания крови.
  5. Определения ВИЧ-статуса у детей, которые родились от матерей-носителей заболевания.
  6. Помогает установить наблюдение за вирусной загруженностью организма.

На ВПЧ

Вирус папилломы может быть выявлен у любого человека, долгое время он может находиться в латентном состоянии. Развитие провоцирует ослабление иммунитет, стрессы или эмоциональные всплески. Анализ ПЦР на ВПЧ помогает определить концентрацию вируса в крови. По этой причине рекомендуется проводить количественно определение, а не качественное. Эти данные помогут спрогнозировать вероятность развития злокачественного характера инфекции.

Методика диагностики наличия ВПЧ основывается на основном свойстве ПЦР выделять из материала ДНК вируса. Из-за высокой чувствительности теста даже небольшое количество бактерий будет обнаружено. Количественное исследование открывает врачам возможность установить степень опасности заболевания, составить прогноз на будущее. Эта диагностика обязательна для всех мужчин и женщин, которые обнаружили у себя кондиломы. Количественный анализ ПЦР поможет определить, что послужило причиной развития ВПЧ: временное снижение иммунитета или хроническое заболевание.

На герпес

Данный вид диагностики в микробиологии помогает с высокой точностью проводить анализ ПЦР на герпес. Копирование фрагментов ДНК вируса будет происходить только, если в материале присутствует нужный ген. В данном случае тест по результатам проведения может указать на наличие или отсутствие возбудителя. Выявить его удастся даже при низкой концентрации в крови.

Еще один плюс анализа ПЦР в том, что он может определить герпетическую вирусную инфекцию сразу же после заражения, до появления клинической симптоматики. Можно определить тип герпеса (1 или 2), для сдачи анализа специфической подготовки не требуется, но врачи рекомендуют перед забором крови отказаться от:

  • жареного;
  • острого;
  • алкоголя;
  • жирного.

При беременности

При вынашивании ребенка очень важно провести данное исследования, чтобы поставить на учет состояние женщины. ПЦР анализ при беременности входит в перечень самых эффективных методов определения наличия разнообразных заболеваний. Провести тест нужно не только для выявления патологий, но и для определения вероятности заражения ребенка внутриутробно. Только благодаря ПЦР-диагностики стало возможным выявить степень прогрессирования, развитие множества инфекций внутри утробы матери.

Сдача анализов ПЦР

Если вам интересно, как берут анализ ПЦР, то следует рассматривать каждый отдельный случай, учитывая тип биоматериала. Соскоб, мазок или забор крови имеет свои особенности, к примеру:

  • плазма сдается утром;
  • моча берется только первая утром, в лабораторных условиях в стерильный контейнер;
  • мазок или соскоб будет показателен только после воздержания от половых контактов не менее 3 суток;
  • нельзя сдавать мазок во время менструации и через 2 суток после нее.

Где сдать анализы на ПЦР

Данный вид исследования относится к современным и высокотехнологическим способам диагностики. Сдавать анализы методом ПЦР следует в лабораториях, которые обладают всем необходимым комплексом для получения полноценных результатов. Не меньшую роль играют квалифицированные, подготовленные кадры. Отдайте предпочтение крупными, серьезным, известным лабораториям. Это поможет не только получить результаты быстро, но и обеспечит их достоверность.

Цена

Еще один вопрос, который часто интересует пациентов: сколько стоит анализ ПЦР? Из-за новизны метода, необходимости приобретения дорогостоящего оборудования цена на тест относительно высокая. На стоимость ПЦР влияет вид инфекции, на которую будут проверять человека. Ориентировочная цена и сроки выполнения тестов следующая:

  1. ИППП проверят за 1 день, цена – 400-500 рублей.
  2. Герпес, ВПЧ, вирус Эпштейна-Барра, цитомегловирус выявляют за сутки, цена – 300-500 р.
  3. Анализ на гепатит проводится за 5 дней, цена на качественный вариант – 500 р., количественный – 2000 р.
  4. Хеликобактер пилори выявляют за сутки, цена – 400 р.
  5. Антигены, антитела ВИЧ, цена – от 380 р.
  6. Качественный анализ РНК ВИЧ, цена – от 3 500 р.
  7. Количественный анализ РНК ВИЧ, цена – от 11 000 р.

Видео

Внимание! Информация, представленная в статье, носит ознакомительный характер. Материалы статьи не призывают к самостоятельному лечению. Только квалифицированный врач может поставить диагноз и дать рекомендации по лечению, исходя из индивидуальных особенностей конкретного пациента.

Нашли в тексте ошибку? Выделите её, нажмите Ctrl + Enter и мы всё исправим!

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

"Карельская государственная педагогическая академия"


Курсовая работа на тему:

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение


Выполнила: студентка Корягина Валерия Александровна

Проверила: Карпикова Наталья Михайловна


Петрозаводск 2013


Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.5.4 Эффект "Плато"

1.5.6 Амплификация

Заключение


Введение


Последнее двадцатилетие ознаменовалось широким внедрением в биологические, медицинские и сельскохозяйственные науки молекулярно-генетических методов.

К началу 70-х годов казалось, что молекулярная биология достигла определенной степени завершенности. В этот период главным объектом молекулярно-генетических исследований были микроорганизмы. Переход к эукариотам поставил перед исследователями совершенно новые проблемы, которые не могли быть решены с использованием существовавших в то время методов генетического анализа. Прорыв в развитии молекулярной генетики стал возможен благодаря появлению нового экспериментального инструмента - рестрикационных эндонуклеаз. В последующие годы количество методов непосредственного анализа ДНК, основанных на качественно различающихся подходах, начало стремительно увеличиваться.

Современные технологии во многих случаях позволили на более глубоком уровне начать изучение тонкой структурно-функциональной организации ядерных и внеядерных геномов различных организмов. Особое значение это имело для разработки новых методов диагностики и лечения различных заболеваний. Не менее важным оказалась возможность использования достижения молекулярной генетики в популяционной биологии и в селекции для выявления и анализа генетической изменчивости популяций, сортов и штаммов, идентификации и паспортизации хозяйственно ценных особей, создания генетически модифицированных организмов и для решения других вопросов.

Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Нет универсального метода, который мог бы позволить решить все возникающие проблемы. Поэтому выбор конкретного метода для проводимого исследования является одним из важнейших этапов любой научной работы.

Глава 1. Литературный обзор


1.1 История открытия Полимеразной цепной реакции (ПЦР)


В 1983 г. К.Б. Мюллис и др. опубликовали и запатентовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), которому суждено было оказать глубочайшее влияние на все области исследования и прикладного использования нуклеиновых кислот. Значение этого метода для молекулярной биологии и генетики оказалось столь велико и очевидно, что уже через семь лет автору была присуждена Нобелевская премия по химии.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq -полимеразой.

Возможность амплификации любого сегмента ДНК, последовательность нуклеотидов которого известна, и получение его по завершении ПЦР в гомогенном виде и препаративном количестве делают ПЦР альтернативным методом молекулярного клонирования коротких фрагментов ДНК. При этом не возникает необходимости в применении сложных методических приемов, которые используют в генной инженерии при обычном клонировании. Разработка метода ПЦР во многом расширила методические возможности молекулярной генетики, и, в частности, генной инженерии, причем настолько, что это кардинально изменило и усилило научный потенциал многих её направлений.


1.2 Разновидности полимеразной цепной реакции (ПЦР)


·Вложенная ПЦР - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

·Инвертированная ПЦР - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК - рестриктазами <#"justify">полимеразная цепная реакция праймер

·Групп-специфическая ПЦР - ПЦР для родственных <#"center">1.3 Полимеразная цепная реакция


Открытая в середине 80-х годов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) способна увеличить количество копий исходной пробы в миллионы раз в течение нескольких часов. В ходе каждого цикла реакции из исходной молекулы образуются две копии. Каждая из синтезированных копий ДНК может служить матрицей для синтеза новых копий ДНК в следующем цикле. Таким образом, многократное повторение циклов, приводит к возрастанию количества копий в геометрической прогрессии. Из расчетов следует, что даже при наличии 30 циклов, число копий исходной молекулы составит более 1 миллиарда. Даже если учесть, что в ходе каждого цикла дуплицируются не все ампликоны, то общее количество копий, несмотря на это, составляет достаточно большую цифру.

Каждый цикл полимеразной цепной реакции (ПЦР) состоит из следующих этапов:

·Денатурация - Повышение температуры вызывает раскручивание и расщепление двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные;

·Отжиг - Снижение температуры позволяет праймерам присоединиться к комплементарным участкам молекулы ДНК;

·Элонгация - Фермент ДНК-полимераза достраивает комплементарную цепь.

Для амплификации избранного фрагмента используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующих определенный участок ДНК. Праймеры ориентированы 3-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. ДНК-полимераза осуществляет синтез (достройку) взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с праймеров. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК. Каждая цепь молекулы ДНК, образующаяся с помощью одного из праймеров, может служить матрицей для синтеза комплементарной цепи ДНК с помощью другого праймера.


1.4 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)


Полимеразную цепную реакцию проводят в специальных тонкостенных полипропиленовых пробирках, совместимых по размеру с используемым термоциклером (амплификатором) - прибором, который контролирует температурные и временные характеристики этапов полимеразной цепной реакции (ПЦР).


1.5 Принцип метода полимеразной цепной реакции


Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий:


1.5.1 Наличие в реакционной смеси ряда компонентов

Основными компонентами реакционной (ПЦР) смеси являются: Трис-HCl, KCl, MgCl2, смесь нуклеотидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ), праймеры (олигонуклеотиды), препарат анализируемой ДНК, термостабильная ДНК-полимераза. Каждый из компонентов реакционной смеси непосредственно участвует в полимеразной цепной реакции (ПЦР), а концентрация реагентов напрямую влияет на ход амплификации.

·Трис-HCl - определяет pH реакционной смеси, создает буферную емкость. Активность ДНК-полимеразы зависит от pH среды, поэтому значение водородного показателя напрямую влияет на ход полимеразной цепной реакции. Обычно значение pH находится в пределах 8 - 9,5. Высокое значение pH берется из-за того, что при повышении температуры pH Трил-HCl буфера падает.

·KCl - концентрация хлорида калия до 50 мМ влияет на протекание процессов денатурации и отжига, концентрация свыше 50 мМ ингибирует ДНК-полимеразу.

·MgCl2 - поскольку ДНК-полимераза является Mg2+ - зависимым ферментом, то концентрация ионов магния влияет на активность фермента (Mg2+ образует комплексы с НТФ - именно эти комплексы являются субстратом для полимеразы). Высокая концентрация приводит к увеличению неспецифической амплификации, а низкая ведет - к ингибированию реакции, оптимум (для различных полимераз) находится в области 0,5 - 5мМ. Кроме того, концентрация солей магния влияет на протекание процессов денатурации и отжига - повышение концентрации Mg2+ вызывает повышение температуры плавления ДНК (т.е. температуры, при корой 50% двухцепочечных нитей ДНК разъединяются на одноцепочечные).

·НТФ - нуклеотидтрифосфаты являются непосредственными мономерами нуклеиновых кислот. Для предотвращения цепной терминации рекомендуется равноколличественное соотношение всех четырех нуклеотидтрифосфатов. Низкая концентрация данных компонентов в реакционной смеси увеличивает вероятность ошибки при построении комплементарной цепи ДНК.

·Праймеры - Наиболее оптимальным является использование праймеров с разницей температур плавления не более 2 - 4oС. Иногда при длительном хранении при температуре 4oС, или после большого количества замораживаний - оттаиваний праймеры образуют вторичные структуры - димеры, снижая эффективность протекания ПЦР. Устранение данной проблемы сводится к инкубации на водяной бане (Т=95oС) в течение 3 минут и последующему резкому охлаждению до 0oС.

·Препараты ДНК - количество и качество препарата ДНК (матрицы) непосредственно влияет на ход и параметры полимеразной цепной реакции. Избыточное количество образца ДНК ингибирует полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Примеси различных веществ, находящихся в препарате ДНК, могут также уменьшить эффективность протекания полимеразной цепной реакции (ПЦР): ацетат натрия, хлорид натрия, изопропанол, этанол, гепарин, фенол, мочевина, гемоглобин и др.

·ДНК-полимераза - при использовании малого количества ДНК-полимеразы наблюдается уменьшение синтеза конечного продукта прямо пропорционально размеру фрагментов. Избыток полимеразы в 2 - 4 раза приводит к появлению диффузных спектров, а в 4 - 16 раз - низкомолекулярных неспецифических спектров. Диапазон используемых концентраций - 0,5 - 1,5 единиц активности в перерасчете на 25 мкл ПЦР смеси.

Кроме основных компонентов ПЦР смеси, используют ряд дополнительных веществ, улучшающих качественные и количественные показатели ПЦР: ацетамид (5%) - увеличение растворимости основных компонентов; бетаин (натриевая соль) - стабилизация ДНК-полимеразы, понижение температуры плавления ДНК, выравнивание температуры плавления; альбумин бычий (10-100 мкг/мл) - стабилизация ДНК-полимеразы; диметилсульфоксид (1-10%) - повышение растворимости основных компонентов; формамид (2-10%) - увеличение специфичности отжига; глицерин (15-20%) - увеличение термостабильности фермента, понижение температуры денатурации образца ДНК; сульфат аммония - снижение температуры денатурации и отжига.


1.5.2 Циклический и температурный режим

Общий вид программы полимеразной цепной реакции (ПЦР) следующий:

этап. Длительная первичная денатурация препарата ДНК.1 цикл

этап. Быстрая денатурация препарата ДНК. Отжиг праймеров. Элонгация.30 - 45 циклов.

этап. Длительная элонгация. Охлаждение реакционной смеси.1 цикл.

Каждый элемент этапа - денатурация, отжиг, элонгация - имеет индивидуальные температурные и временные характеристики. Параметры температуры и времени протекания каждого элемента подбирают эмпирически, в соответствии с качественными и количественными показателями продуктов амплификации.

Денатурация. В ходе данного элемента полимеразной цепной реакции происходит расщепление двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные. Температурные параметры денатурации находятся в области 90 - 95oС, но в случае ДНК-образца с большим содержанием гуанина и цитозина, температура должна быть увеличена до 98oС. Температура денатурации должна быть достаточной для полной денатурации - расщепления нитей ДНК и избежания "внезапного охлаждения" или быстрого отжига, однако, термостабильная ДНК-полимераза менее устойчива при высоких температурах. Таким образом, подбор оптимальных температурных параметров денатурации для соотношения праймер/образец (препарат ДНК) является важным условием при проведении амплификации. Если температура денатурации на первом этапе выше 95oС, рекомендуется добавлять ДНК-полимеразу в реакционную смесь после первичной денатурации. Продолжительность данного элемента этапа в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) должна быть достаточной для полной денатурации ДНК, но в то же время не оказывать существенного влияния на активность ДНК-полимеразы при данной температуре.

Отжиг. Температура отжига (Та) - один из важнейших параметров полимеразной цепной реакции. Температура отжига для каждого конкретного праймера подбирается индивидуально. Она зависит от длинны и нуклеотидного состава праймера. Обычно она ниже на 2 - 4oС значения температуры плавления (Тm) праймера. Если температура отжига системы ниже оптимальной, то число неспецифических амплифицированных фрагментов возрастает и, наоборот, более высокая температура уменьшает количество амплифицированных продуктов. При этом концентрация специфических ампликонов может резко снижаться, вплоть до ингибирования полимеразной цепной реакции (ПЦР). Увеличение времени отжига также приводит к увеличению количества неспецифических ампликонов.

Элонгация. Обычно каждый вид термостабильной ДНК-полимеразы имеет индивидуальный температурный оптимум активности. Скорость синтеза ферментом комплементарной нити ДНК также является величиной специфичной для каждой полимеразы (в среднем она составляет 30 - 60 нуклеотидов в секунду, или 1 - 2 тыс. оснований в минуту), поэтому время элонгации подбирается в зависимости от типа ДНК-полимеразы и длинны амплифицируемого региона.


1.5.3 Основные принципы подбора праймеров

При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:

Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3-концам праймеров, т. к именно с них начинает достраивать комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос. Это мешает оценке результатов реакции, т. к легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.


1.5.4 Эффект "Плато"

Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом "плато".

Термин эффект плато используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации.

В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения эффекта плато влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на плато". Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.


1.5.5 Подготовка пробы биологического материала

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.


1.5.6 Амплификация

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.


1.6 Состав стандартной реакционной ПЦР смеси


х ПЦР буфер (100 мМ р-р Трис-HCl, pH 9,0, 500 мМ р-р KCl, 25 мМ р-р MgCl2) …….2,5 мкл

Вода (MilliQ) ……………………………………………………….18,8 мкл

Смесь нуклеотидтрифосфатов (дНТФ)

мМ р-р каждого……………………………………….……….0,5 мкл

Праймер 1 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл

Праймер 2 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл

ДНК-полимераза (5 ед. /мкл) ………………………………………0,2 мкл

Образец ДНК (20 нг/мкл) …………………………………………..1 мкл


1.7 Оценка результатов реакции


Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.

Глава 2: Применение Полимеразной цепной реакции


ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

Криминалистика

ПЦР используют для сравнения так называемых "генетических отпечатков пальцев". Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев.

Установление отцовства

Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. Отец. Ребенок. Мать. Ребенок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

Хотя "генетические отпечатки пальцев" уникальны, родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

Персонализированная медицина

Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого - отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром может быть более активен, у другого - менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием.

Клонирование генов

Клонирование генов - это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

Секвенирование ДНК

В методе секвенирования с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченые флуоресцентной или радиоактивной меткой. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле.

Мутагенез

В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза. Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.

Метод ПЦР позволил проанализировать наличие последовательностей вирусов папилломы человека в срезах биопсий новообразований шейки матки человека, залитых парафином за 40 лет до данного исследования. Более того, с помощью ПЦР удалось амплифицировать, и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет!

На лизатах индивидуальных сперматозоидов человека продемонстрирована возможность одновременно анализировать два локуса, расположенных на разных негомологичных хромосомах. Такой подход обеспечивает уникальную возможность тонкого генетического анализа и изучения хромосомной рекомбинации, ДНК-полиморфизма и др. Метод анализа индивидуальных сперматозоидов сразу нашел практическое применение в судебной медицине, так как HLA-типирование гаплоидных клеток позволяет определять отцовство или выявлять преступника (комплекс HLA представляет собой набор генов главного комплекса гистосовместимости человека; локусы комплекса HLA - наиболее полиморфные из всех известных у высших позвоночных: в пределах вида в каждом локусе существует необычайно большое число разных аллелей - альтернативных форм одного и того же гена).

Используя ПЦР, можно выявлять правильность интеграции чужеродных генетических структур в заранее определенный район генома изучаемых клеток. Суммарная клеточная ДНК отжигается с двумя олигонуклеотидными затравками, одна из которых комплементарна участку хозяйской ДНК вблизи точки встраивания, а другая - последовательности интегрированного фрагмента в антипараллельной цепи ДНК. Полимеразная цепная реакция в случае неизмененной структуры хромосомной ДНК в предполагаемом месте встройки приводит к образованию фрагментов одноцепочечной ДНК неопределенного размера, а в случае запланированной встройки - двухцепочечных фрагментов ДНК известного размера, определяемого расстоянием между местами отжига двух праймеров. Причем степень амплификации анализируемого района генома в первом случае будет находиться в линейной зависимости от количества циклов, а во втором - в экспоненциальной. Экспоненциальное накопление в процессе ПЦР амплифицируемого фрагмента заранее известного размера позволяет визуально наблюдать его после электрофоретического фракционирования препарата ДНК и делать однозначное заключение о встройке чужеродной последовательности в заданный район хромосомной ДНК.

Заключение


Самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ, содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в ранней диагностики ВИЧ-инфекций, вирусных гепатитов и т.д. На сегодняшний день почти нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.

Список использованной литературы


1.Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методы молекулярно - генетического анализа. - Мн.: Юнипол, 2007. - 176 с.

2.ПЦР "в реальном времени"/ Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др.; под ред. д. б. н. Д.В. Ребрикова; предисл. Л.А. Остермана и акад. РАН и РАСХН Е.Д. Свердлова; 2-е изд., испр. и доп. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.

.Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. - М.: Наука, 2005. - В 2 т

.Б. Глик, Дж. Пастернак Молекулярная биотехнология. Принципы и применение 589 стр., 2002 г.

5.Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. - Новосибирск: Сиб. унив. издательствово, 2004. - 496 с.

Под редакцией А.А. Ворбьева "Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматовенерологии"; Медицинское информационное агентство - 72 стр.

Http://ru. wikipedia.org

Http://scholar. google.ru

.

.

Http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - медицинский журнал


Репетиторство

Нужна помощь по изучению какой-либы темы?

Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.