Основният метод за микробиологична диагностика и „златният стандарт” на микробиологията е бактериологичният метод.
Целта на бактериологичния методсе състои в изолиране на чиста култура на патогена от тестовия материал, натрупване на чиста култура и идентифициране на тази култура чрез набор от свойства: морфологични, тинкториални, културни, биохимични, антигенни, чрез наличието на фактори на патогенност, токсигенност и определяне на нейната чувствителност. към антимикробни лекарства и бактериофаги.
Бактериологичният метод на изследване включва:
1. инокулация на тестовия материал в хранителни среди
2. изолиране на чиста култура
3. идентификация на микроорганизми (определяне на вида).
Изолирането и идентифицирането на чисти култури от аеробни и анаеробни бактерии включва следните изследвания:
Етап I (работа с роден материал)
Цел: получаване на изолирани колонии
1. Предварителната микроскопия дава приблизителна представа за микрофлората
2. Подготовка на материал за изследване
3. Засяване върху твърди хранителни среди за получаване на изолирани колонии
4. Инкубация при оптимална температура, най-често 37°C, за 18-24 часа
Етап II
Цел: получаване на чиста култура
1. Макроскопско изследване на колонии в пропусната и отразена светлина (характеристики на размер, форма, цвят, прозрачност, консистенция, структура, контур, повърхност на колониите).
2. Микроскопско изследване на изолирани колонии
3. Тестване за аеротолерантност (за потвърждаване наличието на строги анаероби в тестовия материал).
4. Засяване на колонии, характерни за даден вид, върху чиста културална среда за натрупване или селективна среда и инкубиране при оптимални условия.
Етап III
Цел: идентифициране на изолирана чиста култура
1. За идентифициране на избраната култура въз основа на набор от биологични свойства се изследва следното:
· морфология и тинкториални свойства
· културни свойства (характер на растеж върху хранителни среди)
· биохимични свойства (ензимна активност на микроорганизмите)
Серологични свойства (антигенни)
· вирулентни свойства (способността да се произвеждат фактори на патогенност: токсини, ензими, защитни и агресивни фактори)
патогенност за животните
· фаголизируемост (чувствителност към диагностични бактериофаги)
чувствителност към антибиотици
· други самостоятелни имоти
Етап IV (Заключение)
Въз основа на изследваните свойства се прави заключение за избраната култура.
Първият етап от изследването.Изследването на патологичния материал започва с микроскопия. Микроскопията на оцветения нативен материал позволява да се установи приблизително съставът на микробния пейзаж на обекта, който се изследва, и някои морфологични характеристики на микроорганизмите. Резултатите от микроскопията на нативния материал до голяма степен определят хода на по-нататъшното изследване, впоследствие те се сравняват с данните, получени чрез инокулация върху хранителни среди.
Ако в пробата има достатъчно съдържание на патогенни микроорганизми, инокулацията се извършва върху твърди хранителни среди (за получаване на изолирани колонии). Ако има малко бактерии в тестовия материал, тогава инокулацията се извършва върху течна обогатена хранителна среда. Хранителните среди се подбират според изискванията на микроорганизмите.
Култивирането на микроорганизми е възможно само ако се създадат оптимални условия за тяхната жизнена дейност и се спазват правила, които изключват замърсяване (случайно замърсяване от чужди микроби) на изследвания материал. В епруветка, колба или петриево блюдо могат да се създадат изкуствени условия, които биха предотвратили заразяване на културата от други видове. Всички стъклени съдове и хранителни среди трябва да бъдат стерилни и след инокулиране на микробен материал, защитени от външно замърсяване, което се постига с помощта на запушалки или метални капачки и капаци. Манипулациите с изпитвания материал трябва да се извършват в зоната на пламъка на спиртна лампа, за да се предотврати замърсяване на материала от външната среда, както и с цел спазване на правилата за безопасност.
Инокулацията на материала върху хранителни среди трябва да се извърши не по-късно от 2 часа от момента на събиране.
Втори етап на изследване.Изследване на колонии и изолиране на чисти култури. След еднодневна инкубация върху съдовете растат колонии, като при първия удар растежът е непрекъснат, а при следващите - изолирани колонии. Колонията е колекция от микроби от един и същи вид, растящи от една клетка. Тъй като материалът най-често е смес от микроби, растат няколко вида колонии. Различните колонии се маркират с молив, като се очертават с кръг отдолу и се изследват (табл. 11). На първо място, колониите се изследват с просто око: макроскопични признаци. Чашата се гледа (без да се отваря) от дъното на пропускаща светлина, отбелязва се прозрачността на колониите (прозрачна, ако не блокира светлината; полупрозрачна, ако частично блокира светлината; непрозрачна, ако светлината не преминава през колония) и размерът на колониите се измерва (в mm). След това изучават колониите от страната на капака, отбелязват формата (правилна кръгла, неправилна, плоска, изпъкнала), естеството на повърхността (гладка, лъскава, матова, грапава, набръчкана, мокра, суха, лигава), цвят (безцветен, оцветен).
Таблица 11. Схема за изследване на колонии
| № | Знак | Възможни характеристики на колониите |
| 1. | форма | Плосък, изпъкнал, купол, вдлъбнат, кръгъл, розетка, звезда |
| 2. | Размер, мм | Голям (4-5 mm), среден (2-4 mm), малък (1-2 mm), джудже (< 1 мм) |
| 3. | Характер на повърхността | Гладка (S-форма), грапава (R-форма), мазна (M-форма), набраздена, бучка, матова, лъскава |
| 4. | Цвят | Безцветен, цветен |
| 5. | Прозрачност | Прозрачни, непрозрачни, полупрозрачни |
| 6. | Характер на ръбовете | Гладка, назъбена, с ресни, влакнеста, назъбена |
| 7. | Вътрешна структура | Хомогенна, гранулирана, разнородна |
| 8. | Последователност | Вискозен, лигав, ронлив |
| 9. | Емулгиране в капка вода | Добро Лошо |
Забележка: точки 5-7 се изследват при ниско увеличение на микроскопа.
Можете да видите разликите между колониите още по-добре, когато ги гледате с увеличение. За да направите това, поставете затворена чаша с дъното нагоре върху сцената, леко спуснете кондензатора, използвайте леко увеличение на лещата (x8), преместете чашата, проучете микроскопичните характеристики на колониите: естеството на ръба ( гладка, вълнообразна, назъбена, назъбена), структура (хомогенна, гранулирана, влакнеста, хомогенна или различна в центъра и периферията).
След това се изследва морфологията на микробните клетки от колониите. За целта се правят петна от част от всяка от маркираните колонии и се оцветяват по Грам. Когато вземате колонии, обърнете внимание на консистенцията (суха, ако колонията се рони и е трудна за взимане; мека, ако се взема лесно с примка; лигава, ако колонията се дърпа с примка; твърда, ако е част от колонията не се взема с цикъл, можете само да премахнете цялата колония) .
При преглед на петна се установява, че колонията е представена от един вид микроб, следователно могат да се изолират чисти култури от бактерии. За да направите това, изследваните колонии се посяват отново върху наклонен агар. При повторно засяване от колонии трябва да се внимава да се вземат точно предвидените колонии, без да се докосват близките колонии с примката. Епруветките се етикетират и се инкубират в термостат при 37°C за 24 часа.
Третият етап на изследване.Идентифициране на изолираната култура. Идентификация на микроби - определяне на системното положение на култура, изолирана от материал до вид и вариант. Първото условие за надеждна идентификация е безусловната чистота на културата. За идентифициране на микроби се използва набор от характеристики: морфологични (форма, размер, наличие на флагели, капсули, спори, относителна позиция в намазка), тинкториални (връзка с оцветяване по Грам или други методи), химични (съотношение на гуанин + цитозин в ДНК молекула), културни (хранителни нужди, условия на култивиране, скорост и характер на растеж върху различни хранителни среди), ензимни (разцепване на различни вещества с образуването на междинни и крайни продукти), серологични (антигенна структура, специфичност), биологични (вирулентност за животни, токсичност, алергенност, влияние на антибиотици и др.).
За биохимична диференциация способността на бактериите да ферментират въглехидрати с образуването на междинни и крайни продукти, способността за разграждане на протеини и пептони и изследване на редокс ензими.
За изследване на захаролитичните ензими изолираните култури се инокулират в епруветки с полутечна среда, съдържаща лактоза, глюкоза и други въглехидрати и многовалентни алкохоли. За полутечни среди инокулацията се извършва чрез инжектиране в дълбочината на средата. При засяване чрез инжектиране епруветката със средата се държи под ъгъл, запушалката се отстранява и ръбът на епруветката се изгаря. Материалът се взема със стерилна примка и с нея се пробива почти до дъното колонката с хранителна среда.
За определяне на протеолитичните ензими изолираната култура се инокулира върху пептонна вода или MPB. За да направите това, вземете епруветката с инокулацията по-близо до вас в ръката си, а епруветката със средата по-далеч от вас. И двете епруветки се отварят едновременно, като запушалките им се хващат с малкия пръст и ръба на дланта, краищата на епруветките се изгарят, като се използва калцинирана охладена примка, за да се вземе малко култура и да се прехвърли във втората епруветка , смила се в течна среда върху стената на епруветката и се отмива със средата.
При сеитба и презасаждане трябва да се обърне внимание на спазването на правилата за стерилност, за да не заразите посевите си с чужда микрофлора, а също и да не замърсявате околната среда. Епруветките се етикетират и се поставят в термостат за инкубиране при 37°C за 24 часа.
Заключение
Отчитане на резултатите. Заключение от изследването. Резултатите от идентификацията се вземат предвид и въз основа на съвкупността от получените данни, въз основа на класификацията и характеристиките на типичните щамове, описани в ръководството (ключ на Burgee, 1994-1996), се определя типът на изолираните култури.
Вид - набор от микроорганизми, които имат общ еволюционен произход, подобен генотип (висока степен на генетична хомология, обикновено повече от 60%) и възможно най-близки фенотипни характеристики. Щамът е изолирана култура от даден вид бактерии („специфична проба от даден вид“) Колонията е изолирана видима за окото структура, образувана в резултат на размножаване и натрупване на микроорганизми за определен период на инкубация и от една родителска клетка или от няколко еднакви клетки.
Методи за лабораторна диагностика Ø Микроскопски - откриване на m/o директно в клиничен материал Ø Бактериологичен - откриване на m/o чрез инокулиране на материала върху хранителни среди Ø Биологичен - изолиране на m/o от предварително заразено лабораторно животно Ø Серологичен - откриване на специфични имунни антитела в кръвния серум на пациента Ø Алергични – извършване на кожни алергични тестове (високо специфични – туберкулоза, туларемия и др.)
Ø Културен - естеството на растежа на микроорганизма върху хранителни среди. Ø Биохимични - способността да ферментират различни субстрати (въглехидрати, протеини и аминокиселини и др.), да образуват различни биохимични продукти в процеса на живот поради активността на различни ензимни системи и метаболитни характеристики. Ø Антигенни – зависят основно от химичния състав и структурата на клетъчната стена, наличието на флагели, капсули, разпознават се по способността на макроорганизма (гостоприемника) да произвежда антитела и други форми на имунен отговор, откриват се при имунологични реакции.
Физиологични - методи на въглехидрати (автотрофи, хетеротрофи), азот (аминоавтотрофи, аминохетеротрофи) и други видове хранене, тип дишане (аероби, микроаерофили, факултативни анаероби, строги анаероби). Ø Подвижност и видове движение. Ø Способност за образуване на спори, характер на спорите. Ø Чувствителност към бактериофаги, фаготипизиране. Ø Химичен състав на клетъчните стени – основни захари и аминокиселини, липиден и мастнокиселинен състав. Ø Протеинов спектър (полипептиден профил). Ø Ø Чувствителност към антибиотици и други лекарства. Ø Генотипни (използване на геносистематични методи).
Бактериологичният метод включва инокулиране на клиничен материал върху изкуствени хранителни среди, изолиране на чисти култури от микроби и последващата им идентификация.
Бактериологичните методи се използват: при диагностика на инфекциозни заболявания; Ш При профилактични прегледи за носителство на чревни бактерии, дифтериен бацил и др.; Ш при изследване на санитарно-хигиенното състояние на обекти на околната среда (вода, въздух, почва, храна и др.) И изследването им по епидемиологични показания за заразяване с патогенни видове микроорганизми. Ш
Физиологични характеристики Връзка с температурата Дишане Хранене Ензими Метаболизъм на протеини и аминокиселини (желатиназа, колагеназа, декарбоксилаза, уреаза) Други ензими (хемолизини, липази, лецитиназа, ДНКаза) Крайни продукти на метаболизма (хроматография) Резистентност/чувствителност към AMPs
Елементите, които са основно необходими за растежа на микроорганизмите и трябва да бъдат включени в хранителната среда, се определят от химичния състав на микробните клетки, който по принцип е еднакъв във всички живи организми. По-голямата част от общата клетъчна маса е представена от вода (80–90%) и само 10–20% е сухо вещество. Според количественото им съдържание в сухото вещество се разграничават макро- и микроелементи. Първите включват: въглерод, кислород, азот, водород, сяра, фосфор, калий, натрий, магнезий, калций, желязо. Микроелементите включват манган, молибден, цинк, мед, кобалт и др., повечето от които са необходими в следи от количества. Поради тази причина микроелементите не се добавят към състава на много среди, тъй като нуждата от тях може да бъде задоволена поради примеси в макроелементните соли. Освен това не всички микроорганизми се нуждаят от микроелементи. 14
За разлика от животинските и растителните организми, микроорганизмите се характеризират с разнообразие от видове хранене, които се разграничават по три основни критерия – източник на въглерод, източник на енергия и донор на електрони (водород). В зависимост от естеството на източника на въглерод всички микроорганизми се разделят на 2 големи групи - автотрофи, които използват въглероден диоксид, и хетеротрофи, които се нуждаят от готови органични вещества за растеж и размножаване. Като се има предвид разнообразието от източници на енергия и донори на електрони, тези групи са разделени на подгрупи, което води до 8 вида хранене на микроорганизмите. Всеки вид хранене е характерен за определени микроорганизми и отразява техните физиологични и биохимични свойства. Повечето микроорганизми, включително патогенните, имат такъв тип хранене, при който органичните вещества са източник на въглерод, енергия и донори на електрони. 16
Нуждите на микроорганизмите от източници на органичен въглерод са много разнообразни. Някои видове са „всеядни“ и могат да консумират вещества с различен химичен характер, други са по-селективни и използват само някои от тях. Спецификата на набора от органични съединения, характерни за всеки вид микроорганизъм, се взема предвид при създаването на селективна и диференциална диагностична среда, широко използвана в санитарната и клиничната микробиология за бързо идентифициране на определени групи микроорганизми. При избора на въглеродсъдържащ субстрат е необходимо да се има предвид, че смилаемостта на органичните вещества до голяма степен зависи от техните свойства - разтворимост, степен на окисление на въглеродните атоми, пространствена конфигурация и полимеризация на техните молекули. Микроорганизмите обикновено асимилират някои оптични изомери - захари, принадлежащи към D-серия, аминокиселини - към L-серия. Много малко микроорганизми притежават ензими, които превръщат един оптичен изомер в друг. Само онези микроорганизми, които синтезират определени хидролитични ензими - амилази, протеази, липази под формата на екзоензими, т.е. ензими, секретирани от клетката в околната среда, могат да използват такива биополимери като нишесте, полизахариди, протеини, мазнини. 17
За по-голямата част от хетеротрофните микроорганизми основните, лесно достъпни източници на въглерод и енергия са въглехидрати, аминокиселини, протеини и органични киселини. Характеризирайки нуждата на микроорганизмите от източници на органичен въглерод, трябва да се отбележи, че най-голямата степен на хетеротрофия е присъща на патогенните микроорганизми, които са се адаптирали към живота в тялото на хората и животните. Съставът на хранителните среди за тяхното отглеждане е особено сложен. Те съдържат протеини или продукти от тяхната плитка хидролиза (пептиди), витамини, фрагменти от нуклеинови киселини и др. За приготвянето на такива среди се използват различни видове хидролизати и месни екстракти, кръв или серум, дрожди и растителни екстракти и много други. Тези среди са подходящи за култивиране на голямо разнообразие от видове и са особено полезни в случаите, когато нуждата на микроба от растежни фактори е неизвестна или когато той изисква много растежни фактори едновременно. Недостатъкът на такива среди е сложността или невъзможността за постигане на тяхната стандартизация поради нестандартния характер и ограничената контролируемост на състава и свойствата на суровината. 18
Конструктивният метаболизъм на микроорганизмите като цяло е насочен към синтеза на четири основни типа биополимери – протеини, нуклеинови киселини, полизахариди и липиди. За биосинтезата на протеини и нуклеинови киселини най-важният елемент, в допълнение към въглерода, е азотът. Най-достъпният източник на азот за повечето микроорганизми са амониеви йони, които те могат да получат от соли на органични и неорганични киселини, аминокиселини, протеини и други азотсъдържащи вещества. Голяма група бактерии, предимно патогенни, изискват азотсъдържащи органични вещества като източници на азот. Ако аминокиселините са такъв източник на азот, микроорганизмите могат да ги използват директно за синтеза на протеини или могат първо да ги дезаминират и да използват аминогрупите, освободени в процеса, за синтеза на собствените си аминокиселини и протеини. 19
Растежът на някои микроорганизми обаче изисква определени аминокиселини, които те не могат да синтезират сами. Микроорганизмите, които изискват такива "незаменими" аминокиселини, включват Staphylococcus aureus, хемолитичен стрептокок, млечнокисели бактерии и някои други. В зависимост от физиологичните особености на микробите, броят на "незаменимите" аминокиселини е различен - за Staphylococcus aureus в хранителната среда са необходими само триптофан и цистин, а за хемолитичен стрептокок - 17 аминокиселини. Протеините, като източници на азот, са достъпни само за онези микроорганизми, които образуват протеолитични ензими, освободени в средата (т.е. в екзо форма). Под въздействието на тези ензими протеините се разграждат до вещества с по-ниска молекулна маса - пептони и аминокиселини. 20
Енергийният метаболизъм на микроорганизмите, подобно на конструктивния метаболизъм, се характеризира с различни биохимични механизми. Има три основни вида на този метаболизъм - аеробно дишане, анаеробно дишане и ферментация, най-често срещаният от които е аеробното дишане. В този процес органичната материя се окислява до въглероден диоксид и вода с максимално освобождаване на енергия, съдържаща се в това вещество. Много микроорганизми с аеробно дишане са стриктни аероби, но някои от тях са факултативни аероби, тъй като могат да образуват АТФ при анаеробни условия - чрез ферментация. Някои микроорганизми, главно бактерии, получават енергия чрез анаеробно дишане, т.е. в резултат на окисление на вещества, при което неорганичните съединения, а не кислородът, действат като акцептори на електрони. Така някои видове от рода Bacillus и E. coli извършват анаеробно дишане, при което нитратите (NO 3) се редуцират до амоняк; Clostridium aceticum окислява молекулярния водород, използвайки въглероден диоксид като акцептор на електрони. 21
Най-простият вид енергиен метаболизъм е ферментацията. Процесите на ферментация протичат при анаеробни условия и са придружени от освобождаване на енергия. Основният ферментационен субстрат са въглехидратите, но бактериите могат да ферментират органични киселини, включително аминокиселини, както и пурини и пиримидини. Има много видове ферментация, всяка от които се причинява от специална група микроорганизми и в съответствие с механизма се придружава от образуването на специфични крайни продукти. Крайните продукти на ферментацията обикновено са различни органични киселини - млечна, оцетна, янтарна, лимонена и др., както и алкохоли (етилов, бутилов, пропилов), въглероден диоксид и водород. Въз основа на добива на основния краен продукт се разграничават съответните видове ферментация. Поради факта, че по време на ферментацията не настъпва пълно окисление на субстрата и в околната среда се отделят частично окислени вещества, които все още съдържат енергия - органични киселини, алкохоли и др., Общият добив на АТФ в този процес на 1 мол на ферментирал субстрат е значителна (~ 30 пъти) е по-ниска, отколкото по време на метаболизма на същия субстрат в процесите на дишане. 22
Специална роля принадлежи на Робърт Кох. След като постулира необходимостта от изолиране на чиста култура на микроба, той определя необходимостта от създаване на условия за решаване на този проблем. Най-важното от тях беше хранителната среда, върху която микроорганизмът може да расте. Името на Кох се свързва с въвеждането на твърдите хранителни среди в микробиологичната практика през 1881 г. Самата идея за тяхното използване възниква по-рано и принадлежи на немския изследовател Бредфелд. Освен това през 1877 г. Шрьотер култивира бактерии върху резени картофи, което също може да се тълкува като използване на хранителна среда. Заслугата на Кох е в дълбокия научен подход към проблема и широкото използване на хранителни среди в собствените му изследвания. Той предложи и първия втвърдител - желатин, като компонент на плътна среда. 25
Агар-агарът, познат на съвременните микробиолози, е въведен в ежедневната практика от Фрост много по-късно, през 1919 г., въпреки че би било справедливо да припомним, че през 1881 г. немският изследовател Хесе предложи агар-агар. Освен това през 1913 г. руският микробиолог V.L. Omelyansky, отдавайки почит на хранителните среди с желатин, отбелязва, че агарните хранителни среди са за предпочитане в случаите, когато микробът втечнява желатина. Идеите и практическата дейност на Кох получиха интензивно развитие в края на 19 и първата четвърт на 20 век. През този период изследователи от редица страни предложиха хранителни среди за различни цели, чиято роля за практическата микробиология беше и остава много важна. Съвременният микробиолог помни имената им всеки ден в работата си. През тези няколко години японецът по произход Ш. Ендо предложи своя агар за диференциация на ентеробактерии, австриецът Е. Ловенщайн предложи среда за микобактерии, а англичанинът А. Мак. Konki - селективна и диференциално диагностична среда за чревни микроорганизми, немски T. Kitt и италиански D. Tarozzi - среда за облигатни анаеробни бактерии, французин R. Sabouraud, чех F. Chapek и американец A. Dox - среда за гъбички, бразилец R. Hottinger – среди с общо предназначение, базирани на смилане на месо и др. 26
Общи изисквания Съдържание на всички елементи за изграждане на микробна клетка Достатъчна влажност Осигуряване на изотония Определена концентрация на водородни йони Окислително-редукционен потенциал Стерилност
Основните фази на растеж на периодична култура: начална (лаг) - 1, експоненциална (или логаритмична) - 2, стационарна - 3, умираща - 4 (фиг. 12) Фиг. 12. Основните фази на растеж на микробната популация върху течни хранителни среди.
Характерът на растежа на микроорганизмите върху течни хранителни среди Ø Ø Ø Растеж на бактерии с равномерна мътност на средата, чийто цвят не се променя или се променя в съответствие с цвета на водоразтворимия пигмент, образуван в микробната култура; Дънен растеж на бактерии – образуване на утайка (оскъдна или обилна, ронлива, хомогенна, влакнеста и др.); Париетален растеж при запазване на прозрачността на хранителната среда; Повърхностен растеж на бактерии - филм върху повърхността на средата (тънък, деликатен, безцветен или влажен, дебел, ясно видим с невъоръжено око, плътен, сух с набръчкана и понякога брадавица); Цветът на филма, подобно на хранителната среда, зависи от пигмента, произведен от растящата микробна култура.
Естеството на растежа на микроорганизмите върху полутечни хранителни среди Тестовата култура се засява в колона с 0,2 - 0,5% полутечен агар. Определя се способността на микроорганизма да се движи - разпространение от мястото на инокулация (инжектиране) в околната среда чрез инжектиране в непосредствена близост до стената на епруветката.
Endo Differential Diagnostic Medium Състав: Основа – диференциален хранителен агар. фактор - лактоза Индикатор - основен фуксин, обезцветен с натриев сулфит Растеж на лактоза + колонии с червен цвят с метален блясък
Среда на Плоскирев Селективна, диференциално диагностична Състав: Основа – хранителен агар Селективен фактор – жлъчни соли, брилянтно зелено, йод Диф. фактор – лактоза Индикатор – неутрално червено Растеж на лактоза + колонии с цвят на боровинка
Солен агар Селективна среда Състав: Основа – хранителен агар Селективен фактор – сол 10% Индикатор – няма Растеж на устойчиви на сол колонии
Жълтъчно-солев агар (Чистович) Елективен, диагностичен Състав: Основа – хранителен агар Елективен фактор – сол 10% Диф. фактор – яйчен жълтък Индикатор – няма Растеж на колонии, устойчиви на сол + помътняване около колониите поради лецитовителазна активност
Тетратионатна среда на Мюлер-Кауфман Средата е предназначена за селективно обогатяване за откриване на бактерии от рода Salmonella Състав: Основа - хранителен бульон Селективен фактор - сол на селеновата киселина Индикатор - няма Растеж на бактерии, устойчиви на натриева солна киселина
Солен бульон Елективна среда Състав: Основа – хранителен бульон Елективен фактор – 6,5% Na. Индикатор Cl – няма растеж на устойчиви на сол микроорганизми
Естеството на растежа на микроорганизмите върху твърди хранителни среди. Основни характеристики: ü Размер – точен (≤ 1 mm) – голям (4 – 6 mm или повече); ü Форма - правилна (кръгла); неправилен (с форма на амеба), ризоид; ü Контури на ръба – гладки или неравни (назъбени, вълнообразни и др.) ü Релеф на колонията (куполовидни, плоско-изпъкнали, колонии с вдлъбнат център и др.) ü Повърхност на колонията (матова или лъскава (S-R- форми); ü Колония цвят (образуване на пигменти) ü структура на колонията (фина или груба гранула);
Пигментация на бактерии Червено-кафяво (продигиозин) Serratia marcessens Жълто-оранжево, (каротеноиди) Staphylococcus, Sarcina, M. tuberculosis родове Черно, кафяво (меланин) B. cubtilis, гъбички от рода Candida Blue (пиоцианин) P. aeruginosa Флуоресцентно жълто -зелен (пиовердин) Род Vibrio
Изолиране на чисти култури: инокулация върху селективна среда Bade-Parker за стафилококи. Растеж на микроорганизми, устойчиви на калиев телурит. Те го превръщат в метален телур и колонията става черна 
Изолиране на чисти култури: филтриране през мембранни филтри Микроорганизми върху филтъра Метални клетки за ядрени филтри
26. Бактериологичен метод за диагностика на инфекциозни заболявания.
Бактериологичният метод се състои в изолиране на чиста култура на патогена (популация, съдържаща бактерии от един вид) и идентифицирането на този патоген е основният метод на бактериологично изследване
Изследването на свойствата на микроорганизмите в бактериологична лаборатория с цел установяване на принадлежност към една или друга систематична група (вид, род) се нарича тяхната идентификация.
Като цяло бактериологичният метод на изследване е многоетапно бактериологично изследване, което продължава 18-24 часа.
С бактериологичния метод анаеробните култури се поставят в анаеростата. Въздухът се отстранява от балона и се заменя с газова смес, която не съдържа кислород.
Основата на бактериологичния метод е изолирането на чиста култура на патогена, което се случва на първия етап от изследването. За да изолирате чиста култура на патогена, инокулирайте взетия материал. Засяването обикновено се извършва върху твърди хранителни среди, които се избират въз основа на свойствата на предполагаемия патоген.
При бактериологичния метод, когато е възможно, се използват среди, върху които растат само определен вид бактерии - селективни среди или среди, които позволяват да се разграничи предполагаемият патоген от други микроорганизми или, с други думи, диференциално диагностични среди.
При бактериологичния метод материалът се инокулира върху хранителна среда с помощта на стъклена или метална шпатула или бактериална примка по такъв начин, че бактериите, присъстващи в изследвания материал, да бъдат разпръснати по повърхността на хранителната среда. В резултат на такова разпръскване всяка бактериална клетка се озовава в собствената си зона на околната среда.
Ако в резултат на бактериологичния метод на изследване се очаква тестваният материал да съдържа малко количество от патогена, инокулацията се извършва върху течна хранителна среда за натрупването му, така наречената среда за обогатяване, която е оптимална за даден микроорганизъм. След това се извършва повторно засяване от течната хранителна среда върху твърда среда, излята в петриеви панички. Посятата с патогена среда се поставя в термостат, обикновено при определена температура, която е важна за бактериологичния метод.
На втория етап от бактериологичния метод на изследване се изследват бактериални колонии, отглеждани върху твърда хранителна среда и произхождащи от една бактериална клетка. (колонията е чиста култура на патогена). Микроскопското и макроскопско изследване на колониите се извършва в отразена и пропусната светлина: с невъоръжено око, под микроскоп с малко увеличение, с помощта на лупа.
Отбелязват се културните свойства на колониите: тяхната форма, размер, цвят, характер на ръбовете и повърхността, структура, консистенция. След това част от всяка от предвидените колонии се използва за приготвяне на намазки. Натривките се оцветяват по Грам и се микроскопират, като се определят тинкториалните (отношение към цвета) и морфологичните свойства на изолираната култура и същевременно се проверява нейната чистота.
Останалата част от колонията се субкултивира в епруветки с оптимална среда за даден вид, например наклонен агар, за да се натрупа чиста култура за по-пълно изследване. Епруветките се поставят в термостат за 18-24 часа. На втория етап, в допълнение към изброените изследвания, често се преброява броят на отглежданите колонии.
За да се проведе такова изследване, се приготвят последователни разреждания на взетия тестов материал, от които се посяват върху блюда с хранителна среда, броят на порасналите колонии се преброява, умножава се по разреждането, от което се установява съдържанието на микроорганизми в материалът се определя.
Идентифицирането на изолирана чиста култура на патогена и определянето на чувствителността към антибиотици и други химиотерапевтични лекарства за тази култура е третият етап от бактериологичния метод. Идентифицирането на изолираната бактериална култура се извършва чрез тинкториални, морфологични, биохимични, културни, токсигенни, антигенни свойства.
Първата стъпка е да се вземе цитонамазка от културата, отгледана върху наклонения агар, да се изследва морфологията на бактериите и да се провери чистотата на културата от отглежданите бактерии. След това изолираната чиста култура от бактерии се инокулира върху среда на Hiss. Препоръчително е да се инокулира върху други среди, за да се определят биохимичните свойства.
Използвайки реакцията на неутрализация на токсина с антитоксин in vivo или in vitro, се определя производството на токсини от микроби. В някои случаи се изследват и други вирулентни фактори. Горните изследвания, които се провеждат в бактериологична лаборатория, позволяват да се определи рода или вида на патогена.
Методът на хартиения диск се основава на идентифициране на зона на потискане на бактериалния растеж около дискове, които са импрегнирани с антибиотици. В случай на използване на метода на серийно разреждане, химичен препарат - антибиотик с течна хранителна среда се разрежда в епруветки, след което същият брой бактерии се инокулират в епруветките. Резултатите се записват въз основа на липсата или наличието на бактериален растеж. В резултат на метода на бактериологично изследване за определяне на идентичността на щамовете, получената антибиограма може да служи и за епидемиологични цели.
При установяване на бактериално носителство могат да се извършват повторни изследвания, тъй като патогенът може да не бъде открит в една част от материала.
10385 0
Използването на бактериологичния метод позволява да се изолира патогенът в чиста култура от материал, получен от пациента, и да се идентифицира въз основа на изследването на набор от свойства. Повечето бактерии са способни да се култивират върху различни изкуствени хранителни среди (с изключение на хламидия и рикетсия), поради което бактериологичният метод е важен при диагностицирането на много инфекциозни заболявания.
Ако се получи положителен резултат, бактериологичният метод позволява да се определи чувствителността на изолирания патоген към антимикробни лекарства. Ефективността на това изследване обаче зависи от много параметри, по-специално от условия за събиране на материали него транспортдо лабораторията.
ДА СЕ основни изискванияизискванията за подбор и транспортиране на материал за бактериологично изследване включват:
- вземане на материал преди началото на етиотропното лечение;
- спазване на стерилни условия при събиране на материал;
- техническа изправност на материалния сбор;
- достатъчно количество материал;
- осигуряване на температурни условия за съхранение и транспортиране на материала;
- минимизиране на интервала от време между събирането на материал и засяването върху твърди хранителни среди.
Транспортирането на материала до лабораторията трябва да се извърши възможно най-скоро, но не повече от 1-2 часа след вземането му. Пробите от материали трябва да се съхраняват при определена температура; по-специално, обикновено стерилни материали (кръв, цереброспинална течност) се съхраняват и доставят в лабораторията при 37 °C. Нестерилните материали (урина, респираторни секрети и др.) се съхраняват на стайна температура за не повече от 1-2 часа или не повече от едно денонощие при 4 °C (условия на домашен хладилник). Ако е невъзможно да се доставят проби в лабораторията в рамките на регламентирания срок, се препоръчва използването на транспортни среди, предназначени да запазят жизнеспособността на патогените при условия на съхранение.
Кръв за изследванетрябва да се вземе от пациента в периода на повишаване на телесната температура, в началото на началото на треската. Препоръчително е да се изследват 3-4 кръвни проби, взети на интервали от 4-6 часа, което е оправдано от гледна точка на намаляване на риска от „липсваща“ преходна бактериемия и повишаване на способността за потвърждаване на етиологичната роля на изолирана опортюнистична микрофлора от кръвта, ако тази микрофлора се открие в няколко проби от венозна кръв. Кръвна проба в количество 10 ml за възрастен и 5 ml за деца се посява в най-малко две бутилки със среда за аеробни и анаеробни микроорганизми в съотношение 1:10. Препоръчва се едно изследване на артериална кръв.
Предприеме гръбначно-мозъчна течност(CSF) се произвежда от лекар по време на лумбална пункция в количество от 1-2 ml в суха стерилна епруветка. Пробата веднага се доставя в лабораторията, където веднага започва и нейното изследване. Ако това не е възможно, материалът се съхранява при 37 °C за няколко часа. Значително увеличава броя на положителните резултати от бактериологичното изследване чрез инокулиране на 1-2 капки CSF в епруветка, съдържаща полутечна среда с глюкоза и в петриево блюдо с "кръвен" агар. За изпращане на материала използвайте изотермични кутии, нагревателни подложки, термоси или други опаковки, където температурата се поддържа около 37 °C.
Екскретиза бактериологично изследване 3-5 g се вземат със стерилни дървени шпатули в стерилен съд с плътно затварящ се капак. Изследването на събрания материал трябва да започне не по-късно от 2 часа. Ако не е възможно да започне изследването в рамките на това време, трябва да се вземе малко количество материал и да се постави в подходяща транспортна среда. Когато събирате изпражнения, трябва да се стремите да изпратите патологични примеси (слуз, гной, епителни частици и др.) За изследване, ако има такива, като избягвате въвеждането на кръвни примеси, които имат бактерицидни свойства, в материала.
За вземане на материал могат да се използват ректални тампони (с памучен накрайник). Тампонът трябва да се навлажни със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид или транспортна среда (но не маслен гел). Въвежда се през ректума на дълбочина 5-6 см и, като завъртите тампона, внимателно го отстранете, като наблюдавате появата на фекален цвят върху тампона. Тампонът се поставя в суха епруветка, ако изследването на материала започне в рамките на 2 часа, в противен случай - в транспортна среда.
пикая(средна порция свободно отделена урина) в количество 3-5 мл се събира в стерилен съд след щателна тоалетна на външните полови органи. За предпочитане е урината да се събира сутрин.
Жлъчкасъбрани по време на дуоденална интубация в лечебната зала поотделно на порции A, B и C в три стерилни епруветки, като се спазват правилата за асептика.
Вода за стомашна промивкасъбрани в стерилни буркани в количество от 20-50 мл. Трябва да се има предвид, че в тези случаи стомашната промивка се извършва само с индиферентни (без бактериостатичен или бактерициден ефект върху микроорганизмите) разтвори - за предпочитане преварена вода (без добавяне на сода, калиев перманганат и др.).
храчки. Сутрешната храчка, отделена по време на пристъп на кашлица, се събира в стерилен буркан. Преди кашляне пациентът мие зъбите си и изплаква устата си с преварена вода, за да отстрани механично остатъците от храна, десквамирания епител и оралната микрофлора.
Бронхиална промивна вода. По време на бронхоскопия се инжектират не повече от 5 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид, последвано от засмукване в стерилна тръба.
Секреция от фаринкса, устата и носа. Материал от устната кухина се взема на гладно или 2 часа след хранене със стерилен памучен тампон или лъжица от лигавицата и засегнатите от нея участъци на входовете на каналите на слюнчените жлези, повърхността на езика и от язви. Ако има филм, отстранете го със стерилна пинсета. Материалът от носната кухина се взема със сух стерилен памучен тампон, който се вкарва дълбоко в носната кухина. Материал от назофаринкса се взема със стерилен заден фарингеален памучен тампон, който внимателно се вкарва през носния отвор в назофаринкса. Ако започне кашлица, тампонът не се отстранява, докато кашлицата не премине. За изследване за дифтерия филмите и слузта от носа и гърлото се изследват едновременно, като материалът се взема с различни тампони.
Тестовият материал се инокулира върху твърди хранителни среди, като се използват специални техники за получаване на растеж на отделни колонии от микроорганизми, които след това се отсяват, за да се изолира чиста култура на патогена.
Някои видове бактерии се изолират с помощта на селективни среди, които инхибират растежа на чужди микроорганизми или съдържат вещества, които стимулират растежа на определени патогенни микроби.
Микроорганизми, изолирани върху хранителни среди идентифицирам, т.е. определя техния вид или тип. Напоследък за идентификация в здравната практика се използват микротест системи, които представляват панели с набор от диференциално диагностични среди, което ускорява изследването. Микротест системите се използват и за определяне на чувствителността на микроорганизмите към антимикробни лекарства чрез разреждане на антибиотика в течна хранителна среда.
При оценка на резултатите от бактериологичното изследване лекарят трябва да вземе предвид, че отрицателният резултат не винаги означава липса на патоген и може да бъде свързан с употребата на антимикробни лекарства, висока микроцидна активност на кръвта и технически грешки. Откриването на патогенен микроб в материал от пациент, независимо от клиничната картина, е възможно при реконвалесцентно, здраво или преходно бактериално носителство.
Изолирането от кръвта, при спазване на всички асептични правила, на опортюнистични микроорганизми (staphylococcus epidermidis, Escherichia coli) и дори сапрофити трябва да се счита за проява на бактериемия, особено ако тези микроби се открият в повече от една проба от материал или в различни субстрати ( кръв, урина), тъй като чрез намаляване на имунореактивността на организма, тези и други „непатогенни“ микроорганизми могат да бъдат причинители на инфекциозни процеси, включително сепсис.
Има известна трудност интерпретация на резултатите от бактериологично изследване на нестерилни среди, а именно доказателство за етиологичната роля на опортюнистични микроорганизми. В този случай се вземат предвид такива показатели като вида на изолираните култури, броя на микробните клетки от даден тип в материала, повторното им изолиране по време на заболяването, наличието на монокултура или асоциация на микроорганизъм.
Юшчук Н.Д., Венгеров Ю.Я.