Имунофлуоресцентната реакция (RIF) е серологична реакция, която позволява откриването на антитела срещу известни антигени. Методът включва микроскопия на оцветени петна.
Тази реакция се използва в имунологията, вирусологията и микробиологията. Позволява ви да определите наличието на вируси, бактерии, гъбички, протозои и ICC. RIF се използва много широко в диагностичната практика за откриване на вирусни и бактериални антигени в инфекциозен материал. Методът се основава на способността на флуорохрома да се свързва с протеини, без да нарушава тяхната имунологична специфичност. Използва се главно при диагностика на инфекции на пикочните пътища.
Има следните методи за провеждане на реакцията на имунофлуоресценция: директен, индиректен, с комплемент. Директният метод включва оцветяване на материала с флуорохроми. Поради способността на микробните или тъканните антигени да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп, те се определят като клетки с ярко оцветена зелена граница.
Индиректният метод включва определяне на комплекса антиген + антитяло. За да направите това, експерименталният материал се третира с антитела от антимикробен заешки серум, предназначен за диагностика. След като антителата се свържат с микробите, те се отделят от тези, които не са се свързали и се третират с белязан с флуорохром анти-заешки серум. След това комплексът от микроби + анимикробни антитела + анти-заешки антитела се определя с ултравиолетов микроскоп по същия начин, както при директния метод.
Реакцията на имунофлуоресценция е незаменима при диагностицирането на сифилис. Под въздействието на флуорохром, причинителят на сифилис се идентифицира като клетка с жълто-зелена граница. Липсата на луминисценция означава, че пациентът не е заразен със сифилис. Този тест често се предписва за положителна реакция на Васерман. Този метод е много ефективен при диагностицирането, тъй като ви позволява да идентифицирате патогена в ранните стадии на заболяването.
В допълнение към факта, че RIF ви позволява да диагностицирате сифилис, той се използва и за определяне на наличието на патогени като хламидия, микоплазма, трихомонада, както и патогени на гонорея и генитален херпес.
За анализ се използват цитонамазки или венозна кръв. Процедурата по вземане на цитонамазка е напълно безболезнена и не представлява никаква опасност. Необходимо е да се подготвите за този анализ. Дванадесет часа преди това не се препоръчва използването на хигиенни продукти като мало или гелове. Също така понякога, според показанията на лекаря, се извършва провокация. За да направите това, се препоръчва да се консумират пикантни храни или алкохол или да се инжектира провокиращо вещество, като гоновакцин или пирогенал. Освен това интервалът между приема на антибактериални лекарства и вземането на теста трябва да бъде най-малко четиринадесет дни.
При оценката на резултатите трябва да се вземе предвид фактът, че луминесценцията се наблюдава не само при живи бактерии, но и при мъртви, особено за хламидиите. След курс на антибиотици мъртвите клетки на хламидиите също светят.
При правилна подготовка на пациента и спазване на техниката на намазка, този анализ ви позволява да идентифицирате заболяванията в ранните етапи, което е много важно за навременното лечение. Положителните страни на този метод са краткото време за получаване на резултати, лекотата на прилагане и ниската цена на анализа.
Недостатъците включват факта, че за извършване на анализа е необходимо доста голямо количество тестов материал. Освен това само опитен специалист трябва да оцени резултатите.
Съдържание на темата "Реакции на утаяване (RP). Имуноелектрофореза. Комплексни имунодиагностични реакции.":Имуноблотинг[от англ blot, spot] - метод за идентифициране на Ag (или AT) с помощта на съответните известни серуми (или Ag). На практика те се използват за идентифициране на HIV Ag. Първоначално вирусът Ag се изолира чрез електрофореза в полиакрилен гел (на практика тази процедура не се извършва, а се използва търговски реактив). След това върху лентите с утайка се нанася носител (нитроцелулозен филм или активирана хартия) и електрофорезата продължава. След това серумът на пациента се нанася върху филма и се инкубира.
След отмиване на несвързания AT (ако има такъв), извършете ELISA- антисерум срещу човешки Ig, белязан с ензим, и хромогенен субстрат, който променя цвета си при взаимодействие с ензима, се нанася върху филма. При наличие на Ag-AT-антисерумни комплекси към Ig върху носителя се появяват цветни петна (фиг. 10-20).
ориз. 10-20. ИмуноблотингИмунофлуоресцентна реакция (RIF)
Реакция на имунофлуоресценция (РИФ) е разработен от A. Koons (1941) и се основава на използването на АТ, белязан с флуорохромни багрила. Такива АТ, чрез свързване на различни Ag, карат имунните комплекси да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп. На практика се използват няколко варианта РИФ.
Имунофлуоресцентният метод (RIF, имунофлуоресцентна реакция, реакция на Coons) е метод за откриване на специфични антигени с помощта на антитела, конюгирани с флуорохром. Има висока чувствителност и специфичност.
Използва се за експресна диагностика на инфекциозни заболявания (идентифициране на патогена в тестовия материал), както и за определяне на АТ и повърхностни рецептори и маркери на левкоцити (иммунофенотипизиране) и други клетки.
Откриването на бактериални и вирусни антигени в инфекциозни материали, животински тъкани и клетъчни култури с помощта на флуоресцентни антитела (серуми) се използва широко в диагностичната практика. Приготвянето на флуоресцентни серуми се основава на способността на определени флуорохроми (например флуоресцеин изотиоцианат) да влизат в химическа връзка със серумните протеини, без да се нарушава тяхната имунологична специфичност.
Има три вида метод: пряк, косвен, с допълнение. Директният RIF метод се основава на факта, че тъканните антигени или микроби, третирани с имунни серуми с антитела, маркирани с флуорохроми, могат да светят в UV лъчите на флуоресцентен микроскоп. Бактериите в намазка, обработена с такъв луминисцентен серум, светят по периферията на клетката под формата на зелена граница.
Индиректният RIF метод включва откриване на комплекса антиген-антитяло с помощта на антиглобулин (анти-антитела) серум, белязан с флуорохром. За да направите това, петна от суспензия от микроби се третират с антитела от антимикробен заешки диагностичен серум. След това антителата, които не са свързани с микробните антигени, се измиват и антителата, останали върху микробите, се откриват чрез третиране на намазката с антиглобулинов (анти-заешки) серум, белязан с флуорохроми. В резултат на това се образува комплекс от микроб + антимикробни заешки антитела + анти-заешки антитела, белязани с флуорохром. Този комплекс се наблюдава във флуоресцентен микроскоп, както при директния метод.
Механизъм. Намазка от тестовия материал се приготвя върху предметно стъкло, фиксира се върху пламък и се третира с имунен заешки серум, съдържащ антитела срещу антигени на патогена. За да се образува комплекс антиген-антитяло, препаратът се поставя във влажна камера и се инкубира при 37 °C в продължение на 15 минути, след което се промива старателно с изотоничен разтвор на натриев хлорид, за да се отстранят антителата, които не са се свързали с антигена. След това към препарата се прилага флуоресцентен антиглобулинов серум срещу заешки глобулини, инкубира се 15 минути при 37 °C и след това препаратът се промива старателно с изотоничен разтвор на натриев хлорид. В резултат на свързването на флуоресцентен антиглобулинов серум със специфични антитела, фиксирани върху антигена, се образуват светещи комплекси антиген-антитяло, които се откриват чрез флуоресцентна микроскопия.
22. Ензимен имуноанализ- лабораторен имунологичен метод за качествено или количествено определяне на различни съединения, макромолекули, вируси и др., който се основава на специфична реакция антиген-антитяло. Идентифицирането на образувания комплекс се извършва с помощта на ензима като етикет за запис на сигнала.
Класификация:
Конкурентен (системата съдържа едновременно анализираното съединение и неговия аналог)
Неконкурентен (ако само анализираното съединение и съответните му свързващи центрове (антиген и специфични антитела) присъстват в системата)
Пряко и косвено
1. серумът, съдържащ смес от антитела, се инкубира с антитела, фиксирани върху твърд субстрат.
2.при които не се свързват аг се отстраняват чрез многократно измиване.
3. добавете ензимно маркиран антисерум към антитялото, което свързва антитялото
4. определяне на количеството маркерен ензим, свързан с at
Непряко:
Ab-положителен серум
1.специфичните антитела в тестовия серум свързват антитела, фиксирани върху твърд субстрат
2. специфичните антитела, маркирани с ензима, не взаимодействат със свързаните антитела; съдържанието на маркера в субстрата е ниско
Ab-отрицателен серум
1. Неспецифичните антитела в тестовия серум не свързват антитела, фиксирани върху твърд субстрат
2. Специфични антитела, маркирани с ензима, взаимодействат с фиксирано антитяло – съдържанието на маркер е високо
Най-често срещаният е твърдофазният IFA, при който един от компонентите на имунната реакция (антиген или антитяло) се сорбира върху твърд носител. Като твърд носител се използват микропанели от полистирен. При определяне на антитела кръвният серум, маркиран с ензим, и смес от разтвори за ензима и хромогена се добавят последователно към ямките със сорбиран антиген. Всеки път след добавяне на друг компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез щателно измиване. Ако резултатът е положителен, цветът на хромогенния разтвор се променя.
Твърдофазовият носител може да бъде сенсибилизиран не само с антиген, но и с антитяло. След това желаният антиген се добавя към ямките със сорбирани антитела, добавя се имунен серум срещу антигена, маркиран с ензим, и след това се добавя смес от разтвори на субстрата за ензима и хромогена.
Приложение:за диагностициране на заболявания, причинени от вирусни и бактериални патогени.
23. Серологична реакция- реакция, чрез която се изследва реакцията на антиген (микроб, вирус, чужд протеин) с антитела от кръвен серум.
Серологични изследвания- това са методи за изследване на определени антитела или антигени в кръвния серум на пациенти, базирани на имунни реакции. Те се използват и за откриване на антигени на микроби или тъкани с цел тяхната идентификация.
Откриването на антитела срещу инфекциозния агент или съответния антиген в кръвния серум на пациента ни позволява да установим причината за заболяването.
Серологичните изследвания се използват и за определяне на антигените на кръвната група, тъканните антигени и нивото на хуморалния имунитет.
Серологичните изследвания включват различни серологични реакции:
1. Реакция на аглутинация.
2. Реакция на утаяване.
3. Реакция на неутрализация.
4. Реакция с участието на комплемента.
5. Реакция с използване на белязани антитела или антигени.
Реакция на имобилизация на Treponema pallidum(RIBT). Задължително условие е преди изследването пациентът да не е приемал антибиотици, които оказват токсично действие върху Treponema pallidum, причинявайки неспецифичното им обездвижване.
Положителните резултати от RIBT се откриват приблизително от средата на вторичния пресен период на сифилис и могат да продължат дълго време след лечението. Ако е необходимо, методът се използва за откриване на AT в CSF; изследването се характеризира с висока специфичност, но ниска чувствителност (около 40%).
RIBT е малко полезен за диагностициране на ранни форми на сифилис поради късното (не по-рано от 8-9 седмици от момента на инфекцията) появата на AT-иммобилизини; методът може да даде фалшиво положителни резултати, особено при пациенти с автоимунна патология, злокачествени заболявания и диабет. Освен това RIBT е доста сложен, трудоемък и скъп анализ, който изисква висококвалифициран персонал и наличие на вивариум, поради което през последните години се използва само в определени лаборатории. В диагностиката RIBT се използва като реакционен арбитър, когато има несъответствия в резултатите от други серологични изследвания, за разграничаване на фалшиво положителни резултати и при установяване на диагноза на късни форми на сифилис.
Реакция на фиксиране на комплемента с трепонемален антиген (RSC с TA)Чувствителността на метода е около 80%, специфичността е 98%. Методът е част от набор от стандартни серологични реакции за сифилис, регламентиран със Заповед на Министерството на здравеопазването на СССР № 1161 от 2 септември 1985 г. „За подобряване на серологичната диагностика на сифилис“. Понастоящем използването на тази реакция, подобно на CSC с кардиолипин антиген, е ограничено до отделни лаборатории.
Имунофлуоресцентна реакция (RIF). За диагностициране на сифилис се използват няколко модификации на RIF: RIF-c - за откриване на AT в CSF, RIF-200 (тестовият серум се разрежда 200 пъти преди реакцията); RIF-abs (RIF с абсорбция), IgM-RIF-abs (за определяне на IgM AT). По отношение на чувствителността и специфичността RIF-abs не отстъпва на RIBT, но прилагането на този метод е много по-просто. Резултатите от RIF-abs стават положителни от 3-та седмица след инфекцията (преди появата на шанкроида или едновременно с него), това е метод за ранна диагностика на сифилис. Положителните резултати от изследването често се откриват много години след пълно лечение на ранен сифилис, а при пациенти с късен сифилис - в продължение на десетилетия.
Показания за извършване на RIF-abs:
- положителни резултати от НТТ при бременни жени при липса на клинични и анамнестични данни, показващи сифилис;
- преглед на лица с различни соматични и инфекциозни заболявания, при които се отбелязват положителни резултати от НТТ;
- изследване на лица с клинични прояви, характерни за сифилис, но с отрицателни резултати от НТТ;
- ранна диагностика на сифилис;
- в някои случаи - като критерий за успех на антисифилитичното лечение: преминаването на положителен RIF-abs към отрицателен след лечението е 100% критерий за излекуване на сифилис.
IgM-RIF-abs се използва за отделно откриване на антитела от Ig класове, което е от особен интерес при диагностицирането на вроден сифилис, когато антителата срещу трепонема, синтезирани в тялото на детето, са представени от IgM, а IgG антителата са от майката. произход. Показания за това изследване са: диагностика на вроден сифилис; оценка на резултатите от лечението на ранен сифилис.
RIF има висока чувствителност (98,5%) и специфичност (99,6%) за почти всички форми на сифилис. Недостатъците на РИФ са: невъзможност за автоматизиране на изследването и записване на резултатите; трудности при приготвянето на висококачествен антиген от суспензия на Treponema pallidum, получена от тестис на заразен заек; субективизъм при оценката на резултатите.
Реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA). Сравнението на резултатите, получени с помощта на RPGA и RIBT, RIF-abs, CSR, MRP показа висока чувствителност и специфичност на RPGA при диагностицирането на сифилис, съвпадащи с резултатите от RIF-abs.
RPGA могат да бъдат изпълнени в качествени и количествени варианти; Количественият метод RPGA позволява да се оцени концентрацията на специфични трепонемни антитела в кръвта. Титри от 1:640 и по-ниски са типични за пациенти, лекувани в миналото за сифилис. По-високите титри са обичайни за активна, нелекувана инфекция.
Положителните резултати от RPGA обикновено се отбелязват 3 седмици след появата на шанкра и след това при пациенти, които са имали сифилис в продължение на много години, често за цял живот.
Чувствителността на RPGA е 76% за първичен сифилис; 100% за вторичен сифилис; 97% за латентен сифилис; 94% за късен сифилис. Специфичността на RPGA е по-висока от специфичността на RIF–abs, като е 99%.
Поради съотношението на висока специфичност, чувствителност, лекота на изпълнение и стандартизация на реагентите сред трепонемните тестове за серодиагностика на сифилис, RPGA постоянно заема водещо място в клиничната практика в света.
Специални предимства на ELISAса: висока чувствителност и специфичност на метода; автоматизация на настройката на реакцията; висока степен на стандартизация; възможност за изследване на голям брой серумни проби; в количествено отчитане и обективно документиране на получените резултати; възможността за едновременно определяне на титъра на антитрепонемни антитела от различни класове (IgG и IgM) в една проба; пригодност за ранна диагностика на сифилис и диагностика на вроден сифилис; в лесна употреба за изследване на кръв в службата за кръвопреливане; приложимост като потвърдителен специфичен трепонемален тест. Чувствителността на ELISA е 98–100%, специфичността е 96–100%.
Недостатъците на ELISA включват: непригодност за изследване на единични проби; по-дълъг период преди получаване на резултата и по-кратък срок на годност на комплектите ELISA, например, в сравнение с RPGA.
Имунен блот (IB).Един от съвременните методи за диагностициране на сифилис е IB за определяне на IgG или IgM антитела към определени антитела на Treponema pallidum.
Методът има висока чувствителност (до 100%), специфичност (98%) и възпроизводимост (100%). Изследването дава възможност да се изследва спектърът от антитела към няколко антигена на T. pallidum наведнъж, като се използват високо пречистени рекомбинантни и пептидни антигени, които намаляват неспецифичната серумна реактивност до минимум.
Всичко това определя възможността за предпочитане на използването на метода IB пред други трепонемни тестове за проверка на диагнозата сифилис в трудни случаи, по-специално за диагностициране на сифилис през втората половина на инкубационния период, латентен вроден сифилис в първите дни на живота на детето, за идентифициране на латентен сифилис при лица със слаб хуморален отговор, както и за разграничаване на фалшиво положителни резултати от други тестове.
Предложен и развит от Koons (1942). Използвайки специфични имуноглобулини, маркирани с флуорохром, в тестовия материал (намазки, тъканни среди) се откриват бактериални, вирусни и други антигенни вещества. Когато белязано антитяло се комбинира с микробен или друг антиген, се образува светещ комплекс, който се вижда под флуоресцентен микроскоп.
Има директни и индиректни методи на имунофлуоресценция.
Директен метод. От тестовия материал се приготвя цитонамазка, върху която се нанася специфичен флуоресцентен серум и след като антитялото се свърже с антигена, излишният серум се отмива и препаратът се разглежда под флуоресцентен микроскоп.
Индиректен (двуетапен) метод.Приготвената цитонамазка първо се третира с неоцветен имунен серум към очаквания антиген. След свързване на антигена с антитялото, върху намазката се нанася антивидов флуоресцентен серум (антиглобулин) от животното от същия вид, от който е получен неоцветеният имунен серум. В резултат на това анти-видовият флуоресцентен серум се адсорбира върху комплекса антиген-антитяло и комплексът свети в луминесцентен микроскоп със светло зелено (FIT) или червено (RSX) - флуоресцеин изоцианат и родамин сулфонил хлорид.
Има индиректен метод, използващ антикомплементарния серум.
Понастоящем все повече се използва методът за маркиране на антитела с ензими, разсейващи светлината (например пероксидаза от хрян) - ELISA. Имунните комплекси могат да бъдат открити под конвенционален микроскоп със светло поле.
3. Антигенните реакции със сенсибилизирани лимфоцити се наричат. клетъчен. Алергичната диагностика е от най-голямо значение сред имунодиагностичните методи, използващи проявите на клетъчния имунитет. Това е диагностика на инфекциозни заболявания с помощта на реакции, които разкриват повишената чувствителност на клетките и тъканите на тялото към специфични инфекциозни алергени. Инфектираният организъм реагира на въвеждането на алерген (в кожата, под кожата, върху лигавиците) с алергична реакция, която се проявява като локална (хиперемия, подуване, болезненост) или обща (депресия, повишена телесна температура, повишена дишане, нарушена сърдечна дейност) феномен. При неинфектирано тяло такива явления не се наблюдават при въвеждане на алерген.
Практическата стойност на диагностиката на алергиите се състои в нейната висока специфичност, възможността за интравитална диагностика, лекотата на прилагане и способността за идентифициране на пациенти при липса на клинични признаци.
Алергичните тестове са широко използвани за сап, туберкулоза, бруцелоза, паратуберкулоза, туларемия, епизоотичен лимфангит, антракс и др. Използват се алергени (вещества с антигенна или хаптенова природа, които причиняват алергии). Алергените се произвеждат корпускулярно (състоят се от бактерии в суспензия) и лизирани (екстракти от бактериални култури). Примери:
Малеинът е стерилен филтрат от топлинно умъртвена бульонна култура на патогена на сапа, прилаган чрез приложение върху лигавицата на окото или чрез подкожно инжектиране.
PPD туберкулин за бозайници и PPD туберкулин за птици, състоящ се от лиофилизирани утаени протеини от културния филтрат на причинителя на туберкулозата на говедата и човека в първия случай. PPD туберкулинът за птици е аналог на PPD туберкулин за бозайници, но се приготвя от щамове на причинителя на туберкулозата по птиците. Използват се предимно на закрито.
Brucellin VIEV е опалесцираща течност, съдържаща специфични вещества, извлечени от Brucella, прилагани подкожно и интравенозно.
Туларин - представлява суспензия от туларемични микроби във физиологичен разтвор с добавяне на 3% глицерол, отглеждани върху твърда хранителна среда, убити чрез нагряване. Тест с него се прави както венозно, така и кожно (при хора).
Антраксин (е продукт на хидролиза на ваксина срещу антракс щам STI-1.
Използват се и други феномени на клетъчния имунитет. например, реакция на бластна трансформация на левкоцитите (BLTR)– преминаване на малките лимфоцити в бластни форми, способни на пролиферация и по-нататъшна диференциация на т.нар. бластна трансформация и се придружава от морфологични промени в лимфоцитите. Бластите са големи, заоблени клетки с голямо ядро, което заема по-голямата част от цитоплазмата. Ядрото съдържа няколко големи базофилни нуклеоли, цитоплазмата на бластите е гранулирана. RBTL се изследва в култура от лимфоцити in vitro под въздействието на антиген, към който са сенсибилизирани лимфоцитите, чрез директно преброяване на бласти в оцветени препарати под микроскоп.
Реакция на инхибиране на миграцията на макрофагите– се крие във факта, че лимфоцитите на сенсибилизиран организъм, в присъствието на специфичен антиген в хранителната среда, произвеждат лимфокин, фактор, който инхибира миграцията на макрофагите.
И други (прочетете сами): феноменът на образуване на розетка, образуване на плака.
Възпроизвеждане на вируса на сова
Методът на възпроизвеждане на вирусите също се различава от деленето, пъпкуването, спорулацията или половия процес, който се случва в едноклетъчните организми, в клетките на многоклетъчните организми и в последните като цяло. Възпроизвеждането или репликацията, както обикновено се нарича възпроизвеждането на вируси, се извършва дизюнктивно (последният термин сега е по-често загатнат, отколкото използван). Образуването на вириони става или чрез самосглобяване (опаковане на вирусната нуклеинова киселина в протеинов капсид и по този начин образуване на нуклеокапсид), или с участието на клетката (някои микоплазмени фаги, съдържащи липиди), или и двата метода (вируси с обвивка ). Разбира се, противопоставянето между митотичното клетъчно делене и репликацията не е абсолютно, тъй като методите за репликация на генетичния материал на клетката и ДНК-съдържащите вируси не са фундаментално различни и ако вземем предвид, че синтезът на генетичен материал в РНК-съдържащите вируси също се извършват според вида на шаблона, тогава е относителен контраст между митозата и репликацията на всички вируси. И въпреки това разликите в методите на възпроизвеждане на клетките и вирусите са толкова значителни, че има смисъл целият жив свят да се раздели на вируси и невируси.
Много други понятия, които са „атрибути“ на организмите, не са приложими за вирусите и преди всичко такива фундаментални понятия като „индивид“, „популация“, „вид“.
Обичайно е понятието „вирион“ да се тълкува като вирусен индивид, въпреки че вирионът е само определен етап от живота на вируса и точно етапът, на който вирусът не проявява жизнена активност. Поради това дори беше предложено този етап от съществуването на вируса да се нарече вироспора. Междувременно има няколко групи вируси, при които геномът е не само фрагментиран (това се случва и в еукариотните клетки, чийто геном е дискретен и съществува като сбор от хромозоми), но също така неговите различни фрагменти са разделени и са разположени в различни частици. Вирусът проявява инфекциозни свойства само когато получи пълен набор от различни частици, чийто брой при растителните вируси е 2-4, а при някои вируси на насекоми до 28. Какво е вирусен индивид в тези случаи, когато дори понятието на “вирион” не може да се приложи?
Преминавайки към анализа на активния живот на вируса, който се свежда изцяло до неговото размножаване, откриваме, че мястото на вириона, който е проникнал в клетката, се заема или от неговата гола нуклеинова киселина (например при полиомиелитния вирус ), или от нуклеопротеинов комплекс (например в грипния вирус), или по-сложни субвирионни структури (например в реовирус). Тогава се получава синтез на дъщерни молекули на вирусния геном. В много ДНК-съдържащи вируси този процес е не само подобен на синтеза на клетъчни ДНК хромозоми, но също така се осигурява до голяма степен, а понякога почти изцяло, от клетъчни ензими. Освен това това се случва не само при образуването на прости и малки вируси (паповавируси, парвовируси), но и при синтеза на сложни вируси с голям геном (херпесни вируси, иридовируси), при които определена част от синтеза на ДНК се катализира от техните собствени ензими. Репликативните междинни продукти, образувани в този случай, трудно могат да бъдат характеризирани като вирусни индивиди: това са матрици, върху които се синтезират множество копия на дъщерните геноми на вируса. За вируси с едноверижен РНК геном те са или информационно безсмислени, т.е. не кодират съответните вирус-специфични протеини (вируси с положителна полярност на генома), или, напротив, съдържат гени за вирусни протеини, т.к. вирионната РНК няма кодиращи свойства.
Заедно с производствения цикъл, някои ДНК-съдържащи вируси (умерени фаги, паповавируси, вирус на хепатит В и др.) Могат да влязат в интегративно взаимодействие с клетъчния геном, ковалентно интегрирайки се в него и превръщайки се в група от клетъчни гени, които се предават към клетките-потомци (при еукариотите) според законите на Менделеев. В това състояние интегрираният вирусен геном, наричан провирус, всъщност е група от клетъчни гени. Ако възникне мутация в провирус, която прави невъзможно „отрязването“ на вирусния геном от клетъчния геном, такъв дефектен провирус може завинаги да стане неразделна част от генома. Много данни ни позволяват да заключим, че геномите на про- и еукариотите съдържат интегрирани гени или геноми на бивши независими вируси.
Съществува голяма група РНК-съдържащи ретровируси, при които върху матрицата на техния геном се синтезира комплементарна ДНК. Тя, под формата на двойноверижна ДНК, е интегрирана (ковалентно вмъкната) в клетъчния геном и в този вид е матрица за синтеза на дъщерни молекули на вирионна РНК и иРНК за синтеза на вирусни протеини. И в двата случая (интегрируеми ДНК-съдържащи вируси, ретровируси) образуваният по този начин провирус се превръща в група от клетъчни гени.
Тези факти и примери ясно илюстрират, че концепцията за индивид не е приложима към вирусите.
Концепцията за популация е също толкова неприложима за вирусите, тъй като вътреклетъчният етап на възпроизвеждане и още повече интеграционните процеси напълно обезсмислят тълкуването на възпроизвеждащия се вирус като популация. Към това следва да се добавят данни за дефектни интерфериращи частици, които „придружават“ почти всяка вирусна инфекция. Тези частици са вириони с непълен геном, така че не са способни да се възпроизвеждат. Те обаче играят важна биологична роля, като осигуряват устойчивостта на вирусите в заразените организми или в тъканните култури. По този начин вирусната "популация" най-често представлява сбор от пълни вириони и дефектни образувания, т.е. практически мъртъв материал. Този вид „популация“, състояща се от живи и мъртви индивиди, е невъзможно дори да си представим в света на организмите. В някои случаи сумата от дефектни частици с дефекти в различни части на генома може да осигури развитието на вирусна инфекция (феномен на множествена реактивация).
Естествено, ако няма индивиди, няма популация, е трудно да се въведе понятието вид. Това заключение ще бъде допълнително подкрепено от съображения относно произхода и еволюцията на вирусите. И въпреки това тези концепции са намерили приложение във вирусологията. Говорим за различни действително съществуващи популации от вируси на ниво както заразени организми, така и популации на вирусни гостоприемници, а съвременната международно призната класификация на вирусите се основава на идентифицирането на видове, родове и дори семейства и използването на биномна номенклатура, което е прието за всички останали представители на органичния свят. И това не са чисто забавление, а теоретично обосновани и практически полезни методически подходи. Ще се върнем към обяснението на тези парадокси по-късно.
Ако вирусите не са организми, тогава какво са те? За да се отговори на този въпрос, е необходимо да се очертае кръгът от биологични структури, които могат да бъдат обозначени като вируси. Това е лесно, когато става дума за често срещани, добре разпознаваеми вируси, като вируси на едра шарка или MS2 фаг , въпреки факта, че първият от тях има геном - ДНК с молекулно тегло до 240·10 6, а вторият - РНК с молекулно тегло около 1,2·10 6. Разликите между тези вируси вероятно са не по-малко значими, отколкото между, да речем, E. coli и слон или поне която и да е клетка на това животно. Светът на вирусите обаче е още по-богат, ако не ги ограничаваме до общопризнатите инфекциозни вируси.
Броят на вирусите, разбира се, включва и дефектните вируси. Много онкогенни ретровируси са дефектни, тъй като тяхното придобиване на гени, кодиращи онкогени, често е придружено от разделяне на други гени. При наличието на пълноценни хелперни вируси, обикновено близки до биологично дефектните, дефектният вирус може или да се репликира (ако няма дефект в полимеразния ген), или да използва протеините на хелперния вирус (ако има дефекти в гените на вътрешните или обвивните протеини). Възможно е да се използват протеини от биологично отдалечени вируси: ако ретровирус, дефектен в протеините на обвивката, се размножава в присъствието на вируса на везикулозен стоматит, тогава вирионите ще имат външната обвивка на последния. За това обаче дори не е необходимо един от вирусите да е дефектен: по време на смесена инфекция с много вируси се образуват вириони, чийто геном е затворен в черупките на друг вирус.
Плазмидите или, както се наричаха по-рано, епизоми, екстрахромозомни фактори на наследствеността, „по-близо“ до сателитите. Това са относително малки, обикновено с молекулно тегло по-малко от 107, кръгли, по-рядко линейни ДНК молекули, които често се срещат в бактериални клетки. Те изпълняват различни функции според гените, които носят: токсини, които убиват насекомите; гени, причиняващи туморен растеж в растенията; ензими, които разрушават или модифицират антибиотиците; Фактор на плодовитостта - всъщност предизвиква половия процес при бактериите - обменът на гени между хромозомите на две бактерии. В дрождите са открити клетки убийци (двуверижна РНК), върху които са „кодирани“ токсини, които убиват клетките на дрождите, които не носят клетки убийци. Плазмидите имат две основни разлики от вируси, включително дефектни, и сателити: техните гени не кодират синтеза на протеини, в които са пакетирани нуклеинови киселини, и тяхната репликация се осигурява от клетката. Плазмидите обикновено се намират свободни в цитоплазмата, но могат да бъдат интегрирани в генома на клетка носител и последната да се освободи от тях. Няма резки граници между плазмидите и обикновените вируси. По този начин някои плазмиди са очевидно производни на фаги, като са загубили повечето от своите гени и са запазили само няколко от тях. Редица вируси, например говежди папиломен вирус, могат да съществуват дълго време под формата на плазмиди - голи ДНК молекули. Херпесните вируси могат да персистират под формата на плазмиди с пълен или частично изтрит геном. С развитието на генното инженерство стана възможно изкуственото получаване на плазмиди от вирусна ДНК, вмъкване на чужди гени в плазмиди и дори изкуствено конструиране на плазмиди от фрагменти на клетъчна ДНК.
Вирусите са тясно свързани с вироидите, които са причинители на инфекциозни болести по растенията. Те не се различават съществено от обикновените вирусни заболявания, но се причиняват от особени структури - малки (молекулно тегло 120 000-160 000) кръгови суперспирални РНК молекули. Във всички останали отношения това са типични вирусни заболявания с определени прояви, инфекциозност чрез механично предаване и пролиферация на вироиди в заразените клетки.
И накрая, болестите на животните (овце, кози) и хората (болест на Куру, болест на Кройцфелд-Якоб), изразяващи се в развитието на спонгиформни енцефалопатии, са подобни на вирусните инфекции. Предполага се, че тези заболявания са резултат от излезли от контрол гени, кодиращи протеини, които са както техни продукти, така и техни деренресори, и причина за характерни лезии на нервните клетки.
Възможността за дегенеративна еволюция е многократно установявана и доказана и може би най-яркият пример за това е произходът на някои клетъчни органели на еукариоти от симбиотични бактерии. Понастоящем, въз основа на изследването на хомологията на нуклеиновите киселини, може да се счита за установено, че хлоропластите на протозоите и растенията произхождат от предците на днешните синьо-зелени бактерии, а митохондриите - от предците на лилавите бактерии. Обсъжда се и възможността за произход на центриолите от прокариотни симбиони. Следователно не може да се изключи такава възможност за произхода на вируси, особено такива големи, сложни и автономни като вируса на едрата шарка.
И все пак светът на вирусите е твърде разнообразен, за да признае възможността за такава дълбока дегенеративна еволюция за повечето от неговите представители, от вируси на едра шарка, херпес и иридовируси до аденосателити, от реовируси до сателити на вируса на тютюневата некроза или РНК-съдържащия делта вирус - сателит на вируса на хепатита IN,да не говорим за такива автономни генетични структури като плазмиди или вироиди. Разнообразието от генетичен материал във вирусите е един от аргументите в полза на произхода на вирусите от предклетъчни форми. Всъщност генетичният материал на вирусите „изчерпва“ всичките си възможни форми: едно- и двуверижни РНК и ДНК, техните линейни, кръгови и фрагментарни видове. Природата сякаш е изпробвала всички възможни варианти на генетичен материал върху вируси, преди най-накрая да избере неговите канонични форми - двойноверижна ДНК като пазител на генетична информация и едноверижна РНК като неин предавател. И все пак, разнообразието от генетичен материал във вирусите е по-вероятно да показва полифилетичния произход на вирусите, отколкото запазването на предшествени предклетъчни форми, чийто геном е еволюирал по малко вероятен път от РНК до ДНК, от едноверижни форми до двойни -заседнали и др.
Третата хипотеза от 20-30 години изглеждаше малко вероятна и дори получи ироничното име на хипотезата на избягалите гени. Но натрупаните факти дават все повече и повече аргументи в полза на тази хипотеза. Някои от тези факти ще бъдат разгледани в специална част на книгата. Тук отбелязваме, че именно тази хипотеза лесно обяснява не само доста очевидния полифилетичен произход на вирусите, но и общността на такива разнообразни структури като пълноценни и дефектни вируси, сателити и плазмиди и дори приони. Тази концепция също предполага, че образуването на вируси не е било еднократно събитие, а се е случвало много пъти и продължава да се случва в момента. Още в далечни времена, когато започнаха да се образуват клетъчни форми, заедно и заедно с тях, се запазиха и развиха неклетъчни форми, представени от вируси - автономни, но клетъчно зависими генетични структури. Съществуващите в момента вируси са продукти на еволюцията, както на техните най-древни предци, така и на наскоро появили се автономни генетични структури. Вероятно опашатите фаги са пример за първото, докато R-плазмидите са пример за второто.
Основният принцип на еволюционната теория на Чарлз Дарвин е признаването на борбата за съществуване и естествения подбор като движещи сили на еволюционния процес. Откритията на Г. Мендел и последвалото развитие на генетиката допълниха основните положения на еволюционната теория с доктрината за наследствената променливост, която има случаен, стохастичен характер, по-специално за мутациите и рекомбинациите, които са „материалът“ за естествения подбор . Последващото развитие на молекулярната генетика материализира концепцията за ген и химичните основи на мутациите и рекомбинациите, включително точкови мутации, инсерции, заличавания, пренареждания и т.н. Правилно обаче беше отбелязано, че молекулярната генетика обяснява добре само процесите на микроеволюцията главно в рамките на света и слабо обяснени процесите на макроеволюцията - формирането на големи таксономични групи, които са в основата на прогресивната еволюция.
За да се обясни молекулярната основа на тези процеси, както и действителната скорост на еволюцията, е предложена теорията за дублирането на гени и геноми. Тази концепция съответства на наблюдаваните факти и добре обяснява еволюцията на органичния свят на Земята, по-специално появата на гръбначните животни (хордови) и по-нататъшното им развитие от примитивни аморфни животни до човека. Ето защо тази концепция бързо придоби одобрение сред биолозите, изучаващи молекулярната основа на еволюцията.
Заедно с това се натрупаха значителен брой факти, показващи наличието в природата на широкомащабен обмен на готови блокове генетична информация, включително между представители на различни, еволюционно далечни вируси. В резултат на такъв обмен, наследствените свойства могат бързо и рязко да се променят чрез интегриране на чужди гени (заемане на генна функция). Нови генетични качества могат да възникнат и поради неочаквана комбинация от собствени и интегрирани гени (появата на нова функция). И накрая, простото увеличаване на генома поради нефункциониращи гени отваря възможността за еволюция на последните (образуване на нови гени).
Специална роля в осигуряването на тези процеси принадлежи на вирусите - автономни генетични структури, включително както конвенционални вируси, така и плазмиди. Тази идея беше изразена в общи линии и след това разработена по-подробно [Жданов В.М., Тихоненко Т.И., 1974].
Възпроизвеждане на ДНК вируси. Репликативен цикъл на ДНК вируси. Възпроизвеждане на паповавируси. Възпроизвеждане на аденовируси.
вируси, липса на суперкапсид(например аденовируси) проникват в клетките чрез виропексис, а тези, които имат такива (покс- и херпесвируси) - поради сливането на суперкапсида с клетъчната мембрана. Репродуктивният цикъл на ДНК вирусите включва ранен и късен етап (фиг. 5-4). При големи ДНК вируси има ясно несъответствие между кодиращия капацитет на генома и молекулното тегло на индуцираните от вируса протеини и протеините, които са част от вирионите. Например при херпесните вируси само 15% от ДНК кодира всички протеини на вирионите и техните прекурсори. Възможно е значителна част от генома да съдържа гени, кодиращи синтеза на ензими и регулаторни протеини. Папова-, адено- и херпесните вируси се възпроизвеждат по относително еднакъв начин, докато възпроизвеждането на поксвирусите има някои особености.
Ранен стадий на размножаване. Вирусна ДНКпрониква в клетъчното ядро, където се транскрибира от клетъчна ДНК-зависима РНК полимераза. В този случай част от вирусния геном („ранни гени“) се чете и след това се превежда. В резултат на това се синтезират „ранни протеини“ (регулаторни и матрични протеини на вирусни полимерази).
Регулаторни протеиниизпълняват различни функции. Когато една клетка е заразена, те блокират синтеза на клетъчна РНК, ДНК и протеин и в същото време насърчават експресията на вирусния геном, променяйки специфичността на отговора на клетъчните полимерази и полирибозоми. Те също така задействат репликацията на клетъчна ДНК, модифицирана от интегрираните геноми на ДНК, съдържащи вируси и ретровируси, тоест репликацията на вирусни геноми. Вирус-специфични полимерази. Вирус-специфичните ДНК полимерази, които участват в образуването на ДНК молекули на дъщерни популации, също участват в репликацията на вирусните геноми.
Матрични протеининеобходими за репликацията на нуклеиновите киселини и сглобяването на дъщерни популации. Те образуват електронно плътни натрупвания в клетката, известни като телца на включване (например телца на Гуарнери при едра шарка).
Късен етап на размножаване. На този етап се извършва синтеза на вирусни нуклеинови киселини. Не цялата новосинтезирана вирусна ДНК е пакетирана в дъщерни популационни вириони. Част от ДНК („късни гени“) се използва за синтезиране на „късни протеини“, необходими за сглобяването на вириони. Образуването им се катализира от вирусни и модифицирани клетъчни полимерази.
Паповавируси и аденовируси. Възпроизвеждане на паповавируси. Възпроизвеждане на аденовируси.
Адсорбция, проникването и депротеинизацията са подобни на тези на РНК вирусите, но папова- И аденовирусидепротеинизацията става в ядрото, а при РНК вирусите - в цитоплазмата.
Ранна фаза на размножаване. Вирусната ДНК („ранни гени“) се транскрибира в клетъчното ядро. Транскрипцията на вирусната "ранна" иРНК се осъществява върху една от ДНК веригите. Механизмите на транскрипция на вирусна ДНК са подобни на четенето на информация от клетъчна ДНК. Транслира се специфична иРНК и започва синтеза на ензими, необходими за образуването на дъщерни копия на ДНК. Синтезът на клетъчна ДНК може временно да се засили, но след това непременно да бъде потиснат от регулаторните протеини на вируса.
Късна фаза на размножаване. По време на късната фаза дъщерната вирусна ДНК продължава да се транскрибира активно от клетъчни РНК полимерази, което води до появата на продукти от късни вирус-специфични синтези. „Късната“ иРНК мигрира в цитоплазмата и се транслира върху рибозомите. В резултат на това се синтезират капсидни протеини на дъщерната популация, които се транспортират в ядрото и се сглобяват около дъщерните ДНК молекули на нови вирусни частици. Освобождаването на пълни дъщерни популации е придружено от клетъчна смърт.
начален периодвключва етапите на адсорбция на вируса върху клетката, проникване в клетката, разпадане (депротеинизация) или „събличане“ на вируса. Вирусната нуклеинова киселина се доставя до съответните клетъчни структури и под действието на лизозомни ензими клетките се освобождават от защитните протеинови обвивки. В резултат на това се образува уникална биологична структура: заразената клетка съдържа 2 генома (собствен и вирусен) и 1 синтетичен апарат (клетъчен);
След това започва втора групапроцеси на възпроизвеждане на вируси, включително среднои последни периоди,по време на което се получава потискане на клетъчния и експресия на вирусния геном. Потискането на клетъчния геном се осигурява от регулаторни протеини с ниско молекулно тегло като хистони, синтезирани във всяка клетка. По време на вирусна инфекция този процес се засилва; сега клетката е структура, в която генетичният апарат е представен от вирусния геном, а синтетичният апарат е представен от синтетичните системи на клетката.
2. Насочва се по-нататъшният ход на събитията в клеткатаза репликация на вирусна нуклеинова киселина (синтез на генетичен материал за нови вириони) и прилагане на съдържащата се в него генетична информация (синтез на протеинови компоненти за нови вириони). В ДНК-съдържащи вируси, както в прокариотни, така и в еукариотни клетки, репликацията на вирусна ДНК се осъществява с участието на клетъчна ДНК-зависима ДНК полимераза. В този случай, в едноверижни ДНК-съдържащи вируси, a допълващи сенишката е така наречената репликативна форма, която служи като шаблон за дъщерните ДНК молекули.
3. Внедряване на генетичната информация на вируса, съдържаща се в ДНК, става по следния начин:с участието на ДНК-зависима РНК полимераза се синтезира иРНК, която навлиза в рибозомите на клетката, където се синтезират специфични за вируса протеини. В двойноверижните ДНК вируси, чийто геном се транскрибира в цитоплазмата на клетката гостоприемник, това е собствен геномен протеин. Вирусите, чиито геноми се транскрибират в клетъчното ядро, използват съдържащата се там клетъчна ДНК-зависима РНК полимераза.
U РНК вирусипроцеси репликациятехният геном, транскрипцията и транслацията на генетичната информация се извършват по други начини. Репликацията на вирусна РНК, както минус, така и плюс вериги, се осъществява чрез репликативната форма на РНК (комплементарна на оригинала), чийто синтез се осигурява от РНК-зависима РНК полимераза - това е геномен протеин, който всички РНК-съдържащи вирусите имат. Репликативната форма на РНК на вируси с минус-вериги (плюс-вериги) не само служи като шаблон за синтеза на дъщерни молекули на вирусна РНК (минус-вериги), но също така изпълнява функциите на иРНК, т.е. отива към рибозомите и осигурява синтеза на вирусни протеини (излъчване).
U плюс-нишкаЗа вирусите, съдържащи РНК, транслационната функция се изпълнява от неговите копия, чийто синтез се осъществява чрез репликативна форма (минус верига) с участието на вирусни РНК-зависими РНК полимерази.
Някои РНК вируси (реовируси) имат напълно уникален механизъм на транскрипция. Осигурява се от специфичен вирусен ензим - ревертаза (обратна транскриптаза)и се нарича обратна транскрипция. Същността му е, че първо върху вирусната РНК матрица с участието на обратна транскрипция се образува транскрипт, който представлява единична верига на ДНК. Върху него с помощта на клетъчна ДНК-зависима ДНК полимераза се синтезира втората верига и се образува двуверижен ДНК транскрипт. От него по обичайния начин, чрез образуването на иРНК, се реализира информацията на вирусния геном.
Резултатът от описаните процеси на репликация, транскрипция и транслация е образуването дъщерни молекуливирусна нуклеинова киселина и вирусни протеини,кодирани в генома на вируса.
След това идва трети и последен периодвзаимодействие между вирус и клетка. Новите вириони се сглобяват от структурни компоненти (нуклеинови киселини и протеини) върху мембраните на цитоплазмения ретикулум на клетката. Клетка, чийто геном е бил репресиран (потиснат), обикновено умира. Новообразувани вириони пасивно(в резултат на клетъчна смърт) или активно(чрез пъпкуване) напускат клетката и се озовават в нейната среда.
по този начин синтез на вирусни нуклеинови киселини и протеини и сглобяване на нови вирионивъзникват в определена последователност (разделени във времето) и в различни клетъчни структури (разделени в пространството) и затова методът на вирусна репродукция се нарича дизюнктивен(разединен). При абортивна вирусна инфекция процесът на взаимодействие между вируса и клетката се прекъсва по една или друга причина, преди да настъпи потискането на клетъчния геном. Очевидно в този случай генетичната информация на вируса няма да бъде внедрена и вирусът няма да се възпроизвежда, а клетката запазва функциите си непроменени.
При латентна вирусна инфекция и двата генома функционират едновременно в клетката, а при индуцирани от вируса трансформации вирусният геном става част от клетъчния геном, функционира и се наследява заедно с него.