Гельминтологические методы исследований . Методы диагностики гельминтозов разделяют на прямые, основанные на непосредственном выявлении самих гельминтов или их фрагментов, а также личинок и яиц гельминтов (методы исследования фекалий, мочи, желчи и дуоденального содержимого, мокроты, крови и тканей, материала, полученного при соскобе из перианальной области и подногтевых пространств), и косвенные, с помощью которых выявляют вторичные изменения, возникающие в организме человека в результате жизнедеятельности гельминтов (исследования морфологического состава крови, иммунологические методы диагностики гельминтозов, рентгенологические исследования и т.д.). Из прямых методов наиболее распространены копрологические, которые делятся на макро- и микрогельминтоскопические. В отдельных случаях используют специальные методы.
Макрогельмитоскопические методы исследования направлены на поиски гельминтов или их фрагментов (сколексов, члеников, частей стробилы цестод). Их применяют для диагностики тех гельминтозов, при которых яйца не выделяются с экскрементами больного или выделяются в небольшом количестве и не всегда (например, при энтеробиозе в фекалиях обнаруживают острицы, при тениидозах - членики).
Для обнаружения в фекалиях остриц или члеников цестод проводят просмотр фекалий невооруженным глазом. Для дифференциальной диагностики тениидозов рекомендуется просмотр разжиженных водой фекалий отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или в чашках Петри на темном фоне. Крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривают под лупой между двумя предметными стеклами. Если же по клиническим показаниям предполагают обнаружение мелких гельминтов или головок цестод после лечения, то подозрительные частицы рассматривают под лупой в капле глицерина, а в случае необходимости и под микроскопом.
Микрогельминтоскопические методы исследования (качественные) направлены на выявление яиц и личинок гельминтов. Применяют метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като. Смесь Като состоит из 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина и 500 мл 6% раствора фенола. Пластинки по Като (гидрофильный целлофан разрезают на части размером 20´ 40 мм ) погружают на 24 ч в смесь Като так, чтобы они прилегали друг к другу (3-5 мл раствора Като на 100 пластинок). 100 мг фекалий наносят на предметное стекло, накрывают целлофановой покровной пластинкой по Като и придавливают так, чтобы фекалии размазались по предметному стеклу в пределах целлофановой пластинки. Мазок оставляют при комнатной температуре для осветления на 40-50 мин, после чего просматривают под микроскопом. В жаркое время года во избежание высыхания препарата на пластинку приготовленного препарата кладут влажную губку.
Для полного выявления гельминтов всех видов метод толстого мазка с целлофановой покровной пластинкой по Като необходимо использовать в сочетании с одним из методов обогащения. Наиболее распространенными из них являются метод Калантарян и метод Фюллеборна.
Метод Калантарян: в склянках с широким горлом объемом 100 мл тщательно размешивают стеклянной палочкой 5 г фекалий, постепенно доливая насыщенный раствор нитрата натрия (1 кг азотнокислого натрия на 1 л воды при кипячении) до краев стакана. Всплывшие на поверхность крупные частицы удаляют бумажным совочком. К поверхности солевого раствора прикладывают предметное стекло (солевой раствор добавляют до полного соприкосновения смеси с предметньм стеклом). Через 20-30 мин предметное стекло снимают и пленку просматривают под микроскопом. При отсутствии данной соли можно использовать насыщенный раствор поваренной соли по Фголлеборну (400 г соли в 1 л воды при кипячении).
В связи с тем, что яйца, имеющие большой удельный вес (неоплодотворенные яйца аскарид, яйца трематод и крупных цестод), не всплывают, помимо исследования поверхностного слоя жидкости, при использовании метода Фюллеборна необходимо просмотреть под микроскопом 2-4 препарата из осадка.
Специальные лабораторные методы исследований на различные гельминтозы.
Прежде чем проводить лечебно-профилактические мероприятия при определенных гельминтозах сельскохозяйственных и промысловых животных, необходимо своевременно поставить точный диагноз болезни. Существуют две группы методов диагностики гельминтозов - прижизненные и посмертные. Кроме того, надо уметь дифференцировать гельминтозы и другие инвазионные, а также инфекционные заболевания.
Прижизненная диагностика гельминтозов
Диагноз на гельминтозы при жизни животных ставят на основании результатов лабораторных методов исследований и диагностических дегельминтизаций (прямых методов), а также иммунобиологических реакций (косвенных методов). Подсобную роль в диагностике гельминтозов играют данные исследований промежуточных хозяев (при биогельминтозах), клинические и эпизоотологические наблюдения. Основные методы диагностики - лабораторные исследования, позволяющие часто обнаруживать возбудителей гельминтозов или их яйца и личинки в экскретах (фекалиях, моче, мокроте), секретах (желчи), тканях (крови, мышцах), органах (кусочках кожи), в содержимом пунктатов и абсцессов.
Лабораторные методы диагностики гельминтозов животных легко выполнимы и достаточно точны, поэтому их широко применяют в производственных условиях (в ветеринарных лабораториях и в других ветеринарных учреждениях). В зависимости от целевого назначения лабораторные исслелования подразделяют на гельминтоовоскопические, гельминтоларвоскопические и гельминтоскопические методы исследований.
Гельминтоларвоскопические методы исследований используют для обнаружения личинок гельминтов (диктиокаул, мюллерий и др.). Из этой группы нередко применяют исследование фекалий по методам Бермана-Орлова и Вайда.
Гельминтоскопические или макрогельминтоскопические исследования применяют с диагностической целью для обнаружения выделяемых наружу гельминтов или их фрагментов (члеников нестод). В практических условиях этим способом устанавливают диагноз на аскаридоз свиней, дрепанидотениоз гусей и другие гельминтозы.
Из лабораторных методов диагностики гельминтозов животных большое практическое значение имеют: а) гельминтокопрологические исследования (исследование фекалий); б) исследование выделений других органов; в) исследование тканей.
Гельминтокопрологические исследования
Для этих же целей предложен специальный прибор, состоящий из стальных браншей, переходных ветвей и двух прикрепленных к ветвям полусферических поверхностей. Взятие фекалий из прямой кишки животных при помощи этого прибора облегчает труд ветеринарных работников и повышает производственную культуру этой манипуляции.
У кроликов фекалии в количестве нескольких шариков извлекают путем надавливания на брюшную стенку в области прямой кишки. Иногда допускается взятие проб фекалий с пола, если они свежие и известно, от какого животного. От одного животного берут не менее 10-20 г фекалий. От птиц, пушных зверей, собак, кошек и диких хищников (в зоопарках) фекалии собирают с чистого пола клеток (групповые пробы).
Все пробы фекалий этикетируют: по краю пакета или листа бумаги (где он не будет соприкасаться с экскрементами) простым карандашом пишут номер пробы (иногда и кличку коров). К пробам фекалий прилагают опись, в которой указывают наименование хозяйства, бригады, вид, пол и возраст животных (для взрослых - кличку или инвентарный номер) и дату взятия проб. В сопроводительной желательно указать цель исследований фекалий (например, для контроля проведенной дегельминтизации). Необходимо стараться быстрее доставить пробы фекалий в ветеринарную лабораторию и исследовать их без задержки, потому что при комнатной температуре через 16-20 часов из яиц кишечных стронгилят выходят личинки, что затрудняет диагностику диктиокаулеза и протостронгилидозов, а также других гельминтозов.
Если пробы фекалий в день взятия не исследуют, то их помещают в холодильник или подвал при температуре не выше 10°. Дезинфицирующие средства не приостанавливают развитие личинок внутри яиц гельминтов. Результаты исследования фекалий регистрируют в специальном журнале.
Оборудование для гельминтокопрологических исследований. Достоверность гельминтокопрологических исследований в значительной степени зависит от качества лабораторного оборудования. В 1968 г. на Украине разработан набор стандартного оборудования для массового исследования фекалий на гельмннтозы. Он состоит из предметов, изготовленных преимущественно из ударопрочного полистерола двух цветов, которые легко моются и обезвреживаются (выдерживают кипячение), а также удобны при транспортировке. В состав набора входят стаканчики различной емкости, воронки, конические пробирки, ситечки разных размеров, штатив с пятью планками (каждая на шесть воронок), кювет (по размерам штатива), коробки для хранения посуды, а также резиновые груши, стеклянные палочки и металлические петли (рис. 1).
В отличие от ранее применявшегося разнородного оборудования новый набор повышает эффективность лабораторных исследований фекалий и производительность труда ветеринарных работников, позволяет шире проводить количественные гельминтокопрологические исследования стандартизированными методами (контроль дегельминтизаций), а также улучшает эстетическую сторону этой работы.
Различают качественные и количественные методы исследований фекалий.
Качественные гельминтокопрологические исследования
Качественные методы исследований позволяют установить, какими гельминтами заражены животные.
Гельминтоовоскопические методы. Для прижизненной диагностики гельминтозов предложено большое количество методов гельминтоовоскопии, из которых рассмотрим только те, которыми чаще пользуются в ветеринарной практике.
Большинство гельминтокопрологических методов диагностики основано на разнице удельного веса яиц, личинок гельминтов или их фрагментов, с одной стороны, и жидкости, в которой взвешены исследуемые фекалии, - с другой. В зависимоти от соотношения удельного веса этих компонентов различают методы флотации, осаждения и комбинированные.
Методы флотации. При методах флотации (всплывания) используют жидкости (насыщенные растворы солей), удельный вес которых больше веса яиц гельминтов. В лабораторной практике наиболее широко применяют насыщенный раствор поваренной соли (удельный вес 1,18). Для приготовления такого раствора в кастрюлю с кипящей водой постепенно добавляют при помешивании хлорид натрия до образования на дне небольшого осадка (на 1 л воды берут около 400 г поваренной соли). Горячий раствор фильтруют в бутыль через несколько слоев марли или вату и применяют после остывания (на дне бутыли должен образоваться кристаллический осадок).
Реже в ветеринарных лабораториях используют насыщенные растворы сульфата магния с удельным весом 1,35 (920 г на 1 л горячей воды), гипосульфита натрия с удельным весом от 1,37 до 1,41, в зависимости от температуры окружающей среды (1750 г на 1 л горячей воды) и азотнокислого натрия с удельным весом 1,4 (соотношение селитры и горячей воды 1:1).
Метод Фюллеборна характеризуется простотой выполнения и высокой эффективностью при большинстве нематодозов и цестодозов животных, поэтому он занимает первое место среди других, гельминтокопрологических методов диагностики. В стеклянный, полистероловый или пластмассовый стаканчик емкостью 50-100 мл помещают 3-5 г фекалий и при помешивании стеклянной палочкой постепенно добавляют насыщенный раствор поваренной соли (хлорида натрия) из расчета на одну часть фекалий 15-20 частей флотационной жидкости. Плотные фекалии овец предварительно можно растереть с небольшим количеством раствора соли в фарфоровой ступке, после чего суспензию переливают в стаканчик, добавив необходимое количество раствора хлорида натрия. Всплывшие крупные частицы сразу удаляют палочкой, а взвесь фекалий целесообразно профильтровать в другой стаканчик через сито (иногда употребляют молочные ситечки). После отстаивания заряженной пробы в течение 45-60 минут металлической петлей снимают три капли поверхностной пленки, помещают их на предметное стекло и микроскопируют без покровного стекла. После каждой пробы петли промывают в стакане с водой (вместо рекомендуемых в некоторых руководствах прожиганий их на спиртовке).
Метод Калантарян - видоизмененный метод Фюллеборна. В качестве флотационной жидкости используют насыщенный раствор азотнокислого натрия. Время отстаивания взвеси 15-30 минут. Применяют для диагностики и акантоцефалезов.
Методы осаждения. При методах осаждения используют жидкости с меньшим удельным весом, чем удельный вес яиц.
Метод последовательного промывания. Небольшое количество фекалий (5 г) размешивают в стаканчике с 10-кратным количеством воды. Смесь фильтруют в большой стакан и доливают воду, после чего фильтрат отстаивают 5 минут. Затем сливают или отсасывают спринцовкой верхний слой жидкости до осадка; к осадку добавляют такое же количество воды, перемешивают и отстаивают снова 5 минут. Эти манипуляции повторяют до просветления верхнего слоя жидкости в стакане. Жидкость последний раз сливают, а осадок наносят на стекло или в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом. Этот метод часто применяют для диагностики большинства трематодозов и акантоцефалезов.
Метод Горшкова основан на принципе осаждения с последующей концентрацией яиц гельминтов. 150-300 г фекалий лошади помещают на металлическое сито или марлю в большую стеклянную воронку диаметром в верхней части 15-20 см. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку длиной 10-15 см с зажимом на конце. Фекалии разрыхляют и заливают доверху теплой водой. Фекалии в воронке выдерживают от 4 часов до одних суток, после чего зажим осторожно открывают, часть жидкости выпускают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 минуты. Затем жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом. Этим методом диагностируют драшейоз и габронематоз лошадей.
Комбинированные методы. Основаны на принципе осаждения и флотации яиц гельминтов, поэтому более эффективны в сравнении с предыдущими методами исследований. Ввиду сложности эти методы имеют сравнительно ограниченное применение в производственных условиях.
Метод Дарлинга. Небольшое количество фекалий (3-5 г) размешивают в стаканчике с 20-30 мл воды, смесь процеживают в центрифужные пробирки и центрифугируют 1-2 минуты, после чего верхний слой жидкости сливают, а к осадку доливают смесь равных частей глицерина и поваренной соли. Смесь в пробирках взбалтывают и вторично центрифугируют. Всплывшие на поверхность яйца снимают вместе с пленкой взвеси проволочной петлей, стряхивают на предметное стекло и микроскопируют. При отсутствии глицерина фекалии можно смешивать перед вторичным центрифугированием с насыщенным раствором поваренной соли.
Метод Щербовича. Техника исследования фекалий напоминает предыдущий метод. Отличается от него тем, что перед вторичным центрифугированием к осадку добавляют насыщенный раствор гипосульфита натрия (при макраканторинхозе свиней) или сернокислой магнезии (). По сравнению с методом Дарлинга этот метод более эффективен.
Флотационно-седиментационный метод Демидова рекомендуют для диагностики фасциолеза, а также других трематодозов жвачных. Пробу фекалий (3 г от овец и 5 г от крупного рогатого скота) помещают в стакан емкостью 200 мл и наливают в него доверху насыщенный раствор поваренной соли и тщательно размешивают стеклянной палочкой, после чего взвесь отстаивают 15-20 минут. Всплывшие на поверхность грубые частицы удаляют бумажным совочком, а надосадочную жидкость отсасывают спринцовкой (при исследовании большого количества проб жидкость можно сливать), оставляя на дне 20-30 мл осадка. К осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают. Смесь фильтруют в обычный стакан через марлю или металлическое сито и отстаивают 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка, который переносят в конический стаканчик, пропаласкивают обычный стакан и выливают смыв в маленький. Взвесь отстаивают в коническом стаканчике 3-5 минут, а жидкость в последующем отсасывают (эту процедуру повторяют). Просветленный осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют. Этот метод эффективнее метода последовательного промывания.
Гельминтоларвоскопические методы. Метод Бермана-Орлова. Для исследования фекалий используют аппарат, состоящий из средней воронки (пластмассовой, полистероловой или стеклянной), резиновой трубки (10-15 см длиной), соединенной верхним концом с воронкой, зажима, укрепленного на нижнем конце резиновой трубки, металлического сита или куска марли и штатива (для одного или нескольких аппаратов). Смонтированный аппарат заполняют теплой водой (35-38°). 10-15 г свежих фекалий кладут на сито или завертывают в марлю и осторожно опускают в воронку. Фекалии от овец выдерживают в аппарате 2-4 часа, а от телят - не менее 6-7 часов. Затем зажим на трубке ослабляют, а вытекающую жидкость собирают в пробирку и центрифугируют в течение 2-3 минут. После этого верхний слой жидкости сливают быстрым опрокидыванием пробирки, а оставшуюся на дне жидкость переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Применение зажимов на резиновую трубку в аппарате Бермана связано с неудобствами, поэтому во многих ветеринарных лабораториях нижние концы резиновых трубок непосредственно соединяют с маленькими пробирками. Перед исследованием осадка под микроскопом жидкость не центрифугируют.
Фекалии жвачных можно исследовать на легочные нематодозы (особенно в экспедиционных условиях) упрощенным методом гельминтоларвоскопии (без использования воронок). Для этой цели применяют небольшие полуконические стаканчики (50 мл). Пробы фекалий помещают на ситечки или завертывают в марлю и опускают в стаканчики с водой. Через несколько часов фекалии удаляют, жидкость из стаканчика отсасывают или сливают, а осадок микроскопируют.
Метод Вайда. Несколько шариков фекалий от мелких жвачных помещают в бактериологическую чашку или на часовое стекло и овлажняют их небольшим количеством теплой воды. Через 10-20 минут фекалии удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют под малым увеличением микроскопа. Эффективность этого метода значительно ниже в сравнении с предыдущим методом, поэтому его реже применяют для диагностики диктиокаулеза и протостронгилидозов овец.
Метод дифференциальной диагностики стронгилятозов по инвазионным личинкам. Возбудители большинства кишечных стронгилятозов имеют почти одинаковое строение яиц, поэтому при гельминтоовоскопии можно поставить только групповой диагноз (например, стронгилятозы).
Для установления более точного диагноза (родового) в ветлабораториях иногда получают культуру инвазионных личинок стронгилят. Около 5 г фекалий помещают в бактериологическую чашку, закрывают крышкой и ставят ее в термостат при температуре 25-30° на одну неделю. Затем фекалии с личинками исследуют по методу Бермана-Орлова (для выделения инвазионных личинок из фекалий).
Инвазионные личинки разных родов кишечных стронгилят отличаются по величине тела, строению хвостового конца чехлика и по количеству кишечных клеток. Например, личинки эзофагостом более крупные (до 1 мм длины), нитевидный хвостовой конец чехлика длинный, а кишечник имеет 20-32 клетки; личинки гемонхов средней длины (около 0,8 мм), с нитевидным хвостовым концом чехлика, кишечник имеет 16 клеток.
Периодическое промывание и отстаивание фекалий повторяют до просветления верхнего слоя. Верхний слой жидкости последний раз сливают, а осадок малыми порциями просматривают в кюветках с черным и белым дном. Обнаруженных гельминтов собирают при помощи пинцетов, препаровальных игл и кисточек, просматривают под микроскопом, после чего переносят в консервирующую жидкость. Чтобы выявить мелких нематод, осадок дополнительно исследуют по частям при помощи бинокулярной или штативной лупы с 10-20-кратным увеличением.
Количественные гельминтокопрологические исследования
Стандартизированный метод Фюллеборна менее точен в сравнении с методом Столла, но в виду простоты выполнения его широко применяют в ветеринарной практике для контроля эффективности дегельминтизаций животных. По технике выполнения стандартизированный метод напоминает другие методы качественных гельминтоовоскопических исследований. Однако у него имеется ряд особенностей, основными из которых являются следующие: 1) навески фекалий должны быть равными; 2) посуда одного обьема; 3) время отстаивания водных взвесей фекалий одно и то же; 4) петли одинакового диаметра, исследование равного количества капель.
Для ориентировочного учета интенсивности диктиокаулезной и прогостронгилидозной инвазии у жвачных можно применить стандартизированный метод Бермана-Орлова. Достоверность результатов повышается при увеличение количества и кратности исследований.
Исследование выделений других органов
Исследование содержимого конъюнктивальных полостей применяют для диагностики телязиоза крупного рогатого скота (возбудитель - Thelazia rhodesi). Из спринцовки орошают конъюнктивальные полости водным раствором йода; вытекающую жидкость собирают в кюветку или почковидный тазик и осматривают на наличие телязий. В данном случае водный раствор йода оказывает и лечебное действие.
Исследование истечений из клоаки проводят для прижизненной диагностики . Вытекающую слизь помещают на предметное стекло и исследуют под микроскопом с целью обнаружений яиц возбудителя болезни.
Исследование соскоба с перианальных складок - основной метод диагностики . Лопатковидной палочкой или спичкой, смоченной смесью равных частей глицерина и воды, делают соскоб с перианальных складок промежности и внутренней поверхности корня хвоста. Соскоб переносят на предметное стекло в каплю глицерина с водой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Обнаружение яиц оксиур подтверждает клинический диагноз.
Исследование соскобов кожи из «летних язв» рекомендуется для диагностики кожной формы драшейоза и габронематоза. Соскоб берут со свежеизъязвленной поверхности кожи и помещают в каплю разведенной соляной кислоты (1:1000). Затем препарат расщепляют препаровальными иглами, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом для обнаружения личинок драшей или габронем.
Исследование тканей
Исследование кожи крупного рогатого скота (по Гнединой) применяют для диагностики онхоцеркоза. На нижней брюшной стенке у животного после подготовки операционного поля вырезают небольшой кусочек кожи толщиной 2 мм (с небольшое овсяное зерно), а ранку смазывают настойкой йода. В ветеринарной лаборатории этот кусочек кожи помещают на предметное стекло в физиологический раствор, расщепляют препаровальными иголками, а затем все сливают в центрифужную пробирку и ставят ее на несколько часов в термостат при температуре 37-38°. Затем волокна кожи удаляют, жидкость центрифугируют, а осадок микроскопируют с целью обнаружения подвижных микроонхоцерков.
Исследование кусочков мышц на часто проводят посмертно. Иногда для прижизненной диагностики трихинеллеза используют метод биопсии. Путем оперативного вмешательства вырезают кусочек мышцы (например, из наружных мышц уха), из которых готовят мелкие срезы (с овсяное зерно). Последние помещают на нижнее стекло компрессория, покрывают верхним стеклом и сближают их винтами до полного расплющивания. Просматривают срезы под трихинеллоскопом, малым увеличением микроскопа, с помощью проекционного трихинеллоскопа или проекционной камеры КТ-3.
Диагностические дегельминтизации
Для диагностической дегельминтизации отбирают несколько животных, изолируют от остального поголовья и задают им антгельминтик в терапевтической дозе. Выделенные в течение одних-двух суток фекалии от этих животных собирают и подвергают гельминтоскопическому исследованию на предмет обнаружения возбудителя болезни. В производственных условиях диагностические дегельминтизации нередко проводят для прижизненной диагностики мониезиоза жвачных, дрепанидотениоза гусей, цестодозов плотоядных, аскаридоза свиней и аскаридиоза кур.
Иммунологические реакции
Аллергические кожные реакции предложены для прижизненной диагностики фасциолеза овец, описторхоза плотоядных, и , мониезиоза овец, гемонхоза и диктиокаулеза овец, онхоцеркоза крупного рогатого скота и лошадей и трихинеллеза свиней.
Из серологических методов следует указать на реакцию сколексопреципитации, позволяющую диагностировать ранние стадии эхинококкоза и реакцию преципитации с использованием живых личинок аскарид и трихинелл для выявления соответствующих гельминтозов.
Исследование промежуточных хозяев гельминтов
Результаты гельминтологического обследования животных всегда должны дополняться данными исследований на гельминтозы промежуточных хозяев. Они позволяют выяснять гельминтологическую ситуацию, прогнозировать появление гельминтозов. Промежуточными хозяевами гельминтов могут быть моллюски (пресноводные и сухопутные), ракообразные (циклопы, дафнии, бокоплавы, водяные ослики), дождевые черви, насекомые (мухи, мошки, мокрецы, стрекозы, муравьи, жуки), почвенные клеши.
Эпизоотологическое значение имеет плотность (количественный состав) отдельных видов промежуточных хозяев. Чем она выше, тем больше имеется возможностей для заряжения животных гельминтозями. Наземные промежуточные хозяева находятся в разных местах (в навозных кучах, на выгулах, пастбищных участках и др.). Водные промежуточные хозяева в огромном количестве обитают у берегов стоячих мелких водоемов, в зарослях растений. В этих местах животные (особенно ) часто заражаются гельминтозами.
Промежуточных хозяев на наличие личинок гельминтов надо исследовать в свежем (лучше живом) состоянии под бинокулярной лупой или малым увеличением микроскопа. Личиночные стадии гельминтов в теле промежуточных хозяев находятся на разных стадиях развития, но наиболее заметными являются инвазионные личинки. В итоге исследований определяется экстенсивность (процент) и интенсивность (количество) инвазированности промежуточных хозяев личинками определенных видов гельминтов.
Орибатидные или панцирные, клещи (до 1 мм длины). Обитают в верхних слоях почвы. Это промежуточные хозяева мониезий жвачных и других гельминтов. Для обнаружения личинок ленточных червей (цистицерроидов) предварительно в капле воды на предметном стекле (под контролем лупы) расщепляют на части панцирь орибатидного клеща, затем препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Цистицеркоиды мониезий округлой формы (0,15-0,19 мм в диаметре), снабжены четырьмя присосками и хвостовым придатком. Они очень нежные, поэтому не следует применять метод компрессорного исследования клещей.
Дождевые черви других родов (Criodrilus, Eophila) обитают в водоемах с топкими, илистыми берегами. Они зарегистрированы в качестве промежуточных хозяев возбудителей гистрихоза и порроцекоза уток. Личинка гистрихиса очень крупная (до 3 см длины), беловатого цвета, просвечивает сквозь кожные покровы червя в виде волнистой полосы. Личинки порроцекумов в десять раз меньше предыдущей личинки (2,5-3 мм); они обнаруживаются в кровеносных сосудах при компрессорном исследовании дождевых червей под микроскопом.
Исследование бокоплавов. Бокоплавы достигают длины до 2 см, обитают в морских и пресноводных водоемах. Зарегистрированы они в качестве промежуточных хозяев возбудителей полиморфоза. стрептокароза и тетрамероза птиц. Личинок обнаруживают при компрессорном исследовании этих рачков. Личинки (акантеллы) полиморфуса овальной формы, оранжевого цвета, до 1 мм длины, заметны макроскопически.
Исследование водяных осликов. Водяные ослики от 1 до 1,5 см длины, живут в пресноводных водоемах, являются промежуточными хозяевами возбудителя филиколлеза птиц. При компрессорном исследовании можно выявить личинку (акантеллу) белого цвета, овальной формы, 0,7 мм длины.
Можно также исследовать и других промежуточных хозяев (мошек, мокрецов, мух, стрекоз, жуков, муравьев).
Люминесцентная микроскопия
Метод люминесцентной микроскопии (по В. Г. Эврановой) - новый метод диагностики гельминтозов. Он позволяет дифференцировать однотипные яйца разных видов гельминтов, а также отличать жизнеспособные яйца и личинки от мертвых. Предварительно яйца трематод, цестод и нематод обрабатывают растворами акридина оранжевого и другими флуорохромами. Жизнеспособные яйна и личинки нематод не люминесцируют или слабо люминесцируют, в то время как мертвые ярко светятся и окрашены в оранжевый, желто-зеленый или желтый цвет.
При люминесцентной микроскопии можно дифференцировать яйца главнейших цестод плотоядных, яйца возбудителей и гетеракидоза кур, имеющих, как известно, сходное строение по величине, форме и окраске, а также различать жизнеспособные и мертвые ооцисты кокцидий.
Препараты просматривают под микроскопом МУФ-3 или МЛ-2. Методика люминесцентной микроскопии сравнительно проста и может быть использована в производственных условиях (ветеринарных лабораториях).
Из других исследований, имеющих подсобное значение в установлении диагноза на гельминтозы. можно указать на такие, как выяснение морфологического состава крови (учет эозинофилии), метод определения фракции белков.
Краткая характеристика яиц гельминтов
Яйца представителей разных классов различаются по величине, цвету, форме, строению оболочек и внутреннего содержимого.
Яйца трематод. Чаще овальной формы с крышечкой на одном полюсе. Оболочка гладкая. У некоторых видов оболочка снабжена филаментами (отростками), бугорками. Окраска яиц от светло-серой до коричневой (чаще желтая).
Яйца цестод. Бывают двух типов: лентецов и цепней. У лентенов они напоминают яйца трематод (овальные с крышечкой). Яйца цепней резко отличаются по строению от яиц гельминтов других классов: они чаще средней величины, округлой формы, серого цвета, зрелые (внутри зародыш - онкосфера с тремя парами эмбриональных крючьев).
Яйца нематод. Отличаются от яиц трематод отсутствием крышечки; от яиц цестод - отсутствием онкосферы.
Размеры, форма, строение и цвет оболочек яиц нематод очень разнообразны. Наружная оболочка бывает гладкой, бугристой, ячеистой: толщина оболочек варьирует от тонкой (у стронгилят) до толстой (у трихоцефал). У большинства нематод яйца овальной формы, симметричные, у некоторых - получилиндрические (у драшей). Большинство нематод выделяют наружу незрелые яйца на предсегментационной стадии или нескольких шаров дробления, меньшинство - зрелые (внутри яйца сформирована личинка).
Яйца скребней. Они имеют овальную, эллипсоидную и веретенообразную формы: размер их от среднего до крупного. Выделяемые во внешнюю среду яйца содержат внутри личинку - акантор с десятью эмбриональными крючьями (зрелые).
Клинические наблюдения
Эпизоотологические данные
При диагностике многих гельминтозов сельскохозяйственных животных значительную помощь оказывают эпизоотологические данные (неблагополучие хозяйства по конкретным болезням, сезон года, возраст больных животных, характер пастбищ и водоисточников, метеорологические условия и др.). Например, массовое заболевание с признаками брюшных водянок и падеж овец осенью после дождливого лета и использование под выпасы заболоченных участков пастбищ дает основание заподозрить острую форму фасциолеза. Заболевание гусят летом с признаками расстройства пищеварения (поносы) и нервной системы (парезы) после выпаса их на мелком стоячем водоеме, обильно заселенном циклопами, является основанием для установления предполо-жительного диагноза на дрепанидотениоз. Падеж ягнят весной (через 3-4 недели после начала пастбищного содержания) должен вызвать подозрение о заболевании молодняка овец мониезиозом. Необходимо также учитывать зональные особенности гельминтозов домашних животных, желательно в комплексе с клиническими наблюдениями.
Глава III. Диагностика гельминтозов и методы гельминтологических исследований
Необходимо обследовать на гельминтозы всех больных, обращающихся за медицинской помощью, и особенно больных, обращающихся к педиатру, терапевту и невропатологу с жалобами на явления со стороны желудочно-кишечного тракта, нервной системы и с анемией. Если врач не всегда может применить лабораторные методы исследования, то опросить больного о выделении у него гельминтов обязан каждый медицинский работник, оказывающий помощь в амбулатории или стационаре.
При наличии приведенных в соответствующих главах клинических показаний следует уточнить диагноз при помощи лабораторных методов исследования на гельминтозы.
В связи с преобладанием кишечных гельминтозов наибольшее практическое значение имеет исследование испражнений.
Методы исследования испражнений на гельминтозы
Испражнения доставляются в лабораторию в чистой стеклянной посуде (около четверти стакана испражнений, взятых из разных мест одной порции); при плановом обследовании допускается доставка испражнений в лабораторию в спичечных или лубочных коробочках.
Для контроля дегельминтизации доставляется (по назначению врача) вся порция испражнений, собранная после приема противоглистного средства и слабительного (в больших закрытых стеклянных банках, ведрах).
Микроскопическое исследование испражнений является основным при диагностике кишечных гельминтозов; ему всегда должен предшествовать общий макроскопический осмотр фекалий для обнаружения члеников крупных цестод, остриц, аскарид и др.
Испражнения должны быть свежими или консервированными (в 5% растворе формалина), так как высыхание резко изменяет структуру яиц. Кроме того, при стоянии фекалий происходит быстрое развитие яиц некоторых гельминтов (например, анкилостом), что затрудняет диагностику.
Согласно инструкции Министерства здравоохранения СССР, необходимо исследовать испражнения одновременно по методу Фюллеборна и нативного мазка.
Нативный мазок
Нативный мазок: небольшой кусочек фекалий (с горошину), взятый спичкой, стеклянной или деревянной палочкой из разных мест доставленной порции, тщательно растирают на предметном стекле в капле 50% раствора глицерина или в физиологическом растворе, или в воде. Накрывают покровным стеклом, слегка надавливая последнее (препаровальной иглой). Мазок должен быть тонким, прозрачным и равномерным. Он применяется лишь как дополнение к другим методам, дающим обогащение препарата. Просматривать следует не менее двух препаратов.
С целью обнаружения личинок гельминтов (а также яиц их) нативный мазок делается следующим образом (по Шульману): 2-3 г фекалий тщательно размешивают «закручиванием» стеклянной палочкой в эмульсию с пятикратным количеством чистой воды или физиологического раствора. Во время размешивания личинки скопляются у стеклянной палочки, поэтому тотчас после окончания размешивания каплю эмульсии быстро переносят стеклянной палочкой на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют. С. Д. Любченко (1936) доказала, что метод закручивания является более эффективным, чем метод мазка, особенно в отношении яиц аскарид. На основании работы С. Д. Любченко мы считаем целесообразным заменить метод мазка методом закручивания.
Метод Фюллеборна
Метод Фюллеборна: 5-10 г фекалий, взятых из разных мест, помещают в баночку емкостью в 50-100 мл и тщательно растирают стеклянной или деревянной палочкой в насыщенном растворе поваренной соли (400 г этой соли растворяют в 1 л воды, нагревают до кипения и фильтруют через слой ваты или марли; раствор употребляется холодный: удельный вес 1,2). Раствор приливают постепенно, пока не получится равномерная суспензия, причем общее количество приливаемого раствора должно быть приблизительно в 20 раз больше количества фекалий. Для перемешивания фекалий Фюллеборн рекомендовал употреблять чайные стаканы, но удобнее готовить суспензию в баночках для мази емкостью в 50-100 мл, используя по две баночки на каждый анализ (или в стаканчиках емкостью в 100 мл).
Тотчас после приготовления суспензии с поверхности ее удаляют шпателем, металлическим совочком или кусочком чистой бумаги всплывшие на поверхность крупные частицы (растительные образования, непереваренные остатки пищи и пр), после чего смесь оставляют стоять на 1-1,5 часа. По истечении этого времени с поверхности смеси снимают всю пленку прикосновением проволочной или платиновой петли (плашмя) диаметром не больше 1 см, согнутой под прямым углом; пленку стряхивают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Под каждое покровное стекло (18х18 мм) помещают 3-4 капли. Всего следует приготовить не менее 4 препаратов (на каждый препарат - одно покровное стекло). Петлю прокаливают на огне и промывают водой после каждого анализа.
По методу Фюллеборна быстро и легко обнаруживаются яйца всех нематод (за исключением неоплодотворенных яиц аскарид) и яйца карликового цепня.
Метод Бермана применяется для исследования испражнений на личинки гельминтов (при стронгилоидозе). Этот метод заключается в следующем: 5 г фекалий на металлической сетке (для этих целей удобна цедилка для молока) помещают на стеклянную воронку, прикрепленную к штативу. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом.
Сетку с калом приподнимают и в воронку наливают нагретую приблизительно до 50° воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки с калом была погружена в воду. Личинки активно переходят в воду и скопляются в нижней части резиновой трубки. Через 2-4 часа открывают зажим и жидкость спускают в одну или две центрифужные пробирки.
После центрифугирования в течение 1-2 минут верхнюю часть жидкости быстро сливают, а осадок наносят каплями на предметные стекла и исследуют под покровными стеклами или распределяют тонким слоем на 2-3 больших стекла и тогда исследуют без покровных стекол.
Метод Бермана применяется также и для исследования почвы на наличие личинок анкилостом.
Метод Столла
Метод Столла применяется для определения интенсивности инвазии. В специальную стеклянную колбочку наливают децинормальный раствор едкого натра до метки 56 см 3 , а затем прибавляют испражнения до тех на пор, пока уровень жидкости не достигнет 60 см 3 , т. е. 4 см 3 . После взбалтывания со стеклянными бусами берут для исследования 0,075 мл смеси и исследуют под одним-двумя обычными покровными стеклами. Полученную сумму умножают на 200, чтобы получить количество яиц, содержащихся в 1 см 3 испражнений.
Исследование дуоденального содержимого
Дуоденальный сок и пузырную желчь, полученные обычным путем при помощи зондирования (а пузырную желчь и после рефлекса с желчного пузыря), тщательно смешивают с равным объемом этилового эфира; смесь центрифугируют, после чего осадок исследуют под микроскопом. Помимо осадка, микроскопическому исследованию обязательно подвергаются плавающие в жидкости хлопья, в которых могут находиться яйца гельминтов. При исследование на яйца гельминтов желудочного сока и рвотных масс можно пользоваться этой же методикой.
Исследование дуоденального сока и содержимого желудка необходимо производить при подозрении на глистные заболевания печени, желчного пузыря (описторхоз, фасциолез, дикроцелиоз) и двенадцатиперстной кишки (стронгилоидоз).
Исследование мокроты
Мокроту растирают по стеклянной пластинке, плотно накрывают другой стеклянной пластинкой и рассматривают невооруженным глазом на светлом и черном фоне, а также под лупой при проходящем свете. Отдельные кусочки мокроты («ржавые» скопления, обрывки тканей и пр.) наносят тонким слоем на предметное стекло, плотно накрывают его покровным и исследуют при малом и большом увеличении микроскопа.
а) Для диагносцирования цистицеркоза кожи, подкожной клетчатки или мышц, асептически вырезанный кусочек соответствующей ткани исследуют сначала не вооруженным глазом. Участки тканей раздвигают при помощи препаровальных игл с целью обнаружения видимого простым глазом пузырька - цистицерка (фото А); длина его 6-20 мм, ширина 5-10 мм. При обнаружении пузырька, подозрительного на цистицерк, он раздавливается между двумя предметными стеклами и рассматривается под микроскопом. Цистицерк (Cistycercus cellulosae) определяется по наличию сколекса с четырьмя присосками и венчиком крючьев (фото Б).
| Фото. А — цистицерки с вывернутыми наружу сколексами; Б — Головка свинного цепня. | |
 |
 |
б) Для диагносцирования трихинеллеза асептически вырезанный кусочек мышцы (двуглавой или икроножной) тщательно измельчают в 50% растворе глицерина на тончайшие волоконца с помощью препаровальных игл. Измельченные мышцы сдавливаются между двумя предметными стеклами и исследуются при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения. Исследование мышц на трихинеллез рекомендуется производить не ранее чем на 8-й день заболевания. Личинки трихинелл находятся в мышцах в свернутом спиралью положении: они заключены в лимонообразные капсулы.
| Фото. А —Личинки трихинелл в мышцах; Б — Обызвествленные капсулы трихинелл. | |
 |
 |
Рентгеноскопия
Наиболее часто рентгеноскопия применяется для диагносцирования эхинококкоза и реже - цистицеркоза. Цистицерки обнаруживаются при рентгеноскопии только после обызвествления (в случаях длительного заболевания). За последние годы рентгеноскопия применяется и для диагносцирования аскаридоза как в ранней личиночной стадии, так отчасти и в кишечной стадии.
В период миграции личинок аскарид (и анкилостомид) в легких выявляются нестойкие, иногда множественные воспалительные очаги; одновременно в крови появляется значительная эозинофилия.
Половозрелые аскариды хорошо видны при рентгеноскопии кишечника пораженных лиц. Этот метод, несмотря на его сложность и громоздкость, должен быть использован как дополнительный для диагностики аскаридоза в случаях с отрицательным копрологическим анализом. По данным Е. С. Геселевич, из 180 больных аскаридозом, выявленных при рентгеноскопии, у 54 в кале не было обнаружено яиц аскарид (смотри ).
При обнаружении яиц гельминтов на различных объектах окружающей среды (почва, вода, овощи и др.) всегда необходимо определять их жизнеспособность по внешнему виду, окрашиванием витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е.
Скармливанием лабораторным животным.
Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли - так называемые нитки жемчуга.
Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.
У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы.
Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина 0,5 г, натрия бикарбоната 0,09 г, дистиллированной воды 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36-38 “С на 4 ч. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6-8 ч в термостате при 38 °С.
Если поместить яйца тениид в 1 % раствор натрия сульфида, или 20 % раствор натрия гипохлорида, или же в 1 % раствор хлорной воды при 36-38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 сут. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10 мин - 2 ч. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1 % раствора натрия хлорида, 0,5 % раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36- 38 °С.
Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при слабом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводковые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с луночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом с нагревательным столиком при температуре 38-39 °С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные сколексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, удлиняя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5-1 % водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежизнеспособные сколексы при этом не вывертываются.
Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.
Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по расположению крючьев на зародыше.
В живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятникообразные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в стороны от средней пары.
Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться сначала от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.
В живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев расположены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сближены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом менее 45°.
Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздвигает крючья. В погибшем зародыше движение крючьев прекращается, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты под прямым, тупым или острым углом.
Иногда наблюдаются сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5-10 до 38-40 °С.
Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3 % раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24-30 °С, яйца власоглавов в 3 % раствор соляной кислоты при температуре 30-35 °С, яйца остриц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37 “С. Чашки Петри следует открывать 1-3 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.
Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2-3 мес свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых суток развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.
Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1-2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25-30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5-7 сут они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом. Естественно развивающиеся в воде яйца трематод, например описторхов, дифиллоботриид, фасциол и др., помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они быстрее развиваются в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22-24 °С через 9-12 сут формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. При культивировании воду меняют через 2--3 сут.
Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26-30 °С в течение 5-6 сут личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюллеборна).
Метод Harada и Mori (1955). В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровально# бумаге (15X150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накрывают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер и фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят в течение 8-10 сут при температуре 28 °С. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.
Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.
Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными, представленными в табл. 13.
Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов. Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.
Таблица 13. Дифференциальная диагностика филярневидных личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.
Для дифференциального распознавания живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.
Для окраски живых и мертвых тканей используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцируют метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.
Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают, зародыши мертвых яиц окрашиваются в синий цвет.
Метод окрашивания неприменим для незрелых яиц аскарид и власоглавов; пигментированная оболочка прокрашивается, и поэтому не видно, окрасилась ли зародышевая клетка внутри яйца.
Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10 ООО осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости, после чего этот же препарат просматривают повторно через 2-3 ч. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 ч. Мертвые личинки окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).
Указывается на возможность окраски препаратов раствором йода при определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц. В качестве красителя в этом случае используют 5 % спиртовой раствор йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1-3 с окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторха и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10 000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают сафранином (в разведении 1:10 000 10 % раствора спирта). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин придает им красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет, зародыш у мертвых - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином либо в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000 или же индигокармином в разведении 1:1000-1:2000.
Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2-7 ч.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезиловый синий (1:8000) - через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 - в течение 3-5 ч; 3) 50 % раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 ч при температуре 29-30 “С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).
Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокрашиваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5-20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно достаточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообразно применять метиленовый синий для окрашивания мертвых плероцеркоидов.
Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в качестве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивировании плесневого гриба Peniciliium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.
Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежизнеспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкилостомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид - красный. Менее яркая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый цвет: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.
Физико-химические методы стимуляции выхода мирацвдия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физикохимической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздействием на яйца трематоды специальной реакционной среды в сочетании с последовательными приемами - созданием перепада температур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.
Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предварительно охлаждают до 10-12 °С. Все последующие операции осуществляют при комнатной температуре (18-22 °С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержащей 100-400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5-10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осторожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробирку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного светового микроскопа (Х200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка активно выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3-5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красителем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчитывают мирацидии.
Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 М трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0-9,5. В буфер добавляют этанол до 10-13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работающий в щелочных пределах pH, например 0,05 М фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол - 12 частей; краситель (маточный раствор) - 1-10 частей; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей - 0,05 М трис-HCl буфер, pH 9,5.
Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Герман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц трематоды, помещают в центрифужную пробирку на 1-2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипеткой 1-2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28-30 °С 2-3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (18-22 °С), при этом каждые 25-30 мин (по мере подсыхания) добавляют по 1-2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллированной воде. После этого препарат микроскопируют при 100-200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу раскрывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3-7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30-40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5-0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1- 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05-0,4 %) обусловливает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких прозрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окрашивания и подсчета мирацидиев.
Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов.
Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены в 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.
Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).
Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.
Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевым в разведении 1:10 ООО и 1: 50 ООО от 30 мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.
Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.
При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином - у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.
Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке растворами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюорохромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яркое свечение.
Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10-15 мин после гибели проявляются ярким «горящим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.
Методы прижизненной лабораторной диагностики гельминтозов:
— гельминтокопрологические исследования;
— гельминтоовоскопические исследования;
— гельминтоларвоскопические исследования;
— иммунобиологическая диагностика;
— диагностическая дегельминтизация и другие методы;
Методы посмертной диагностики:
— патологоанатомические исследования;
— полные и неполные гельминтологические вскрытия органов и тканей (ПГВ и НПГВ).
Прежде чем перейти перечисленных выше вопросов данной темы, считаю уместным дать определение понятия «инвазия» и «инвазионные болезни».
Инвазионные болезни могут протекать как в клинически выраженной форме со значительной смертностью, так и в скрытой (латентной) форме.
В диагностике инвазионных болезней решающее значение имеют лабораторные исследования, в результате которых устанавливается возбудитель.
Рассмотрим методы прижизненной диагностики гельминтозов. Для этого используют как макро- , так и микроскопические исследования, прежде всего фекалий, мочи, крови, дермы, содержимого полостей организма и др. Эти методы гельминто-диагностических исследований, направленные на отыскание и изучение самих гельминтов, их фрагментов Илии яиц и личинок наиболее доказательны и широко применяются для диагностики гельминтозов.
Материал для диагностических исследований должен быть свободен от всяких посторонних примесей и загрязнений, фекалии рекомендуется брать из прямой кишки животного, они должны быть свежими, их следует держать на холоде (не >5 о С), можно также консервировать 5-10 % раствором формалина или карболовой кислоты.
Гельминтоскопия – применяется для обнаружения в фекалиях целых экземпляров гельминтов или их фрагментов, особенно при исследовании на цестодозы кишечника. Этот метод используется также для контроля эффективности проведённой дегельминтизации, для учёта количества изгнанных гельминтов. Для этих исследований необходимо брать всю единовременную порцию фекалий, а с целью учёта эффективности дегельминтизации следует собирать все экскременты, выделенные животным в течение 2-4 суток после обработки. Собранные фекалии предварительно осматривают невооружённым глазом. Затем их помещают в металлический сосуд, разбавляют 5-10 кратным количеством воды, перемешивают и дают некоторое время отстояться, затем верхний слой сливают (до осадка) и снова добавляют воду. Эти манипуляции последовательного промывания и отстаивания проделывают несколько раз. Полученный осадок небольшими порциями исследуют в кюветках (чашках Петри) на белом и чёрном фоне. Всех видимых гельминтов выбирают иглой и исследуют под микроскопом, устанавливая вид.
Гельминтоовоскопия – это методы диагностики гельминтозов в результате обнаружения в материале яиц гельминтов. Для проведения таких исследований применяют следующее оборудование и средства: микроскоп биологический, предметные стёкла, чашки Петри, стакана стеклянные или пластмассовые (диаметром не > 4-5 см), мензурки объёмом 50 мл, фильтрационные ситечки (с капроновой сеткой, чулочной), стеклянные палочки, металлические петли с диаметром кольца 8-10 мм.
Для диагностических исследований используют флотационные растворы. Наилучшей флотационной способностью обладают растворы при температуре 20-22 о С. Плотность раствора уточняем денсиметром. Насыщенный раствор технической селитры или аммония нитрата с плотностью 1,32 (1500 г на 1 литр кипящей воды); натриевой селитры или натрия нитрата с плотностью 1,38 (соотношение соли и горячей воды 1:1); магния сульфата (сернокислая магнезия)с плотностью 1,26-1,28 (920 г на 1 литр горячей воды); натрия тиосульфата или гипосульфита натрия, плотностью 1,38-1,40 (1750 г на 1 литр кипящей воды); сульфат цинка плотностью 1,24 (400 г на 1 литр воды); поваренная соль, плотностью 1,2 (400 г соли в 1 литре воды нагревают до кипения), применяют в холодном состоянии.
Самый простой метод гельминтоовоскопического исследования фекалий – это метод нативного мазка. Небольшой кусочек фекалий помещают на предметное стекло, добавляют 2-3 капли смеси равных частей глицерина и воды, тщательно смешивают, покрывают покровным стеклом и смотрят под микроскопом. Этот метод ненадёжный, так как при слабой инвазии даёт отрицательный результат.
Метод последовательного промывания (метод осаждения, седиментации) применяют для диагностики трематодозов животных, яйца возбудителей которых имеют большой удельный вес и не улавливаются методом всплывания (флотации). Берут 5 г фекалий, смешивают с10 кратным количеством воды, фильтруют через сито или марлю и фильтрат отстаивают 5 минут. Далее жидкость сливают, а к осадку добавляют чистую воду и снова отстаивают 5 минут. До тех пор пока жидкость не станет прозрачной. Жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом на наличие трематод.
Для диагностики нематодозов и цестодозов чаще всего используют флотационные методы. Наиболее распространённый и чаще применяемый – метод Фюллеборна. Для этого берут 10-20 г фекалий, помещают его в банку или стакан ёмкостью 100-200 мл, тщательно растирают стеклянной или деревянной палочкой в насыщенном растворе поваренной соли. Общее количество добавляемого раствора должно быть примерно в 20 раз больше количества фекалий. Затем фильтруем и оставляем на 30 минут. С поверхности отстоявшейся жидкости металлической петлёй снимаем плёнку и переносим её на предметное стекло, покрываем покровным стеклом и исследуем под микроскопом. Метод Щербовича используют для обнаружения яиц с более высокой плотностью (например, яйца метастронгилид), для чего используют насыщенный раствор сернокислой магнезии. Пробу фекалий (3-5 г) размешивают в воде до получения равномерной взвеси. Фильтруем через ситечко в центрифужную пробирку и центрифугируем 1-2 минуты. Верхний слой сливают, а к осадку добавляют насыщенный раствор сернокислой магнезии, хорошо размешиваем и снова центрифугируем 1-2 минуты. Затем металлической петлёй снимают верхнюю плёнку, помещают её на предметное стекло, накрывают покровным и исследуем под микроскопом.
Метод Котельникова и Хренова. Пробу фекалий (3 г) кладут в стакан и заливают небольшим количеством насыщенного раствора аммиачной селитры, размешиваем стеклянной (деревянной) палочкой и добавляем раствор до 50 мл. Взвесь фильтруем в другой стакан и оставляем на 10-15 минут. Снимаем петлёй 3-4 капли с поверхности, переносим их на предметное стекло и микроскопируем под малым увеличением микроскопа. Обнаруживаем яйца аскарид, трихоцефал, эзофагостом, стронгилоидесов, метастронгилид, неоаскарид, стронгилят органов пищеварения, мониезий и тизаниезий, параскарид, токсокарисов и др.
Метод Н.В. Демидова для диагностики фасциолёза. Пробу фекалий (3г от овец, 5 г от крупного рогатого скота), помещают в стакан, наливают насыщенный раствор хлористого натрия, тщательно размешиваем стеклянной палочкой, отстаивают 15-20 минут. С поверхности удаляют крупные частицы; жидкость отсасывают спринцовкой, или осторожно сливают, оставляют примерно 20-30 мл, к осадку добавляют воду до полного объёма стакана, тщательно размешивают, фильтруют через сито или 1 слой марли; жидкость снова отсасываем, оставляя 15-20 мл осадка; осадок переливают в маленькие конические стаканы, отстаиваем 3-5 минут, жидкость отсасываем и на предметное стекло переносим осадок, исследуя его под малым увеличением микроскопа.
Метод Дарлинга комбинирует процедуры осаждения и флотации. Фекалий смешивают с водой и центрифугируют 3-5 минут. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку прибавляют жидкость Дарлинга (глицерин с насыщенным раствором хлористого натрия, 1:1), тщательно размешивают и вторично центрифугируют 3-5 минут. Металлической петлёй снимаем плёнку на предметное стекло, накрываем покровным и исследуют.
Есть ещё много модифицированных методов исследования с целью обнаружения яиц гельминтов. Существуют стандартизированные методы Фюллеборна, Щербовича и др. При всех исследованиях берут одинаковую посуду, одно и то же время отстаивают и центрифугируют пробы, пользуются петлями одинакового диаметра и, сравнивая число яиц в поле зрения микроскопа или в одной капле поверхностной плёнки до и после обработки животных, судят об эффективности проведённой дегельминтизации. Наиболее простой и достаточно точной является методика, предложенная М.Ш.Акбаевым с использованием сетки, изготовленной из фотоплёнки после рентгеновских снимков. Кроме того, используются количественные гельминтоовоскопические исследования.
Метод Стола. В 100 мл колбочку наливают вначале 56 мл воды и отмечают снаружи на уровне её мениска. Потом наливают ещё 4 мл воды и делают новую отметку. Воду выливают, а в градуированную колбочку наливают 56 мл 0,1н раствора едкого натра, добавляют столько фекалий, чтобы уровень жидкости достиг отметки 60 мл. (4 см 3 фекалий), всыпают 10-15 бусинок, тщательно взбалтывают. Сразу же после взбалтывания градуированной пипеткой набирают 0,075 мл или 0,1 мл смеси, наносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом, подсчитывая число яиц гельминтов. Количество яиц в 1 см 3 (1 г) фекалий, найденное число яиц умножают на 200 (если исследовали 0,075 мл смеси) или на 150 (если 0,1 мл смеси).
Гельминтоларвоскопические исследования применяются для диагностики диктиокаулёза, мюллериоза и др. протостронгилидозов, а также стронгилятозов пищеварительного тракта жвачных и стронгилоидозов разных животных.
Метод Бермана и Орлова. 10 г фекалий помещают в воронки аппарата Бермана на металлической сетке или завёрнутые в кусочки марли. Заливают водой комнатной температуры и оставляют на 3-6 часов. За это время личинки выползают из пробы в жидкость и опускаются по трубке на дно пробирки. Жидкость из пробирки сливают и отсасывают. Осадок после встряхивания разливают на предметное стекло и микроскопируют при малом увеличении микроскопа. Личинки нематод подвижны и легко обнаруживаются.
Упрощённая модификация метода Бермана (по Шильникову). В стакан с водой кладут пробы фекалий и завёрнутые в марлевые салфетки. Через 3-6 часов пробы вынимают, жидкость отстаивают 10-15 минут, затем пипеткой отсасывают прозрачный слой воды. Затем каплю осадка пипеткой наносят на предметное стекло для микроскопии.
Метод седиментации с центрифугированием. (экспресс-методика по Котельникову и др.). 3-5 г фекалий кладут в пробирки с водой (20-25 о С) и центрифугируют (1000-1500 оборотов в минуту) 2 минуты. Затем воду сливаем, а осадок, встряхнув, выливают на предметное стекло и исследуют на наличие личинок.
Метод Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков фекалий от овец, коз и добавляют воды температурой 40 о С. Через 4о минут шарики удаляют и исследуют под микроскопом жидкость, оставшуюся на стекле на наличие личинок нематод. Обнаруженных разными методами личинок необходимо дифференцировать.
Исследование крови по Куликову. Из ярёмной вены набирают 20 мл крови и добавляют 2 мл 3,8 % водного раствора лимонно-кислого натрия и отстаивают в течение 20-25 минут. Образуется 3 слоя: нижний – осевшие эритроциты, средний – лейкоциты и личинки нематод и верхний – сыворотка. Тонкой пипеткой, берут содержимое среднего слоя, наносят его каплями на предметное стекло, накрывают покровным и смотрят под микроскопом.
Исследование крови крупного рогатого скота (по Стюарду). Кожу освобождаем от волос, место дезинфицируем. Пинцетом оттягиваем кожу и кривыми ножницами отрезают поверхностный слой. Помещают на предметное стекло в каплю физраствора и тщательно расщепляют препаровальными иглами. Жидкость исследуют под микроскопом.
Исследование кожи лошадей по Р.С.Чеботарёву. На холке, плече, других местах выбирают участок кожи размером 5 см 2 , дезинфицируем спиртом. Захватываем кожу в складку, отрезаем кусочек толщиной 3-4 мм и площадью 2-3 см 2 . Срезы помещают в пробирке и заливают 2-3 мл физраствора и оставляют на несколько часов в термостате при 36-37 о С или при комнатной температуре. Затем содержимое пробирки выливаем на часовое стекло и исследуют под микроскопом, с целью обнаружения личинок онхоцерков.
Иммунобиологическая диагностика. В практике используют аллергические реакции для диагностики тканевых гельминтозов или, так называемых, ларвальных цестодозов, таких как эхинококкоз, ценуроз, цистицеркозы, а также нематодозов как трихинеллёза. Для этого применяют внутрикожную пробу. В качестве антигена рекомендуют жидкость из личинок (пузырей) или экстракты из трихинелл и их личинок.
В настоящее время большое внимание уделяют разработке и использованию серологических реакций, используя в качестве антигенов живых личинок гельминтов. По этому принципу ставят реакции микропреципитации на живых личинках нематод при нематодозах, на церкариях — при трематодозах, на онкосферах и сколексах — при ларвальных цестодозах. Другой принцип серологических реакций связан с использованием соматических антигенов. Применяют реакции гемагглютинации и флоккуляции (агглютинации) с адсорбированными антигенами. В качестве адсорбентов используют кармин, бентонит и латекссинтетическая смола.
Разновидностью серологических реакций являются: реакция сколексопреципитации (РСкП), разработанная Р.С.Шульц и Р.Г.Исмагиловой для диагностики эхинококкоза овец. Другие реакции: РНГА, РЗГА и др.
Диагностическая дегельминтизация является методом макрогельминтоскопи-ческого исследования. Используют её при подозрении на мониезиоз, тизаниезиоз, авителлиноз жвачных, аноплоцефалидозы лошадей, тениидозы плотоядных, дрепанидотениоз водоплавающих птиц, аскаридоз свиней, аскаридиоз кур и др. небольшой группе животных; наиболее подозрительных в заболевании, вводят соответствующий антгельминтик в лечебной или заниженной дозе. За животными наблюдают и проверяют все выделенные экскременты с целью обнаружения гельминтов или их фрагментов, которые в дальнейшем исследуют.
И, наконец, методы исследования других органов.
Исследование мочи: при диоктофимозе почек, капилляриозе мочевого пузыря. Мочу следует предварительно просмотреть макроскопически или при помощи лупы на наличие гельминтов или их фрагментов. Мочу разбавляют пополам дистиллированной водой и центрифугируют 2-3 минуты, жидкость сливают, а осадок наносят на предметные стёкла и исследуют.
Исследование содержимого трахеи птиц: в ней хорошо видны сингамусы или циатостомы, которые обычно имеют яркокрасный цвет.
Исследование камеры глаза. Прижизненная диагностика сетариоза глаз лошадей и крупного рогатого скота — проводят макроскопическим исследованием передней камеры поражённого глаза, где можно видеть свободноплавающих сетарий (5-10 см) и хорошо просвечивает даже через помутневшую роговицу.
Исследование поверхностного соскоба с перианальных складок: палочку или спичку, смоченную 50 % водным раствором глицерина делают соскоб с перианальных складок с внутренней стороны корня хвоста и с области промежности. Соскоб переносят на предметное стекло в 2-3 капли глицерина (1:1 в воде), покрываем покровным стеклом и исследуем под микроскопом на наличие яиц оксиурат.
Методы посмертной диагностики гельминтозов
— патологогистологические исследования. Посмертная диагностика гельминтозов различных стадий их развития в органах и тканях животных. Наиболее совершенная методика гельминтологического вскрытия разработана К.И.Скрябиым. Различают полное и неполное гельминтологическое вскрытие.
Полное гельминтологическое вскрытие – наиболее надёжный метод, позволяющий производить как количественный, так и качественный учёт всех гельминтов, которыми инвазировано животное.
Суть данного метода: после снятия с трупа кожи, тщательно осматривают подкожную клетчатку, затем вскрывают грудную и брюшную полости и извлекают все органы систем: пищеварительную, дыхательную систему, кровеносную, мочеполовую и др.
Органы отделяют и исследуют порознь, при этом используют метод последовательных смывов. Паренхиматозные органы (печень, лёгкие, поджелудочная железа, почки и др.) помещают в отдельную посуду и превращают в фарш, разрывая руками или разрезая на мелкие кусочки ножом или ножницами. Далее этот детрит отмывают водой или физраствором, пользуясь методом последовательных смывов. Полученный осадок изучают небольшими порциями сначала в чёрных, а затем в белых кюветах или в чашках Петри на чёрном и белом фоне. Крупных гельминтов выбирают визуально, а мелких – при помощи ручной лупы с 8-10-кратным увеличением. Собирают гельминтов только кисточкой или препаровальными иглами, но не пинцетом и непальцами.
НПГВ – упрощённое гельминтологическое вскрытие, в процессе которого извлекают из органов и тканей лишь отдельных резко выделяющихся по размерам гельминтов. Его используют также для получения музейного материала.
Гельминтологические исследования объектов внешней среды. Сбор консервирование и пересылка гельминтов. Фиксация, окраска гельминтов и приготовление из них постоянных микропрепаратов. Приготовление музейных макропрепаратов. Лабораторная диагностика трематодозов. Диагностика: фасциолёза, дикроцелиоза, описторхоза, парамфистоматоза, простогонимоза птиц, эхиностомоза уток и гусей.