مطالعه باکتری ها از اهمیت عملی زیادی برای انسان برخوردار است. تا به امروز تعداد زیادی پروکاریوت کشف شده است که از نظر بیماری زایی، ناحیه توزیع، شکل، اندازه، تعداد تاژک ها و سایر پارامترها با یکدیگر متفاوت هستند. برای بررسی دقیق این سویه، از روش تحقیق باکتریولوژیک استفاده شده است.
چه روش های سلولی وجود دارد؟
برای تعیین بیماری زا بودن باکتری ها، کشت به روش های مختلف آزمایش می شود. از جمله:
1. روش باکتریوسکوپی.
2. روش باکتری شناسی.
3. روش بیولوژیکی.
باکتریوسکوپی و باکتریولوژیکی مستقیماً بر اساس کار با سلول های پروکاریوتی است، زمانی که تجزیه و تحلیل بیولوژیکی برای مطالعه تأثیر چنین سلول هایی بر روی ارگانیسم زنده حیوانات آزمایشی مورد نیاز است. بر اساس میزان تظاهرات برخی از علائم بیماری، دانشمند می تواند در مورد وجود یا عدم وجود باکتری های بیماری زا در نمونه نتیجه گیری کند و همچنین به طور طبیعی آنها را در بدن حیوان تکثیر کند تا کشت آنها را به دست آورد و در کارهای دیگر از آنها استفاده کند. .
روش تحقیق باکتری شناسی با روش باکتریوسکوپی متفاوت است. در مرحله اول، از یک کشت مخصوص تهیه شده از پروکاریوت های زنده برای تجزیه و تحلیل استفاده می شود، در حالی که در دوم، کار با سلول های مرده یا زنده روی یک اسلاید شیشه ای انجام می شود.
مراحل روش تحقیق باکتریولوژیک. میکروبیولوژی
اصل مطالعه خواص یک کشت باکتریایی می تواند هم برای میکروبیولوژیست هایی که هدفشان مطالعه سلول های پروکاریوتی است و هم برای تکنسین های آزمایشگاهی که وظیفه آنها تشخیص بیماری زایی یا غیر بیماری زایی باکتری ها است و سپس تشخیص بیمار مفید باشد. .
روش بررسی باکتری ها به سه مرحله تقسیم می شود:
1. جداسازی باکتری از نمونه اولیه.
2. کاشت باکتری و رشد و مطالعه خواص آن.
مرحله اول
نمونه یا اسمیر از سطح آزاد محیط یا از بیمار گرفته می شود. بنابراین، ما یک "کوکتل" از بسیاری از انواع باکتری ها را دریافت می کنیم که باید روی یک محیط غذایی تلقیح شوند. گاهی اوقات می توان بلافاصله باکتری های لازم را با دانستن مناطق توزیع آنها در بدن جدا کرد.
پس از دو یا سه روز، کلنی های مورد نیاز انتخاب شده و با استفاده از یک حلقه استریل روی محیط جامد در ظروف پتری کاشته می شوند. بسیاری از آزمایشگاه ها با لوله های آزمایشی کار می کنند که ممکن است حاوی مواد مغذی جامد یا مایع باشند. روش تحقیق باکتریولوژیک در میکروبیولوژی به این صورت است.
فاز دوم
پس از به دست آوردن کلونی های جداگانه باکتری ها، آنالیز مستقیم ماکرو و میکرو انجام می شود. تمام پارامترهای کلنی ها اندازه گیری می شود، رنگ و شکل هر یک از آنها تعیین می شود. اغلب، کلنی ها روی یک ظرف پتری و سپس در ماده اولیه شمارش می شوند. این در هنگام تجزیه و تحلیل باکتری های بیماری زا مهم است که تعداد آنها درجه بیماری را تعیین می کند.
روش تحقیق باکتریولوژیک که مرحله دوم آن مطالعه کلنی های منفرد میکروارگانیسم ها است، می تواند با روش بیولوژیکی برای تجزیه و تحلیل باکتری ها ترکیب شود. یکی دیگر از اهداف کار در این مرحله افزایش مقدار مواد اولیه است. این را می توان روی یک محیط غذایی انجام داد، یا می توانید آزمایشی را در شرایط طبیعی روی موجودات زنده آزمایشی انجام دهید. باکتری های بیماری زا تکثیر می شوند و در نتیجه خون حاوی میلیون ها سلول پروکاریوتی خواهد بود. از خون گرفته شده به راحتی می توان مواد کار لازم برای باکتری ها را تهیه کرد.
مرحله سوم
مهمترین بخش این مطالعه تعیین خواص مورفولوژیکی، بیوشیمیایی، سم زایی و آنتی ژنی کشت باکتریایی است. این کار با کشت های قبلی "تصفیه شده" روی یک محیط غذایی و همچنین با آماده سازی (اغلب رنگ آمیزی شده) در زیر میکروسکوپ انجام می شود.
روش تحقیق باکتریولوژیکی به ما امکان می دهد تعیین کنیم که آیا باکتری های بیماری زا یا فرصت طلب به یک یا گروه سیستماتیک دیگر تعلق دارند و همچنین مقاومت آنها را در برابر داروها تعیین کنیم. مرحله 3 - آنتی بیوتیک ها، یعنی تجزیه و تحلیل رفتار سلول های باکتریایی در حضور داروها در محیط.
مطالعه مقاومت یک کشت به آنتی بیوتیک زمانی از اهمیت عملی بالایی برخوردار است که نیاز به تجویز داروهای ضروری و مهمتر از همه موثر برای یک بیمار خاص باشد. اینجاست که روش تحقیق باکتریولوژیک می تواند کمک کند.
یک محیط غذایی چیست؟
برای رشد و تکثیر، باکتری ها باید در محیط های غذایی از قبل آماده شده باشند. از نظر قوام آنها می توانند مایع یا جامد و از نظر منشا - گیاهی یا حیوانی باشند.
الزامات اساسی برای محیط های غذایی:
1. عقیمی.
2. حداکثر شفافیت.
3. شاخص های بهینه اسیدیته، فعالیت آب و سایر مقادیر بیولوژیکی.
به دست آوردن کلنی های جدا شده
1. روش دریگالسکی. این شامل اعمال یک اسمیر حاوی انواع مختلف میکروارگانیسم ها بر روی یک حلقه باکتریایی است. این حلقه از اولین ظرف پتری با ماده مغذی عبور داده می شود. در مرحله بعد، بدون تغییر حلقه، روش مواد باقیمانده در ظروف پتری دوم و سوم انجام می شود. بنابراین، در آخرین نمونه های کلنی، باکتری ها خیلی متراکم تلقیح نمی شوند، در نتیجه فرصت یافتن باکتری های لازم برای کار ساده می شود.
2. روش کخ. از لوله های آزمایشی با محیط غذایی مذاب استفاده می کند. یک حلقه یا پیپت با اسمیر باکتری در آنجا قرار می گیرد و پس از آن محتویات لوله روی یک صفحه مخصوص ریخته می شود. آگار (یا ژلاتین) پس از مدتی سفت می شود و در ضخامت آن به راحتی می توان کلنی های سلولی مورد نظر را تشخیص داد. رقیق کردن مخلوط باکتری ها در لوله های آزمایش قبل از شروع کار بسیار مهم است تا غلظت میکروارگانیسم ها خیلی زیاد نباشد.
مراحلی که بر اساس جداسازی کشت مورد نظر باکتری است، بدون این دو روش یافتن کلنی های جدا شده امکان پذیر نیست.
آنتی بیوتیک
از نظر بصری، واکنش باکتری ها به داروها را می توان به دو روش عملی مشاهده کرد:
1. روش دیسک کاغذی.
2. رقیق شدن باکتری و آنتی بیوتیک در محیط مایع.
روش دیسک کاغذی نیازمند کشت میکروارگانیسم هایی است که روی یک محیط غذایی جامد رشد کرده اند. چند تکه کاغذ گرد شکل آغشته به آنتی بیوتیک روی چنین محیطی قرار می گیرد. اگر دارو با موفقیت سلول های باکتریایی را خنثی کند، پس از چنین درمانی، منطقه ای عاری از کلونی وجود خواهد داشت. اگر واکنش به آنتی بیوتیک منفی باشد، باکتری زنده می ماند.
در صورت استفاده از یک محیط غذایی مایع، ابتدا چندین لوله آزمایش با کشت باکتریایی در سطوح رقت مختلف تهیه کنید. آنتی بیوتیک ها به این لوله ها اضافه می شود و روند برهمکنش ماده و میکروارگانیسم ها به مدت 24 ساعت کنترل می شود. در نهایت، یک آنتی‌بیوگرام با کیفیت بالا به دست می‌آید که از آن می‌توان در مورد اثربخشی دارو برای یک محصول خاص قضاوت کرد.
وظایف اصلی تجزیه و تحلیل
اهداف و مراحل روش تحقیق باکتریولوژیک در اینجا نقطه به نقطه فهرست شده است.
1. مواد اولیه ای را که برای جداسازی کلنی های باکتری استفاده می شود، بدست آورید. این می تواند لکه ای از سطح هر جسم، غشای مخاطی یا حفره اندام انسان یا آزمایش خون باشد.
2. روی یک محیط غذایی جامد. پس از 24-48 ساعت، کلنی هایی از باکتری ها از انواع مختلف روی ظرف پتری قابل تشخیص است. ما بر اساس معیارهای مورفولوژیکی و/یا بیوشیمیایی مورد نیاز خود را انتخاب می کنیم و کار بیشتری با آن انجام می دهیم.
3. بازتولید فرهنگ حاصل. روش تحقیق باکتریولوژیک می تواند مبتنی بر روش مکانیکی یا بیولوژیکی افزایش تعداد کشت های باکتری باشد. در حالت اول، کار با مواد مغذی جامد یا مایع انجام می شود که روی آن باکتری ها در یک ترموستات تکثیر می شوند و کلنی های جدیدی را تشکیل می دهند. روش بیولوژیکی نیاز به شرایط طبیعی برای افزایش تعداد باکتری ها دارد، بنابراین در اینجا حیوان آزمایشی به میکروارگانیسم ها مبتلا می شود. پس از چند روز، بسیاری از پروکاریوت ها را می توان در نمونه خون یا اسمیر تشخیص داد.
4. کار با فرهنگ خالص. برای تعیین موقعیت سیستماتیک باکتری ها و همچنین تعلق آنها به پاتوژن ها، لازم است تجزیه و تحلیل کامل سلول ها با توجه به ویژگی های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی انجام شود. هنگام مطالعه گروه های بیماری زا از میکروارگانیسم ها، مهم است که بدانیم اثر آنتی بیوتیک ها چقدر موثر است.
این یک ویژگی کلی روش تحقیق باکتریولوژیک بود.
ویژگی های تجزیه و تحلیل
قانون اصلی برای انجام تحقیقات باکتریولوژیک حداکثر عقیمی است. اگر با لوله های آزمایش کار می کنید، کاشت و بذر مجدد باکتری ها باید فقط روی یک لامپ الکل گرم شده انجام شود.
تمام مراحل روش تحقیق باکتریولوژیک نیازمند استفاده از حلقه مخصوص یا پیپت پاستور است. هر دو ابزار باید از قبل در شعله یک لامپ الکلی درمان شوند. در مورد پیپت پاستور، قبل از استریلیزاسیون حرارتی، باید نوک پیپت را با موچین جدا کرد.
تکنیک کاشت باکتری نیز ویژگی های خاص خود را دارد. ابتدا هنگام تلقیح روی محیط جامد، یک حلقه باکتریایی از سطح آگار عبور داده می شود. البته حلقه باید نمونه ای از میکروارگانیسم ها را روی سطح داشته باشد. تلقیح داخلی نیز انجام می شود که در این صورت حلقه یا پیپت باید به کف پتری دیش برسد.
هنگام کار با محیط مایع، از لوله های آزمایش استفاده می شود. در اینجا مهم است که اطمینان حاصل شود که مایعات با لبه‌های ظروف شیشه‌ای آزمایشگاهی یا درپوش‌ها تماس نگیرند و ابزار مورد استفاده (پیپت، حلقه) با اجسام و سطوح خارجی تماس نگیرد.
اهمیت روش تحقیق بیولوژیکی
تجزیه و تحلیل نمونه ای از باکتری ها کاربرد عملی خود را دارد. اول از همه می توان از روش تحقیق باکتریولوژیک در پزشکی استفاده کرد. به عنوان مثال، مطالعه میکرو فلور بیمار برای ایجاد تشخیص صحیح و همچنین ایجاد دوره صحیح درمان ضروری است. یک آنتی بیوگرام در اینجا کمک می کند، که فعالیت داروها را در برابر پاتوژن نشان می دهد.
آزمایش باکتریایی در آزمایشگاه برای تشخیص بیماری های خطرناک مانند سل، تب عود کننده یا سوزاک استفاده می شود. همچنین برای مطالعه ترکیب باکتریایی لوزه ها و حفره های اندام استفاده می شود.
برای تعیین آلودگی محیطی می توان از روش تحقیق باکتریولوژیک استفاده کرد. بر اساس داده های مربوط به ترکیب کمی و کیفی یک اسمیر از سطح یک شی، درجه جمعیت یک محیط معین توسط میکروارگانیسم ها تعیین می شود.
هدف:
1. روش های مطالعه برای جداسازی کشت خالص باکتری ها
2. تسلط بر روش باکتریولوژیک تشخیص بیماری های عفونی.
پیش زمینه نظری
روش باکتریولوژیکروش اصلی برای تشخیص بیماری های عفونی است. ماهیت آن تعیین نوع عامل عفونی است؛ بنابراین، بر اساس نتایج روش باکتریولوژیک، می توان یک تشخیص علت شناسی (نهایی) انجام داد. عیب اصلی روش طول مدت مطالعه است - از 3 تا 5 روز و در برخی موارد بیشتر.
موفقیت روش باکتریولوژیک تا حد زیادی به مرحله مقدماتی بستگی دارد که شامل جمع آوری مواد آزمایش و حمل و نقل آن و ثبت ارجاع به آزمایشگاه باکتریولوژیکی است. در این مورد، رعایت تعدادی از قوانین ضروری است.
1. حصارمواد آزمایش باید قبل از شروع درمان آنتی باکتریال یا 8-10 ساعت پس از آخرین دوز آنتی بیوتیک انجام شود. برای جلوگیری از آلودگی نمونه توسط میکرو فلور محیطی، آسپسیس دقیق باید رعایت شود. برای انجام این کار، از مواد استریل استفاده کنید: الف) سواب های پنبه ای برای برداشتن مواد از زخم، از غشاهای مخاطی (چشم، حلق، بینی). ب) یک حلقه سیم برای گرفتن مواد از واژن، مقعد. ج) سرنگ برای کشیدن خون و چرک؛ د) ظروف استریل برای جمع آوری مستقیم ادرار، خلط و مدفوع.
2. حمل و نقلمواد به دست آمده باید در اسرع وقت (2-3 ساعت) در ظروف مخصوص یا جعبه های مداد پردازش شود.
3. جهتبه عنوان یک سند همراه به نمونه بالینی پیوست شده است. این شامل اطلاعات اساسی لازم برای انجام یک مطالعه میکروبیولوژیکی است:
نام خانوادگی، نام، نام خانوادگی، سن بیمار؛
تشخیص احتمالی بیماری؛
درمان ضد میکروبی قبلی؛
ماهیت مواد؛
تاریخ و زمان جمع آوری مطالب؛
هدف مطالعه؛
نام موسسه پزشکی، شماره بخش، بخش؛
امضای پزشک معالج
روش باکتری شناسی در دو مرحله انجام می شود (شکل 2.1.):
1. جداسازی یک کشت خالص از پاتوژن (1-2 روز).
2. شناسایی کشت خالص (1-3 روز).
در مرحله اول، ماده آزمایش بر روی یک محیط غذایی جامد یا مایع تلقیح می‌شود، ویژگی‌های فرهنگی ارزیابی می‌شود، کلنی‌های مشکوک انتخاب می‌شوند و روی شیب‌های آگار غربال می‌شوند. مرحله شناسایی شامل مطالعه اجباری مورفولوژی، خواص بیوشیمیایی و ساختار آنتی ژنی کشت خالص جدا شده، و همچنین مطالعات اضافی برای تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی، حساسیت فاژ، نوع فاژ، مطالعه بیماری زایی و خواص پایدار است.
سوالات برای آماده سازی:
1. قوانین جمع آوری و حمل و نقل مواد آزمایش برای تحقیقات باکتریولوژیک.
2. قوانین ثبت ارجاع برای معاینه باکتریولوژیک.
3. روش های جداسازی کشت خالص میکروارگانیسم ها.
4. روش تشخیصی باکتریولوژیک. هدف. مراحل. ارزش تشخیصی
برنامه کاری مستقل:
1. جداول «روش های جداسازی کشت خالص باکتری» و «جداسازی و شناسایی کشت خالص» را مطالعه کنید.
2. یک کشت خالص را از مخلوطی از باکتری ها جدا کنید و شناسایی آن را انجام دهید - به روش تشخیصی باکتریولوژیک مسلط شوید (کار 1)
روش های تحقیق آزمایشگاهی در تعدادی از اشکال نوزولوژیک نقش اصلی را ایفا می کنند و در تعدادی از موقعیت های بالینی نه تنها در تشخیص، بلکه در تعیین نتیجه نهایی بیماری نیز نقش تعیین کننده ای دارند. نقش تشخیص این است که تشخیص زودهنگام، دقیق، جامع و خاص، مبنایی برای درمان منطقی و مؤثر است، در بیشتر موارد امکان پیش‌بینی گزینه‌های احتمالی برای سیر بعدی و پیامدهای بیماری را فراهم می‌کند و به عنوان نقطه شروع عمل می‌کند. انجام اقدامات به موقع و هدفمند ضد اپیدمی و پیشگیرانه.
تشخیص بیماری های عفونی تقریباً همیشه شامل استفاده از مجموعه ای از روش های آزمایشگاهی است.
در شرایط مدرن، تشخیص بیماری های عفونی تمام ویژگی های سنتی خود را که در دهه های گذشته شکل گرفته است، حفظ می کند. در عین حال، بهبود مستمر تکنیک‌ها و روشهای از قبل یافت شده برای تشخیص بیماری‌ها و جستجوی موارد جدید و مؤثرتر، از جمله موارد سریع، مشخص می‌شود.
روش های زیر برای تشخیص میکروبیولوژیک عفونت های باکتریایی متمایز می شوند: باکتریوسکوپی (میکروسکوپی)، باکتریولوژیکی (فرهنگی)، بیولوژیکی (تجربی)، ایمونولوژیک (سرولوژیکی)، آلرژیک.
روش اصلی بررسی باکتریولوژیک است. این شامل تلقیح مواد آزمایش بر روی محیط های غذایی، جداسازی یک کشت خالص از پاتوژن و شناسایی آن است. نوع پاتوژن با تعدادی ویژگی تعیین می شود: مورفولوژی، خواص رنگی (قابلیت رنگ آمیزی با رنگ های مختلف)، ویژگی های فرهنگی (الگوی رشد در محیط های غذایی مصنوعی)، خواص بیوشیمیایی (تخمیر کربوهیدرات ها و پروتئین ها). تعلق نهایی کشت جدا شده به نوع خاصی از میکروارگانیسم پس از مطالعه ساختار آنتی ژنی با استفاده از واکنش های مختلف ایمونولوژیک (آگلوتیناسیون، رسوب، خنثی سازی و غیره) ایجاد می شود. به طور کلی روش تحقیق باکتریولوژیک یک مطالعه چند مرحله ای باکتریولوژیکی است که از 18 تا 24 ساعت تا چند روز به طول می انجامد.
روش باکتری شناسی مزایای بسیاری دارد. یکی از اولین آنها مطالعه ترکیب کیفی میکرو فلور ماده بیولوژیکی مورد مطالعه با کمک آن است. برای تشخیص، تعداد میکروارگانیسم ها در 1 گرم از ماده مورد مطالعه و 1 میلی لیتر مایع، به اصطلاح تعداد میکروبی کل، که در واحدهای تشکیل دهنده کولین (CFU/g یا CFU/ml) اندازه گیری می شود، مهم است. برای انجام این کار، مقدار مشخصی از ماده آزمایشی بر روی محیط‌های غذایی جامد تلقیح می‌شود؛ پس از انکوباسیون در ترموستات، تعداد کلنی‌های رشد یافته شمارش می‌شود (یک کلنی یک خوشه جدا شده قابل مشاهده از نمایندگان یک نوع میکروارگانیسم است که زمانی تشکیل می‌شود. واحد تشکیل مستعمره روی یک محیط غذایی جامد تکثیر می شود).
چشمگیرترین نتایج به دست آمده توسط میکروبیولوژی شامل ایجاد و اجرای آنتی بیوتیک ها است. با توجه به توزیع گسترده انواع باکتری های مقاوم به دارو، به منظور تجویز شیمی درمانی منطقی، لازم است آنتی بیوگرام - حساسیت به داروهای ضد باکتریایی یک فرهنگ خالص جدا شده از پاتوژن تعیین شود. برای آنتی بیوگرام از روش دیسک کاغذی یا روش رقت سریال استفاده می شود.
روش دیسک کاغذی مبتنی بر شناسایی ناحیه سرکوب رشد باکتری در اطراف دیسک هایی است که آغشته به آنتی بیوتیک هستند. هنگام استفاده از روش رقت سریال، آنتی بیوتیک را در لوله های آزمایش با یک محیط غذایی مایع رقیق می کنند، سپس به همان تعداد باکتری به لوله های آزمایش تلقیح می شود. بر اساس عدم وجود یا وجود رشد باکتری، نتایج ثبت می شود. با استفاده از روش رقت سریال، حداقل غلظت مهاری (MIC) آنتی بیوتیک تعیین می شود که برای محاسبه دوز درمانی دارو مفید است.
روش باکتریولوژیکی به فرد امکان می دهد مکانیسم های مقاومت آنتی بیوتیکی کشت های جدا شده (مقاومت به متی سیلین، تولید ب-لاکتاماز) را مطالعه کند. همچنین می توانید غلظت آنتی بیوتیک را در محل فرآیند عفونی و تغییر حساسیت آنتی بیوتیکی در طول دوره درمان ارزیابی کنید.
برای یک پزشک مهم است که بداند درمان ضد میکروبی چقدر موثر است، بنابراین می توان پویایی تغییرات در ترکیب کیفی و کمی را در طول دوره بیماری و درمان ارزیابی کرد. با استفاده از روش تشخیصی باکتریولوژیک، می توان نتیجه فرآیند عفونی - بهبود، حمل، مزمن را تعیین کرد.
عوامل اصلی بیماری های عفونی در حال حاضر میکروارگانیسم های فرصت طلب هستند که اثبات نقش آنها در پیدایش بیماری دشوار است. بنابراین، ارزیابی بیماری زایی میکرو فلورای فرصت طلب جدا شده مهم است.
بدن انسان توسط نمایندگانی از به اصطلاح میکرو فلور طبیعی زندگی می کند که تغییرات در ترکیب کیفی و کمی آن می تواند در ایجاد اختلالات دیس بیوتیک نقش داشته باشد. بنابراین، می توان میکرو فلور بدن انسان را مطالعه کرد - به طور معمول و در دیس بیوز، روابط بین میکروبی در طول درمان یوبیوتیک.
هر موسسه پزشکی در معرض خطر ابتلا به عفونت های بیمارستانی است. تشخیص آن، شناسایی عامل بیماری زا، شناسایی منبع عفونت، اثبات هویت سویه ها جزء لاینفک کار آزمایشگاه باکتری شناسی است (3).
مرحله کنونی توسعه میکروبیولوژی با اکتشافات جدیدی مشخص می شود که در مطالعه مکانیسم های شکل گیری شرایط پاتولوژیک انجام شده است. اصلی ترین آنها اثبات وجود باکتری در بدن انسان به عنوان بخشی از جوامع مختلف است که مجموعاً بیوفیلم نامیده می شوند و شناسایی تأثیر غیر مستقیم میکروب ها بر بدن انسان. خواص باکتری‌ها در بیوفیلم‌ها با سلول‌های جدا شده متفاوت است، که بر همه جنبه‌های برهمکنش‌های میکروبی-محیط، از جمله عوامل دفاعی ایمنی و ضد میکروبی‌ها تأثیر می‌گذارد (4،5).
بیوفیلم یک جامعه خوب سازمان یافته و متقابل از میکروارگانیسم ها است (Quorum Sensing). 99 درصد باکتری ها در اکوسیستم های طبیعی، 80 درصد باکتری ها در بیماری های عفونی به صورت بیوفیلم وجود دارند.
بیوفیلم به سلول‌ها، بسترهای آلی و معدنی متصل می‌شود، چسبندگی باکتری‌ها را به اپیتلیوم و هر سطحی (منشا زنده و غیر زنده) افزایش می‌دهد، اثربخشی درمان ضد باکتریایی را کاهش می‌دهد و به باکتری‌ها کمک می‌کند تا در یک محیط خارجی در حال تغییر زنده بمانند. میکروارگانیسم های موجود در بیوفیلم نسبت به عملکرد داروهای ضد باکتریایی و عوامل دفاع غیراختصاصی ضد عفونی بدن انسان مقاومت بیشتری دارند.
مکانیسم های افزایش مقاومت باکتریایی به آنتی بیوتیک ها در بیوفیلم ها با نفوذ محدود آنتی بیوتیک ها از طریق آن، کاهش سرعت تقسیم باکتریایی که در نتیجه اهداف کمتری برای عملکرد آنتی بیوتیک ها وجود دارد و تغییرات ژنتیکی در باکتری ها همراه است. در بیوفیلم باقی بمانند
با استفاده از روش باکتریولوژیک، می توان مکانیسم های محافظت میکروبی از سیستم ایمنی بدن، استراتژی آن برای بقا در ماکرو ارگانیسم - پایداری را مطالعه کرد. میکروب ها دارای مکانیسم های دفاعی در برابر سیستم ایمنی انسان هستند - فعالیت آنتی لیزوزیم، ضد مکمل، ضد لاکتوفرین.
بنابراین، در حال حاضر، روش تشخیصی باکتریولوژیک امکان مطالعه بسیاری از جنبه های فعالیت زندگی باکتری های بیماری زا، مکانیسم های توسعه، بقا و سرکوب آنها را فراهم می کند.
ادبیات
1. Tets V.V. میکروارگانیسم ها و آنتی بیوتیک ها. عفونت های پوست، بافت های نرم، استخوان ها و مفاصل. - SPb.: KLE T, 2006. - 128 p.
2. راهنمای عملی شیمی درمانی ضد عفونی / ویرایش. L. S. Strachunsky، Yu. B. Belousov، S. N. Kozlov. اسمولنسک: MAKMAKH، 2007. - 464 p.
3. رودنوف V.A. اهمیت بالینی مدرن عفونت سودوموناس آئروژینوزا و امکان درمان آن در بیماران بخش مراقبت های ویژه عفونت و درمان ضد میکروبی 2002. - T. 4, No. 3
4. سیدورنکو اس.و. نقش بیوفیلم های باکتریایی در آسیب شناسی انسان // عفونت در جراحی. 2004. - T. 2، No. 3. - P. 16-20.
5. Anwar H. Strap J.L., Costerton J.W. ریشه‌کنی سلول‌های bio?lm استافیلوکوکوس اورئوس با توبرامایسین و سفالکسین. //می توان. J. Microbiol. 1992. - V. 38. - P. 618-625.
روش تحقیق باکتریولوژیک. جداسازی کشت خالص باکتری های هوازی (مراحل 1-2)
1. جوهر روش باکتریولوژیکی
3. روش های به دست آوردن کلنی های جدا شده
4. روش های به دست آوردن کشت خالص
1. کاشت اولیه را به روش کوخ و دریگالسکی انجام دهید
2. یک فرهنگ ناب را جدا کنید
برنامه کار:
1. روش تحقیق باکتریولوژیک
2. مراحل روش باکتریولوژیک
3. مفهوم: فرهنگ خالص، سویه، مستعمره
4. روش های به دست آوردن کلنی های جدا شده
5. روش های بدست آوردن کشت خالص باکتری های هوازی
روش اصلی تشخیص آزمایشگاهی بیماری های عفونی روش باکتریولوژیک است. ماهیت روش باکتریولوژیک جداسازی پاتوژن ها از مواد مورد مطالعه و شناسایی آن (تعیین جنس، گونه، واریته) است.
روش باکتریولوژیکی به شما امکان می دهد تعیین کنید:
1. نوع پاتوژن و تشخیص بیماری
2. آنتی بیوتیک هایی که عامل بیماری زا را می کشند و درمان مناسب را تجویز می کنند
3. فاگوارها و سرووارهای پاتوژن برای شناسایی منبع عفونت
مرحله اول بذر اولیه مواد مورد آزمایش برای به دست آوردن کلنی های جدا شده است. کاشت اولیه بر روی محیط های تجمعی و DDS (محیط های صفحه ای) انجام می شود.
مرحله دوم شناسایی کلنی های جدا شده و به دست آوردن یک کشت خالص از آنها با کاشت مجدد بر روی یک ستون کج از محیط اصلی است.
مرحله سوم شناسایی یک فرهنگ خالص است - تعیین جنس، گونه، انواع پاتوژن، تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی، تعیین محصولات فاژ.
کشت میکروارگانیسم ها باکتری هایی است که روی محیط های غذایی رشد می کنند. کشت خالص، باکتری یک گونه است که در محیط های غذایی رشد می کند. در یک گونه، انواعی وجود دارد که در یک ویژگی متفاوت هستند:
1. Morphovars - در مورفولوژی متفاوت است
2. Chemovars - در خواص بیوشیمیایی متفاوت است
3. سرووارها - در خواص آنتی ژنی متفاوت هستند
4. فاگوار - از نظر حساسیت به فاژها متفاوت است
کشت خالص برای شناسایی، تعیین سرووارها، فاگوارها و حساسیت به آنتی بیوتیک ها ضروری است. یک سویه باکتری از یک نوع است که از یک منبع خاص جدا شده است (رودخانه ولگا، ایوانف بیمار و غیره). یک کلنی مجموعه ای قابل مشاهده از باکتری های همان گونه است که زمانی تشکیل می شود که یک سلول باکتری روی یک محیط غذایی جامد تکثیر می شود.
مرحله اول مطالعه، بذردهی اولیه مواد آزمایش برای به دست آوردن کلنی های جدا شده است. قبل از کاشت اولیه، میکروسکوپی از مواد مورد مطالعه انجام می شود. مواد مورد آزمایش معمولا حاوی مخلوطی از باکتری های مختلف از جمله عوامل بیماری زا هستند. برای جداسازی عامل بیماریزا باید با انتخاب یک محیط غذایی و استفاده از روشهای کاشت خاص، کلنی های جدا شده (باکتری های همان گونه) به دست آورد.
دو روش برای بدست آوردن کلنی های جدا شده وجود دارد:
1. روش دریگالسکی
روش اصلی تشخیص میکروبیولوژیکی و "استاندارد طلایی" میکروبیولوژی، روش باکتریولوژیک است.
هدف از روش باکتریولوژیکشامل جداسازی یک کشت خالص از پاتوژن از ماده آزمایش، جمع آوری یک کشت خالص و شناسایی این فرهنگ با مجموعه ای از خواص: مورفولوژیکی، رنگی، فرهنگی، بیوشیمیایی، آنتی ژنی، با حضور عوامل بیماری زایی، سم زایی و تعیین حساسیت آن است. به داروهای ضد میکروبی و باکتریوفاژها.
روش تحقیق باکتریولوژیک شامل:
1. تلقیح مواد مورد آزمایش در محیط های غذایی
2. جداسازی فرهنگ ناب
3. شناسایی میکروارگانیسم ها (تعیین گونه).
جداسازی و شناسایی کشت های خالص باکتری های هوازی و بی هوازی شامل مطالعات زیر است:
مرحله I (کار با مواد بومی)
هدف: به دست آوردن کلنی های ایزوله
1. میکروسکوپ اولیه یک ایده تقریبی از میکرو فلور می دهد
2. تهیه مواد برای تحقیق (رقیق سازی با محلول NaCl ایزوتونیک و غیره)
3. کاشت روی محیط های غذایی جامد برای به دست آوردن کلنی های جدا شده
4. جوجه کشی در دمای مطلوب، اغلب 37 درجه سانتیگراد، به مدت 18-24 ساعت
مرحله دوم
هدف: به دست آوردن فرهنگ ناب
1. مطالعه ماکروسکوپی مستعمراتدر نور عبوری و بازتابی (ویژگی های اندازه، شکل، رنگ، شفافیت، قوام، ساختار، کانتور، سطح کلنی ها).
2. بررسی میکروسکوپی کلنی های جدا شده
3. تست تحمل هوا (برای تایید وجود بی هوازی های سخت در مواد آزمایش).
4. کاشت کلنی های مشخصه یک گونه خاص در محیط های تجمع کشت خالص یا محیط های انتخابی و جوجه کشی در شرایط بهینه.
مرحله III
هدف: شناسایی فرهنگ خالص جدا شده
1. برای شناسایی فرهنگ انتخاب شده بر اساس مجموعه ای از خواص بیولوژیکی، موارد زیر مورد مطالعه قرار می گیرد:
· مورفولوژی و خواص رنگی
· خواص فرهنگی (ویژگی رشد در محیط های غذایی)
· خواص بیوشیمیایی (فعالیت آنزیمی میکروارگانیسم ها، فعالیت های گلیکولیتیک، پروتئولیتیک و سایر فعالیت ها)
خواص سرولوژیکی (آنتی ژنیک)
· خواص بیماریزا (توانایی تولید عوامل بیماری زایی: سموم، آنزیم ها، عوامل دفاعی و تهاجمی)
بیماری زایی برای حیوانات
· فاگولیس پذیری (حساسیت به باکتریوفاژهای تشخیصی)
حساسیت به آنتی بیوتیک ها
· سایر خواص فردی
مرحله چهارم (نتیجه گیری)
بر اساس ویژگی های مورد مطالعه، نتیجه گیری در مورد فرهنگ انتخاب شده انجام می شود.
مرحله اول تحقیق.بررسی مواد پاتولوژیک با میکروسکوپ شروع می شود. میکروسکوپ مواد بومی رنگ آمیزی شده این امکان را فراهم می کند که تقریباً ترکیب چشم انداز میکروبی شی مورد مطالعه و برخی از ویژگی های مورفولوژیکی میکروارگانیسم ها را ایجاد کند. نتایج میکروسکوپ مواد بومی تا حد زیادی مسیر تحقیقات بیشتر را تعیین می‌کند؛ سپس با داده‌های به‌دست‌آمده از تلقیح در محیط‌های غذایی مقایسه می‌شود.
اگر مقدار کافی از میکروارگانیسم‌های بیماریزا در نمونه وجود داشته باشد، تلقیح بر روی محیط‌های غذایی جامد (برای به دست آوردن کلنی‌های جدا شده) انجام می‌شود. اگر تعداد کمی باکتری در ماده آزمایش وجود داشته باشد، تلقیح بر روی محیط های غذایی غنی شده مایع انجام می شود. محیط های غذایی با توجه به نیاز میکروارگانیسم ها انتخاب می شوند.
کشت میکروارگانیسم ها تنها در صورتی امکان پذیر است که شرایط بهینه برای زندگی آنها ایجاد شود و قوانینی رعایت شود که از آلودگی (آلودگی تصادفی توسط میکروب های خارجی) مواد مورد مطالعه جلوگیری کند. شرایط مصنوعی که از آلودگی کشت توسط گونه های دیگر جلوگیری می کند را می توان در یک لوله آزمایش، فلاسک یا ظرف پتری ایجاد کرد. تمامی ظروف شیشه ای و محیط های کشت باید استریل بوده و پس از تلقیح مواد میکروبی، از آلودگی های خارجی که با استفاده از درپوش ها یا درپوش ها و درب های فلزی حاصل می شود، محافظت شود. دستکاری با مواد آزمایش باید در منطقه شعله یک لامپ الکلی انجام شود تا از آلودگی مواد از محیط خارجی و همچنین به منظور رعایت مقررات ایمنی جلوگیری شود.
تلقیح مواد روی محیط های غذایی باید حداکثر تا 2 ساعت از لحظه جمع آوری انجام شود.
مرحله دوم تحقیق.مطالعه کلنی ها و جداسازی فرهنگ های خالص. پس از یک روز جوجه کشی، کلنی ها روی ظروف رشد می کنند و در اولین ضربه رشد مداوم است و در سکته های بعدی - کلنی های ایزوله. کلنی مجموعه ای از میکروب های یک گونه است که از یک سلول رشد می کنند. از آنجایی که این ماده اغلب مخلوطی از میکروب ها است، انواع مختلفی از کلنی ها رشد می کنند. کلنی های مختلف را با مداد علامت گذاری کنید، آنها را با یک دایره از پایین مشخص کنید و آنها را مطالعه کنید (جدول 12). اول از همه، کلنی ها با چشم غیر مسلح مورد مطالعه قرار می گیرند: علائم ماکروسکوپی. فنجان (بدون باز کردن آن) از پایین در نور عبوری مشاهده می شود، شفافیت کلنی ها مشخص می شود (شفاف، اگر نور را مسدود نمی کند، شفاف، اگر تا حدی نور را مسدود کند، مات، اگر نور از طریق نور عبور نمی کند). کلنی)، و اندازه کلنی ها (بر حسب میلی متر) اندازه گیری می شود. سپس کلنی ها را از کنار درب مطالعه می کنند، شکل (مرتب، گرد، نامنظم، مسطح، محدب)، ماهیت سطح (صاف، براق، مات، ناهموار، چروکیده، مرطوب، خشک، لزج)، رنگ را یادداشت می کنند. (بی رنگ، رنگی).
جدول 12. طرحی برای مطالعه مستعمرات
| № | امضا کردن | ویژگی های احتمالی کلنی ها |
| 1. | فرم | تخت، محدب، گنبدی، افسرده، گرد، روزت، ستاره |
| 2. | اندازه، میلی متر | بزرگ (4-5 میلی متر)، متوسط (2-4 میلی متر)، کوچک (1-2 میلی متر)، کوتوله (< 1 мм) |
| 3. | شخصیت سطحی | صاف (S شکل)، زبر (R شکل)، لزج (M شکل)، مخطط، برآمدگی، مات، براق |
| 4. | رنگ | بی رنگ، رنگی... رنگ |
| 5. | شفافیت | شفاف، مات، شفاف |
| 6. | ویژگی لبه ها | صاف، دندانه دار، حاشیه دار، فیبری، دلمه دار |
| 7. | ساختار داخلی | همگن، دانه ای، ناهمگن |
| 8. | ثبات | چسبناک، لزج، شکننده |
| 9. | امولسیون شدن در یک قطره آب | خوب بد |
نکته: نکات 5-7 در بزرگنمایی کم میکروسکوپ یا زیر ذره بین بررسی می شود.
هنگام مشاهده با بزرگنمایی، می توانید تفاوت بین کلنی ها را حتی بهتر ببینید. برای انجام این کار، یک فنجان بسته را با پایین به بالا روی صحنه قرار دهید، کندانسور را کمی پایین بیاورید، از بزرگنمایی جزئی لنز (x8) استفاده کنید، فنجان را حرکت دهید، ویژگی های میکروسکوپی کلنی ها را مطالعه کنید: ماهیت لبه ( صاف، مواج، ناهموار، صدف دار)، ساختار (همگن، دانه ای، فیبری، همگن یا متفاوت در مرکز و پیرامون).
در ادامه، مورفولوژی سلول های میکروبی از کلنی ها مورد مطالعه قرار می گیرد. برای این کار از قسمتی از هر یک از کلنی های مشخص شده اسمیر تهیه می شود و با گرم رنگ آمیزی می شود. هنگام گرفتن کلنی، به قوام آن توجه کنید (خشک، اگر کلنی خرد شد و برداشتن آن دشوار است، نرم، اگر به راحتی با حلقه گرفته شود، لزج، اگر کلنی توسط یک حلقه کشیده شود، سخت، اگر قسمتی از کلنی باشد. کلنی با یک حلقه گرفته نمی شود، شما فقط می توانید کل کلنی را حذف کنید).
هنگام مشاهده اسمیر، مشخص می شود که کلنی توسط یک نوع میکروب نشان داده شده است، بنابراین، کشت خالص باکتری ها را می توان جدا کرد. برای انجام این کار، کلنی های مورد مطالعه مجدداً روی آگار کج کاشته می شوند. هنگام کاشت مجدد از مستعمرات، باید دقت شود که دقیقاً کلنی های مورد نظر گرفته شود، بدون اینکه با حلقه به کلنی های مجاور برخورد کنید. لوله ها برچسب گذاری شده و در ترموستات در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه می شوند.
مرحله سوم تحقیق.شناسایی فرهنگ جدا شده شناسایی میکروب ها - تعیین موقعیت سیستماتیک یک فرهنگ جدا شده از یک ماده به گونه و گونه. اولین شرط برای شناسایی قابل اعتماد، خلوص بی قید و شرط فرهنگ است. برای شناسایی میکروب ها از مجموعه ای از ویژگی ها استفاده می شود: مورفولوژیکی (شکل، اندازه، وجود تاژک، کپسول، هاگ، موقعیت نسبی در اسمیر)، رنگی (ارتباط با رنگ آمیزی گرم یا روش های دیگر)، شیمیایی (نسبت گوانین + سیتوزین). در یک مولکول DNA)، فرهنگی (نیازهای تغذیه ای، شرایط کشت، سرعت و ماهیت رشد در محیط های مختلف غذایی)، آنزیمی (تجزیه مواد مختلف با تشکیل محصولات میانی و نهایی)، سرولوژیکی (ساختار آنتی ژنی، ویژگی)، بیولوژیکی. (بیماری برای حیوانات، سم زایی، حساسیت زایی، اثر آنتی بیوتیک ها و غیره).
برای تمایز بیوشیمیایی، آنها توانایی باکتری ها در تخمیر کربوهیدرات ها با تشکیل محصولات نهایی میانی، توانایی تجزیه پروتئین ها و پپتون ها و مطالعه آنزیم های ردوکس را مطالعه می کنند.
برای مطالعه آنزیم های ساکارولیتیککشت های جدا شده در لوله های آزمایش با محیط های نیمه مایع حاوی لاکتوز، گلوکز و سایر کربوهیدرات ها و الکل های پلی هیدریک تلقیح می شوند. برای محیط های نیمه مایع، تلقیح با تزریق در عمق محیط انجام می شود. هنگام کاشت به روش تزریق، لوله آزمایش با محیط در یک زاویه نگه داشته می شود، درپوش آن برداشته می شود و لبه لوله آزمایش می سوزد. این ماده با یک حلقه استریل گرفته می شود و ستون ماده مغذی با آن تقریباً تا پایین سوراخ می شود.
برای تعیین آنزیم های پروتئولیتیککشت جدا شده روی پپتون واتر یا MPB کاشته می شود. برای انجام این کار، لوله آزمایش را با تلقیح نزدیکتر در دست خود و لوله آزمایش را با محیط دورتر از خود بگیرید. هر دو لوله آزمایش به طور همزمان باز می شوند، شاخه های آنها را با انگشت کوچک و لبه کف دست می گیرند، لبه های لوله های آزمایش را می سوزانند، با یک حلقه سرد شده کلسینه کمی کشت گرفته و به لوله آزمایش دوم منتقل می کنند. آن را در یک محیط مایع روی دیواره لوله آزمایش آسیاب کرده و با محیط بشویید.
هنگام کاشت و کاشت مجدد باید به رعایت قوانین عقیمی توجه کرد تا محصولات خود را به میکرو فلور خارجی آلوده نکنند و همچنین محیط را آلوده نکنند. لوله ها برچسب گذاری شده و در یک ترموستات برای انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار می گیرند.
نتیجه
حسابداری برای نتایج نتیجه گیری از مطالعه. نتایج شناسایی در نظر گرفته شده و بر اساس مجموع داده‌های به‌دست‌آمده، بر اساس طبقه‌بندی و ویژگی‌های سویه‌های معمولی شرح‌داده‌شده در کتابچه راهنما (کلید Burgee, 1994-1996)، نوع محصولات جدا شده تعیین می‌شود.