مبانی PCR. واکنش زنجیره ای پلیمراز کاربرد PCR در خدمات خون

این سایت اطلاعات مرجع را فقط برای مقاصد اطلاعاتی ارائه می دهد. تشخیص و درمان بیماری ها باید زیر نظر متخصص انجام شود. همه داروها منع مصرف دارند. مشاوره با متخصص الزامی است!

روش واکنش زنجیره ای پلیمرازتقریباً سی سال پیش توسط یک دانشمند آمریکایی به نام کشف شد کری مولیس. این تکنیک به طور گسترده در پزشکی به عنوان یک ابزار تشخیصی استفاده می شود و ماهیت آن کپی کردن بخشی از DNA با استفاده از یک آنزیم خاص است. پلیمرازها) به صورت مصنوعی در شرایط آزمایشگاهی.

این روش در چه زمینه های پزشکی استفاده می شود؟

چرا کپی DNA انجام می شود و چگونه می تواند در خدمت پزشکی باشد؟
این تکنیک اجازه می دهد:

• جداسازی و شبیه سازی ژن ها
• بیماری های ژنتیکی و عفونی را تشخیص دهید.
• پدری را تعیین کنید. کودک برخی از ویژگی های ژنتیکی خود را از والدین بیولوژیکی خود به ارث می برد، اما هویت ژنتیکی منحصر به فرد خود را دارد. وجود برخی از ژن‌ها که مشابه ژن‌های والدین هستند به ما اجازه می‌دهد تا در مورد برقراری رابطه صحبت کنیم.

واکنش زنجیره ای پلیمراز نیز در پزشکی قانونی استفاده می شود.

در صحنه های جنایت، دانشمندان پزشکی قانونی نمونه هایی از مواد ژنتیکی را جمع آوری می کنند. اینها عبارتند از: مو، بزاق، خون. متعاقباً به لطف تکنیک واکنش پلیمراز می توان DNA را تکثیر کرد و هویت نمونه گرفته شده را با ماده ژنتیکی فرد مشکوک مقایسه کرد.

واکنش زنجیره ای پلیمراز به طور موثر در پزشکی استفاده می شود:

• در عمل ریوی - برای افتراق انواع باکتریایی و ویروسی پنومونی، سل.
• در عمل زنان و زایمان و اورولوژی - برای تعیین اوره پلاسموز، کلامیدیا، عفونت مایکوپلاسما، گاردنرلوز، تبخال، سوزاک.
• در عمل گوارش.
• در هماتولوژی - برای تعیین انکوویروس ها و عفونت سیتومگالوویروس.
• در تشخیص سریع بیماری های عفونی مانند هپاتیت ویروسی، دیفتری، سالمونلوز.

در حال حاضر این روش بیشتر در تشخیص بیماری های عفونی ( هپاتیت با علت ویروسی، HIV، بیماری های مقاربتی، سل، آنسفالیت منتقله از طریق کنه).

در طول واکنش چه اتفاقی می افتد؟

خود واکنش از نظر شیمیایی ساده است. منبع DNA برای واکنش می تواند یک قطره خون، مو، یک تکه پوست و غیره باشد. در تئوری، واکنش به معرف های لازم، یک لوله آزمایش، یک نمونه بیولوژیکی و یک منبع حرارتی نیاز دارد.

واکنش پلیمراز تشخیص عفونت را ممکن می سازد، حتی اگر نمونه حاوی مواد بیولوژیکی فقط یک یا چند مولکول DNA از پاتوژن را داشته باشد.

در طی واکنش، به لطف آنزیم DNA پلیمراز، دو برابر شدن ( همانند سازی) بخش DNA. خود اسید دئوکسی ریبونوکلئیک ( به اختصار DNA نامیده می شود) برای ما مهم است زیرا ذخیره و انتقال اطلاعات ژنتیکی به سلول های دختر را تضمین می کند. DNA شکل یک مارپیچ دارد که از بلوک های تکرار شونده تشکیل شده است. این بلوک ها نوکلئوتیدها را می سازند که کوچکترین واحد DNA هستند. نوکلئوتیدها از اسیدهای آمینه تشکیل می شوند.

فرآیند تکثیر بخش های DNA طی چرخه های مکرر اتفاق می افتد. در هر یک از این چرخه ها، نه تنها قطعه DNA اصلی کپی و دو برابر می شود، بلکه قطعاتی که قبلاً در چرخه تقویت قبلی دو برابر شده بودند نیز کپی می شوند. همه اینها شبیه روند پیشرفت هندسی است.

وجود دارد:

• تقویت طبیعی ( یعنی فرآیند کپی و تکثیر DNA) که در بدن ما اتفاق می افتد و یک فرآیند قطعی و از پیش تعیین شده است.
• تقویت مصنوعی، که به دلیل واکنش زنجیره ای پلیمراز رخ می دهد. در این حالت، فرآیند کپی کنترل می شود و اجازه می دهد حتی بخش های کوتاهی از اسید نوکلئیک را کپی کنید.

پس از اتمام هر چرخه کپی، تعداد قطعات اسید نوکلئیک به طور تصاعدی افزایش می یابد. به همین دلیل است که خود این فرآیند "واکنش زنجیره ای" نامیده می شود.

پس از سی تا چهل چرخه، تعداد قطعات به چند میلیارد می رسد.

برای تقویت درونکشتگاهی (درونکشتگاهیلازم است یک قطعه DNA خارجی خاص ( یعنی DNA مربوط به بیمار نیست، بلکه مربوط به پاتوژن است). اگر محلول ایجاد شده حاوی قطعه خاصی نباشد، واکنش زنجیره ای تحت اثر پلیمراز ادامه نخواهد داشت. این حقیقت ویژگی بالای PCR را توضیح می دهد.

مراحل تشخیص PCR

1. DNA از مواد مورد مطالعه جدا می شود.
2. DNA به محلول خاصی از نوکلئوتیدها اضافه می شود.
3. محلول تا دمای 90 تا 95 درجه سانتیگراد گرم می شود تا پروتئین DNA منعقد شود.
4. دما را به 60 درجه کاهش دهید.
5. با تکرار چرخه های افزایش و کاهش دما، تعداد محل های اسید نوکلئیک افزایش می یابد.

6. با انجام الکتروفورز نتایج جمع بندی شده و نتایج دو برابر شدن محاسبه می شود.

مزایای این تشخیص چیست؟

• تطبیق پذیری: هر نمونه اسید نوکلئیک برای این روش مناسب است.
• ویژگی بالا: پاتوژن دارای توالی های منحصر به فردی از زنجیره های DNA است که مختص آن است. بنابراین، نتایج PCR قابل اعتماد خواهد بود؛ غیرممکن است که ژن یک پاتوژن را با ژن یک پاتوژن دیگر اشتباه گرفت.
• حساسیت به حضور حتی یک مولکول بیماریزا.

• مقدار کمی مواد مورد نیاز برای تحقیق. حتی یک قطره خون هم این کار را می کند. توانایی به دست آوردن نتایج با استفاده از حداقل حجم نمونه برای مطالعات اطفال، نوزادان، مغز و اعصاب و همچنین در عمل پزشکی قانونی بسیار مهم است.
• توانایی تعیین عفونت مزمن، و نه فقط حاد.
• کشت بسیاری از کشت های بیماری زا در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از روش های دیگر بسیار دشوار است، اما واکنش پلیمراز اجازه می دهد تا کشت به مقدار لازم تکثیر شود.

این تشخیص چه معایبی دارد؟

• اگر ماده در نظر گرفته شده برای PCR حاوی DNA نه تنها یک پاتوژن زنده، بلکه یک پاتوژن مرده نیز باشد، تکثیر هر دو DNA رخ خواهد داد. بر این اساس، درمان تجویز شده پس از تشخیص ممکن است کاملاً صحیح نباشد. پس از مدتی، بهتر است اثربخشی درمان را کنترل کنید.
• افزایش حساسیت به حضور میکروارگانیسم‌ها نیز می‌تواند به نوعی یک نقطه ضعف در نظر گرفته شود. از این گذشته ، بدن انسان به طور معمول حاوی میکرو فلور فرصت طلب است ، یعنی این میکروارگانیسم هایی هستند که در روده ها ، معده و سایر اندام های داخلی زندگی می کنند. این میکروارگانیسم ها فقط در شرایط نامطلوب خاصی - عدم رعایت الزامات بهداشتی، آب آشامیدنی آلوده و غیره می توانند به انسان آسیب برسانند. تکنیک PCR DNA حتی این میکروارگانیسم ها را تقویت می کند، اگرچه منجر به آسیب شناسی نمی شود.
• PCR سیستم های آزمایش مختلف ممکن است نتایجی را نشان دهد که با یکدیگر متفاوت خواهند بود. تغییرات زیادی در این تکنیک وجود دارد: تو در تو», « نامتقارن», « وارونه», « کمی» PCR و دیگران.

در پایان مقاله، نگاه کنید
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)در سال 1983 توسط کری مولیس (دانشمند آمریکایی) اختراع شد. او پس از آن جایزه نوبل را برای این اختراع دریافت کرد. در حال حاضر، تشخیص PCR یکی از دقیق ترین و حساس ترین روش ها برای تشخیص بیماری های عفونی است.
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)- یک روش تجربی زیست شناسی مولکولی، روشی برای افزایش قابل توجه غلظت های کوچک قطعات خاصی از اسید نوکلئیک (DNA) در مواد بیولوژیکی (نمونه).
روش PCR بر اساس دو برابر کردن مکرر بخش خاصی از DNA با استفاده از آنزیم ها در شرایط مصنوعی (in vitro) است. در نتیجه، مقادیر کافی DNA برای تشخیص بصری تولید می شود. در این حالت فقط قسمتی کپی می شود که شرایط مشخص شده را داشته باشد و تنها در صورتی که در نمونه مورد مطالعه وجود داشته باشد.
علاوه بر افزایش ساده تعداد کپی‌های DNA (این فرآیند تقویت نامیده می‌شود)، PCR امکان بسیاری از دستکاری‌های دیگر را با مواد ژنتیکی (معرفی جهش‌ها، اتصال قطعات DNA) فراهم می‌کند و به طور گسترده در عمل بیولوژیکی و پزشکی به عنوان مثال استفاده می‌شود. برای تشخیص بیماری‌ها (ارثی، عفونی)، ایجاد پدری، شبیه‌سازی ژن‌ها، معرفی جهش‌ها و جداسازی ژن‌های جدید.

ویژگی و کاربرد

انجام PCR

برای انجام PCR در ساده ترین حالت، اجزای زیر مورد نیاز است:

• الگوی DNA حاوی بخش DNA که باید تقویت شود.
• دو پرایمر مکمل انتهای قطعه مورد نظر.
• DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت؛
• دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات (A، G، C، T)؛
• یون های Mg2+ لازم برای عملکرد پلیمراز؛
• محلول بافر.

PCR در یک سیکلر حرارتی انجام می شود - دستگاهی که خنک کننده و گرمایش دوره ای لوله های آزمایش را معمولاً با دقت حداقل 0.1 درجه سانتی گراد فراهم می کند. برای جلوگیری از تبخیر مخلوط واکنش، روغن با جوش بالا مانند وازلین را به لوله آزمایش اضافه کنید. افزودن آنزیم های خاص می تواند بازده واکنش PCR را افزایش دهد.
پیشرفت واکنش

به طور معمول، PCR 20 تا 35 چرخه را انجام می دهد که هر یک از سه مرحله تشکیل شده است. الگوی DNA دو رشته ای به مدت 0.5 تا 2 دقیقه تا 94 - 96 درجه سانتیگراد (یا 98 درجه سانتیگراد در صورت استفاده از پلیمراز به خصوص مقاوم در برابر حرارت) حرارت داده می شود تا رشته های DNA جدا شوند. این مرحله دناتوراسیون نامیده می شود - پیوندهای هیدروژنی بین دو زنجیره از بین می روند. گاهی اوقات، قبل از چرخه اول، مخلوط واکنش به مدت 2 تا 5 دقیقه از قبل گرم می شود تا ماتریکس و پرایمرها کاملاً دناتوره شوند.
پس از جدا شدن رشته ها، دما کاهش می یابد تا پرایمرها به قالب تک رشته ای متصل شوند. به این مرحله آنیلینگ می گویند. دمای بازپخت به پرایمرها بستگی دارد و معمولاً 4 تا 5 درجه سانتیگراد کمتر از دمای ذوب آنها انتخاب می شود. زمان مرحله 0.5 - 2 دقیقه است.

DNA پلیمراز با استفاده از پرایمر به عنوان آغازگر، رشته الگو را تکثیر می کند. این مرحله ازدیاد طول است. دمای ازدیاد طول بستگی به پلیمراز دارد. پلیمرازهای رایج در دمای 72 درجه سانتیگراد فعال هستند. زمان ازدیاد طول بستگی به نوع DNA پلیمراز و طول قطعه تقویت شده دارد. به طور معمول، زمان ازدیاد طول یک دقیقه در هزار جفت پایه در نظر گرفته می شود. پس از تکمیل تمام چرخه ها، یک مرحله افزایش طول نهایی اغلب برای تکمیل تمام قطعات تک رشته ای انجام می شود. این مرحله 10 تا 15 دقیقه طول می کشد.
تهیه مواد برای تحقیق و انتقال آن به آزمایشگاه

برای تجزیه و تحلیل موفقیت آمیز، جمع آوری صحیح مطالب از بیمار و تهیه صحیح آن مهم است. مشخص است که در تشخیص آزمایشگاهی اکثر خطاها (تا 70٪) دقیقاً در مرحله آماده سازی نمونه انجام می شود. برای جمع‌آوری خون در آزمایشگاه INVITRO در حال حاضر از سیستم‌های خلاء استفاده می‌شود که از یک طرف آسیب کمتری به بیمار وارد می‌کند و از طرف دیگر امکان جمع‌آوری مواد را به گونه‌ای فراهم می‌کند که با آن تماس پیدا نکند. یا پرسنل یا محیط زیست این امر از آلودگی (آلودگی) مواد جلوگیری می کند و عینی بودن آنالیز PCR را تضمین می کند.

DNA - اسید دئوکسی ریبونوکلئیک - یک پلیمر بیولوژیکی، یکی از دو نوع اسید نوکلئیک است که ذخیره سازی، انتقال از نسلی به نسل دیگر و اجرای برنامه ژنتیکی برای توسعه و عملکرد موجودات زنده را تضمین می کند. نقش اصلی DNA در سلول ها ذخیره سازی طولانی مدت اطلاعات در مورد ساختار RNA و پروتئین ها است.

RNA-ریبونوکلئیک اسید یک پلیمر بیولوژیکی از نظر ساختار شیمیایی مشابه DNA است. مولکول RNA از همان واحدهای مونومر - نوکلئوتیدها - به عنوان DNA ساخته شده است. در طبیعت، RNA معمولاً به صورت یک رشته وجود دارد. در برخی از ویروس ها، RNA حامل اطلاعات ژنتیکی است. در سلول نقش مهمی در انتقال اطلاعات از DNA به پروتئین دارد. RNA بر روی یک الگوی DNA سنتز می شود. این فرآیند رونویسی نامیده می شود. مناطقی در DNA وجود دارند که حاوی اطلاعاتی هستند که مسئول سنتز سه نوع RNA هستند که در عملکرد آنها متفاوت است: RNA پیام رسان یا پیام رسان (mRNA)، RNA ریبوزومی (rRNA) و RNA انتقال (tRNA). هر سه نوع RNA به روشی در سنتز پروتئین نقش دارند. با این حال، اطلاعات مربوط به سنتز پروتئین فقط در mRNA موجود است.

نوکلئوتیدها واحد تکرار شونده اساسی در مولکول های اسید نوکلئیک هستند که محصول ترکیب شیمیایی یک باز نیتروژن دار، یک قند پنج کربنه (پنتوز) و یک یا چند گروه فسفات هستند. نوکلئوتیدهای موجود در اسیدهای نوکلئیک حاوی یک گروه فسفات هستند. آنها با توجه به پایه نیتروژنی آنها نامگذاری شده اند - آدنین (A)، حاوی آدنین، گوانین (G) - گوانین، سیتوزین (C) - سیتوزین، تیمین (T) - تیمین، اوراسیل (U) - اوراسیل. DNA شامل 4 نوع نوکلئوتید - A، T، G، C، RNA نیز شامل 4 نوع - A، U، G، C است. قند موجود در تمام نوکلئوتیدهای DNA دئوکسی ریبوز، RNA - ریبوز است. هنگامی که اسیدهای نوکلئیک تشکیل می شوند، نوکلئوتیدها برای تشکیل یک ستون فقرات قند-فسفات مولکول، که در یک طرف آن باز وجود دارد، متصل می شوند.

پرایمر DNA کوتاهی است که برای تکثیر رشته الگو استفاده می شود. هر یک از آغازگرها مکمل یکی از رشته های الگوی دو رشته ای هستند و ابتدا و انتهای ناحیه تقویت شده را قاب می کنند.

ادبیات

1. گلیک بی.، پاسترناک جی. بیوتکنولوژی مولکولی. اصول و کاربرد. مطابق. از انگلیسی - م.: میر، 1381. - 589 ص، مصور. شابک 5-03-003328-9
2. شچلکونوف S.N. مهندسی ژنتیک - Novosibirsk: Sibirsk. دانشگاه انتشارات، 2004. - 496 ص. بیمار شابک 5-94087-098-8
3. پاتروشف L.I. سیستم های ژنتیک مصنوعی - M.: Nauka، 2005 - در 2 جلد - ISBN 5-02-033278-X

مهم!

اطلاعات این بخش را نمی توان برای خود تشخیصی و خوددرمانی استفاده کرد. در صورت بروز درد یا تشدید دیگر بیماری، آزمایشات تشخیصی فقط باید توسط پزشک معالج تجویز شود. برای تشخیص و تجویز صحیح درمان، باید با پزشک خود تماس بگیرید.

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR، PCR - واکنش زنجیره ای پلیمراز) روشی برای به دست آوردن کپی های متعدد از قطعات (ژن ها) DNA خاص در یک نمونه بیولوژیکی است.

ماهیت PCR به عنوان یک روش زیست شناسی مولکولی، کپی برداری انتخابی مکرر از یک ژن خاص (بخشی از DNA) با استفاده از آنزیم های خاص تحت شرایط است. درونکشتگاهی. یکی از ویژگی های مهم PCR تولید نسخه هایی از بخش (ژن) DNA خاص است که شرایط مشخصی را برآورده می کند. مترادف فرآیند کپی کردن DNA "تقویت" است. همانندسازی DNA in vivoرا نیز می توان تقویت در نظر گرفت. با این حال، برخلاف همانندسازی، فرآیند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بخش‌های کوتاه DNA (حداکثر 40000 جفت باز) را تقویت می‌کند.

اصول اساسی

بنابراین، PCR کپی کردن مکرر قطعات DNA خاص در شرایط آزمایشگاهی در طول چرخه های دمایی مکرر است. چگونه فرآیند واکنش در یک چرخه دمایی رخ می دهد؟

تشکیل زنجیره نوکلئوتیدی توسط آنزیم DNA پلیمراز انجام می شود. با این حال، برای شروع کار، آنزیم نیاز به یک سکوی پرتاب دارد. پلتفرم ها "پرایمر" (بذر) هستند - الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی به طول 15-20 نوکلئوتید. باید دو آغازگر وجود داشته باشد (جلو و معکوس)، آنها مکمل بخش هایی از الگوی DNA هستند، و این قطعه DNA محدود شده توسط پرایمرها است که بارها توسط DNA پلیمراز کپی می شود. کار پلیمراز اضافه کردن متوالی نوکلئوتیدهای مکمل به توالی الگوی DNA است. بنابراین، در یک چرخه دمایی، دو قطعه DNA جدید دوباره سنتز می‌شوند (از آنجایی که مولکول DNA دو رشته‌ای است، در ابتدا دو ماتریس وجود دارد). بنابراین، طی 25-35 چرخه، میلیاردها نسخه از ناحیه DNA تعیین شده توسط پرایمرها در لوله آزمایش تجمع می یابد. ساختار یک چرخه جداگانه را می توان به صورت زیر نشان داد:

1. دناتوره شدن DNA (ذوب شدن، واگرایی زنجیره های DNA) - 95 درجه سانتیگراد - 1 یا 2 دقیقه.
2. بازپخت پرایمرها (پرایمرها به الگوی DNA متصل می شوند، دمای این مرحله با ترکیب نوکلئوتیدی پرایمر تعیین می شود) - 60 درجه سانتیگراد (به عنوان مثال) - 1 دقیقه.
3. ازدیاد طول DNA (پلی مراز یک زنجیره DNA را سنتز می کند) - 72 درجه سانتیگراد - 1 دقیقه (زمان به طول قطعه سنتز شده بستگی دارد).

ابزار دقیق برای استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز در آزمایشگاه باید شامل موارد زیر باشد:

1. (یا همانطور که به آن سیکلر حرارتی نیز گفته می شود)؛
2. سیستم های s (برای تجسم نتایج PCR)؛
3. سیستم ها (برای تجزیه و تحلیل نتایج PCR)؛
4. (برای تهیه نمونه)؛
5. مجموعه (مکانیکی یا الکترونیکی).

علاوه بر تجهیزات اصلی و کمکی برای عملکرد کامل آزمایشگاه PCR، برخی از مواد مصرفی مورد نیاز است: نوک استریل، لوله آزمایش، قفسه برای لوله های آزمایش و توزیع کننده ها.

پایه معرف در یک آزمایشگاه PCR معمولی برای انجام یک واکنش زنجیره ای پلیمراز کامل شامل آنزیم DNA پلیمراز با بافر، پرایمرها (قطعات DNA مصنوعی کوچک مکمل ابتدا و انتهای بخش تجزیه و تحلیل شده الگوی DNA)، مخلوطی از نوکلئوتیدها (A، T، G، C). آب تصفیه شده نیز کاملا ضروری است.

مزایای روش PCR

حساسیت بالای مطالعه

حساسیت روش به حدی است که می توان با PCR تکثیر و توالی هدف را شناسایی کرد حتی اگر یک بار در نمونه 105 سلولی رخ دهد.

ویژگی سنجش

PCR به شما امکان می دهد DNA یک عامل عفونی خاص را در حضور DNA سایر میکروارگانیسم ها و DNA ارگانیسم میزبان شناسایی کنید و همچنین ژنوتیپ را انجام دهید. با انتخاب اختصاصی اجزای واکنش (پرایمرها)، می توانید به طور همزمان DNA میکروارگانیسم های نزدیک به هم را شناسایی کنید.

تطبیق پذیری روش PCR

واقعیت این است که برای تشخیص PCR بیماری‌های عفونی یا بیماری‌های ارثی انسان، می‌توانید از تجهیزات مشابه استفاده کنید، از روش‌های جهانی برای آماده‌سازی و تجزیه و تحلیل نمونه و همچنین از همان نوع کیت‌های معرف پیروی کنید.

صرفه جویی در زمان

مزیت مهم PCR عدم وجود مراحل کار میکروبیولوژیکی فرهنگی است. آماده سازی نمونه، عملکرد واکنش و تجزیه و تحلیل نتایج ساده و تا حد زیادی خودکار است. با تشکر از این، زمان به دست آوردن نتایج را می توان به 4-5 ساعت کاهش داد.

کارایی روش PCR

وسعت مواد بالینی مورد مطالعه

نه تنها مواد بیولوژیکی از یک بیمار می تواند به عنوان نمونه در یک واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده شود، بلکه بسیاری از سوبستراهای دیگر که در آنها مولکول های DNA را می توان با حساسیت بالا شناسایی کرد، به عنوان مثال، آب، خاک، غذا، میکروارگانیسم ها، سواب ها و موارد دیگر. .

تمام مزایای فوق این روش منحصر به فرد - حساسیت و ویژگی بالا، شناسایی عامل عفونی و تعیین ژنوتیپ هر ژن انسانی، راندمان بالا و صرفه جویی در زمان، تطبیق پذیری پایه ابزار - این امکان را به روش PCR می دهد که امروزه به طور گسترده در بالینی مورد استفاده قرار گیرد. تشخیص، عمل پزشکی، تحقیقات علمی، کیفیت کنترل و بسیاری از زمینه های دیگر.

کاربرد PCR

زمینه های کاربرد واکنش زنجیره ای پلیمراز به عنوان یک روش مدرن زیست شناسی مولکولی متنوع است. این تا حد زیادی به دلیل گستردگی مواد قابل تجزیه و تحلیل است (تقریباً هر چیزی که بتوان از آن DNA کم و بیش باکیفیت جدا کرد می‌تواند به موضوع تحقیق تبدیل شود)، و همچنین آغازگرهای انتخاب شده. زمینه های اصلی کاربرد PCR:

پزشکی بالینی

• تشخیص بیماری های عفونی
• تشخیص بیماری های ارثی
• تشخیص جهش
• ژنوتیپ کردن
• فناوری های سلولی
• ایجاد گذرنامه ژنتیکی

بوم شناسی

• نظارت بر محیط زیست
• تجزیه و تحلیل مواد غذایی
• تجزیه و تحلیل ارگانیسم های اصلاح شده ژنتیکی (GMOs)

پزشکی قانونی و جرم شناسی

• شناسایی شخصی
• استقرار پدری

فارماکولوژی

دامپزشکی

تحقیقات علمی (زیست شناسی مولکولی، ژنتیک)

سازماندهی آزمایشگاه PCR

ترتیب اطلاعات

نام	جلد	تولید	روش	گربه شماره

محتوا

کسانی که به روش های جدید تشخیصی علاقه دارند باید بدانند که روش PCR چیست. قابلیت های فنی مدرن در زمینه تحقیقات آزمایشگاهی این فرصت را برای تشخیص بسیاری از بیماری ها در مراحل اولیه فراهم می کند. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در حال حاضر دقیق ترین و جدیدترین روش در نظر گرفته می شود.

تجزیه و تحلیل PCR

تجزیه و تحلیل PCR - چیست؟ در این روش از اصول زیست شناسی مولکولی استفاده می شود. برای مطالعه مواد، از آنزیم های خاصی استفاده می شود که به طور مکرر و سریع قطعات DNA و RNA عوامل بیماری زا را کپی می کنند. انواع مختلفی از آنالیز PCR بسته به ماده مورد آزمایش (خون، ادرار، مدفوع و غیره) وجود دارد. پس از پردازش، کارکنان آزمایشگاه نتیجه به دست آمده را با پایگاه داده مقایسه می کنند، غلظت و نوع پاتوژن را شناسایی می کنند.

تجزیه و تحلیل PCR در یک سیکلر (دستگاه) ویژه ای قرار می گیرد که لوله ها را با مواد زیستی گرم و خنک می کند. تغییرات دما برای تکثیر قطعه ضروری است. دقت نتیجه به دقت رژیم دما بستگی دارد. روش واکنش زنجیره ای پلیمراز به شناسایی موارد زیر کمک می کند:

• مونونوکلئوز عفونی؛
• عفونت سیتومگالوویروس؛
• هپاتیت ویروسی G، C، B، A؛
• عفونت ها/بیماری های مقاربتی (STIs/STDs): گاردنرلوز، تریکومونیاز، اوره پلاسموز.
• عفونت تبخال؛
• ویروس های انکوژنیک؛
• لیستریوز؛
• عفونت هلیکوباکتر پیلوری؛
• آنسفالیت منتقله از کنه، بورلیوز؛
• بیماری سل؛
• کاندیدیازیس

خون

در حال حاضر با توجه به جدید بودن فناوری، آزمایش خون PCR همچنان قیمت بالایی دارد. برای تهیه بیومتریال، نیازی به رعایت الزامات خاصی ندارید. حتی تغییرات در ترکیب ناشی از فعالیت بدنی، استرس یا تغییر در رژیم غذایی بر نتایج مطالعه تأثیری ندارد. آزمایش خون PCR فقط با مصرف عوامل ضد باکتری خراب می شود، بنابراین قبل از انجام آزمایش باید بین درمان و آزمایش مکث کنید.

آزمایش خون PCR رایج ترین گزینه برای تشخیص پاتولوژی های عفونی مزمن و حاد با تظاهرات ویروسی یا غیر معمول است. روش های تحقیق سرولوژیکی در اجرای آنها مشکلات خاصی دارند - حضور پاتوژن با وجود آنتی بادی ها در بدن انسان تعیین می شود. اگر شرایط بیمار زمان لازم را برای رشد او فراهم نکند، نتیجه ممکن است منفی کاذب باشد.

اسمیر

در زمینه زنان، از آنالیز اسمیر PCR برای بررسی وجود میکروارگانیسم های عفونی استفاده می شود. کار با مواد مطابق با همان اصل خون انجام می شود: بزرگ شدن چندگانه قطعات DNA پاتوژن به منظور شناسایی آسان آن. این همچنین به تشخیص عفونت های پنهان در یک زن کمک می کند. مایعات بیولوژیکی مختلفی را می توان برای تجزیه و تحلیل مصرف کرد: بزاق، خلط، ادرار، خون. در زنان، برای تعیین دقیق، اغلب از یک اسمیر از مخاط واژن از کانال دهانه رحم استفاده می شود.

نشانه های خاصی برای انجام PCR وجود دارد. اغلب باید برای شناسایی پاتوژن مقاوم به آنتی بیوتیک ها انجام شود. در زنان، نشانه های اصلی تشخیص با استفاده از این روش عبارتند از:

• بارداری که دشوار است؛
• مرحله حاد بیماری های مقاربتی؛
• اگر این ظن وجود داشته باشد که یک بیماری مقاربتی به مرحله مزمن پیشرفت کرده است.
• جستجو برای علل ناباروری

کالا

برای تشخیص عفونت، پزشک ممکن است آزمایش مدفوع PCR را تجویز کند. برای به دست آوردن مطمئن ترین نتایج پس از آزمایش، قبل از جمع آوری مواد زیستی باید قوانین زیر را رعایت کنید:

• چند روز قبل از مصرف ملین ها خودداری کنید: روغن ها، شیاف ها.
• داروهایی که رنگ خاصی به مدفوع می دهند، به عنوان مثال، حاوی آهن را حذف کنید.

ادرار

در صورت لزوم، پزشک ممکن است ادرار را برای آزمایش مصرف کند. دقت بالا امکان کار با هر مایع بیولوژیکی را که بتوان از آن DNA ویروسی استخراج کرد، باز می کند. برای انجام آزمایش ادرار PCR، باید قبل از جمع آوری مواد، محدودیت های زیر را رعایت کنید:

• قطع رابطه جنسی حداقل 1 روز قبل از عمل؛
• 3 هفته قبل از آزمایش، هر گونه درمان ضد باکتریایی باید تکمیل شود، زیرا داروها تصویر را تار می کنند.
• شما باید آزمایش را با معده خالی انجام دهید (مایعات نیز ممنوع هستند).
• شما باید اولین قسمت صبحانه مواد را مصرف کنید.

نتایج آزمایش PCR

با توجه به مطالب فوق مشخص می شود که آنالیز PCR چیست و مزایای آشکار این روش تحقیق قابل مشاهده است. مزیت دیگر این روش تشخیصی، سهولت در رمزگشایی نتایج است. با توجه به مدت زمان انجام آنالیز PCR (خود فرآیند حدود 5 ساعت طول می کشد، اما آزمایشگاه داده ها را در 1-2 روز تولید می کند)، این روش تشخیصی بهترین گزینه برای شناسایی بسیاری از عفونت ها می شود. بر اساس نتایج، پزشک ممکن است به شما بگوید که آزمایش:

1. منفی - ماده آزمایشی حاوی پاتوژن مورد نظر نبود.
2. مثبت - RNA و DNA پاتوژن پیدا شد.

گاهی اوقات تعیین کمی میکروارگانیسم ها انجام می شود. این برای بیماری هایی که توسط عوامل بیماری زا فرصت طلب ایجاد می شوند ضروری است. ویژگی این ویروس ها این است که فقط در مقادیر زیاد ظاهر می شوند و یافتن آنها از طریق تحقیقات متعارف بسیار مشکل ساز است. این عامل برای انتخاب تاکتیک های درمانی برای درمان موثر عفونت های ویروسی، به عنوان مثال، هپاتیت، HIV مهم است.

برای 12 عفونت

برای درک کامل اینکه تشخیص PCR عفونت ها چیست و چقدر موثر است، باید بدانید که می تواند تا 12 عامل بیماری زا را جدا کند. متن فقط در شرایط آزمایشگاهی انجام می شود. برای تحقیق از آنزیم های خاصی استفاده می شود که مقدار قطعات RNA و DNA ویروس را چندین برابر افزایش می دهد. تجزیه و تحلیل PCR برای 12 عفونت می تواند تشخیص دهد:

• مایکوباکتریوم توبرکلوزیس؛
• سیتومگالوویروس؛
• هپاتیت C، G، B، A;
• تبخال 1، 2 نوع؛
• ویروس اپشتین بار (مونونوکلئوز عفونی)؛
• عفونت هایی که از طریق جنسی منتقل می شوند، به عنوان مثال، کلامیدیا؛
• لیستریوز؛
• عفونت کاندیدا؛
• هلیکوباکتر پیلوری؛
• بورلیوز، آنسفالیت منتقله از طریق کنه.

برای هپاتیت C

این روش تشخیصی به تعیین وجود ویروس در خون کمک می کند. این به پزشکان این فرصت را می دهد که در مورد وجود یا عدم وجود آن صحبت کنند. دو نوع آنالیز PCR برای هپاتیت C وجود دارد: کیفی و کمی. گزینه اول فقط حضور آن را نشان می دهد و ممکن است عبارت "تشخیص داده شد" / "شناسایی نشده" باشد. این نوع تست دارای حساسیت 10-500 IU/ml است. این نشان می دهد که اگر محتوای پاتوژن در بدن کم باشد، تجزیه و تحلیل "تشخیص داده نمی شود".

تجزیه و تحلیل کمی دقیق تر است و غلظت عفونت را در خون نشان می دهد. این شاخص به عنوان "بار ویروسی" نامیده می شود و در مقدار RNA ویروسی در هر حجم خاص خون اندازه گیری می شود. رمزگشایی در آزمایشگاه های مختلف ممکن است متفاوت باشد. علاوه بر اندازه گیری IU/ml، از واحدهای "کپی" استفاده می شود. با استفاده از فرمول: 1 IU = 4 کپی می توانید کپی ها را در هر IU بشمارید. اگر مقدار رمزگشایی برای حضور ویروس از 800000 IU/ml (یا 800*103) بیشتر شود، این نشان دهنده محتوای بالای پاتوژن است.

برای سل

آزمایش باید در صبح انجام شود. این امر به منظور جلوگیری از خروج کل خلطی که در طول شب به وجود آمده از معده مهم است. آنالیز PCR برای سل به اندازه ELISA، Mantoux و توموگرافی مهم است. این آزمایش به شناسایی وجود مایکوباکتریوم، وضعیت ادرار، ایمونوگلوبولین تام، ESR و تعیین وضعیت ریه ها در لحظه کمک می کند. برای اطمینان از نتایج دقیق هنگام تجزیه و تحلیل PCR، باید با رعایت قوانین زیر انجام شود:

1. کاشت 3 بار انجام می شود، اما آسپیراسیون کامل محتویات معده باید فقط در یک محیط بیمارستان انجام شود.
2. مایکوباکتریوم ها با کشت توده های موجود در معده در کمتر از 50 درصد تشخیص ها شناسایی می شوند. حتی زمانی که شرایط مطلوب به دست می آید، به جای آن سونوگرافی توصیه می شود.
3. حتی اگر نتیجه منفی باشد، امکان ابتلا به سل با تغییرات ESR، ایمونوگلوبولین یا سایر شاخص ها را نمی توان به طور کامل رد کرد.
4. کشت مواد در طی PCR در صورتی که به عنوان بخشی از معاینه برونکوسکوپی به دست آید، کمتر مستعد ابتلا به شرایط پاتولوژیک است که مشکوک به سل در کودک را رد می کند.

برای HIV

برای بسیاری از افراد، این تشخیص حکم اعدام در نظر گرفته می شود. به همین دلیل، پس از آمیزش مکرر، شخص به سیگنال هایی که بدنش می دهد (و گاهی اوقات آنها را ابداع می کند) توجه بیشتری می کند. مطمئن ترین گزینه برای تایید یا رد این بیماری، آزمایش PCR برای HIV است. از این آزمایش می توان برای تعیین مشکلات سلامتی احتمالی زیر استفاده کرد:

1. رد/تأیید وجود HIV در دوره سرم منفی.
2. تعیین ژنوتیپ HIV-1، HIV-2.
3. شفاف سازی شرح فرآیند پاتولوژیک در صورت وجود نتایج مشکوک ایمونوبلات.
4. عفونت بعد از انتقال خون
5. تعیین وضعیت HIV در کودکان متولد شده از مادران ناقل این بیماری.
6. به ایجاد نظارت بر بار ویروسی بدن کمک می کند.

برای HPV

ویروس پاپیلوما را می توان در هر فردی تشخیص داد، می تواند برای مدت طولانی پنهان بماند. رشد توسط سیستم ایمنی ضعیف، استرس یا طغیان های عاطفی تحریک می شود. آزمایش PCR برای HPV به تعیین غلظت ویروس در خون کمک می کند. به همین دلیل، توصیه می‌شود که تعیین‌ها به‌جای کیفی، به صورت کمی انجام شود. این داده ها به پیش بینی احتمال عفونت بدخیم کمک می کند.

روش تشخیص وجود HPV بر اساس ویژگی اصلی PCR برای جداسازی DNA ویروس از مواد است. با توجه به حساسیت بالای آزمایش، حتی مقادیر کمی از باکتری ها شناسایی خواهد شد. تحقیقات کمی این فرصت را برای پزشکان فراهم می کند تا درجه خطر بیماری را تعیین کنند و برای آینده پیش بینی کنند. این تشخیص برای همه مردان و زنانی که کاندیلوم ها را کشف کرده اند اجباری است. تجزیه و تحلیل کمی PCR به تعیین علت ایجاد HPV کمک می کند: کاهش موقت ایمنی یا یک بیماری مزمن.

برای تبخال

این نوع تشخیص در میکروبیولوژی به انجام آنالیز PCR برای تبخال با دقت بالا کمک می کند. کپی برداری از قطعات DNA ویروس تنها در صورتی انجام می شود که ژن مورد نظر در ماده وجود داشته باشد. در این مورد، نتایج آزمایش می تواند وجود یا عدم وجود پاتوژن را نشان دهد. حتی در غلظت های پایین در خون نیز قابل تشخیص است.

مزیت دیگر تست PCR این است که می تواند عفونت ویروسی تبخال را بلافاصله پس از عفونت، قبل از ظهور علائم بالینی تشخیص دهد. شما می توانید نوع تبخال (1 یا 2) را تعیین کنید؛ هیچ آمادگی خاصی برای انجام آزمایش لازم نیست، اما پزشکان توصیه می کنند که قبل از خون گیری از:

• سرخ شده در روغن؛
• حاد؛
• الکل؛
• چربی

در دوران بارداری

هنگام حمل کودک، انجام این تحقیق برای ثبت وضعیت زن بسیار مهم است. تجزیه و تحلیل PCR در دوران بارداری در لیست موثرترین روش ها برای تعیین وجود بیماری های مختلف گنجانده شده است. این آزمایش نه تنها برای شناسایی آسیب شناسی، بلکه برای تعیین احتمال عفونت کودک در رحم ضروری است. تنها به لطف تشخیص PCR امکان شناسایی درجه پیشرفت و توسعه بسیاری از عفونت ها در داخل رحم فراهم شده است.

انجام آزمایشات PCR

اگر تعجب می کنید که چگونه تجزیه و تحلیل PCR انجام می شود، باید هر مورد جداگانه را با در نظر گرفتن نوع بیومتریال در نظر گرفت. خراش دادن، اسمیر یا خون گیری ویژگی های خاص خود را دارد، به عنوان مثال:

• پلاسما در صبح اهدا می شود.
• ادرار فقط ابتدا در صبح، در شرایط آزمایشگاهی در یک ظرف استریل گرفته می شود.
• اسمیر یا خراش دادن تنها پس از پرهیز از آمیزش جنسی به مدت حداقل 3 روز نشان دهنده خواهد بود.
• در دوران قاعدگی و 2 روز بعد از آن نمی توانید اسمیر بگیرید.

کجا برای آزمایش PCR انجام دهیم

این نوع تحقیقات به روش های تشخیصی مدرن و پیشرفته اشاره دارد. آزمایشات با استفاده از روش PCR باید در آزمایشگاه هایی انجام شود که دارای تمام تجهیزات لازم برای به دست آوردن نتایج کامل هستند. پرسنل واجد شرایط و آموزش دیده نقش به همان اندازه مهم ایفا می کنند. به آزمایشگاه های بزرگ، جدی و شناخته شده ترجیح دهید. این نه تنها به شما کمک می کند تا به سرعت به نتایج برسید، بلکه قابلیت اطمینان آنها را نیز تضمین می کند.

قیمت

سوال دیگری که اغلب مورد توجه بیماران است: هزینه آزمایش PCR چقدر است؟ با توجه به جدید بودن روش و نیاز به خرید تجهیزات گران قیمت، قیمت تست نسبتاً بالا است. هزینه PCR به نوع عفونتی که فرد برای آن آزمایش می شود بستگی دارد. قیمت تقریبی و زمان انجام آزمایشات به شرح زیر است:

1. STI در 1 روز بررسی می شود، قیمت 400-500 روبل است.
2. هرپس، HPV، ویروس اپشتین بار، سیتومگلویروس در عرض 24 ساعت شناسایی می شوند، قیمت - 300-500 روبل.
3. تجزیه و تحلیل هپاتیت ظرف 5 روز انجام می شود، قیمت یک گزینه کیفی 500 روبل است، یک گزینه کمی 2000 روبل است.
4. هلیکوباکتر پیلوری در عرض 24 ساعت شناسایی می شود، قیمت 400 روبل است.
5. آنتی ژن ها، آنتی بادی های HIV، قیمت - از 380 روبل.
6. تجزیه و تحلیل کیفی HIV RNA، قیمت - از 3500 روبل.
7. تجزیه و تحلیل کمی HIV RNA، قیمت - از 11000 روبل.

ویدئو

توجه!اطلاعات ارائه شده در مقاله فقط برای اهداف اطلاعاتی است. مواد موجود در مقاله خود درمانی را تشویق نمی کند. فقط یک پزشک واجد شرایط می تواند تشخیص دهد و توصیه های درمانی را بر اساس ویژگی های فردی یک بیمار خاص ارائه دهد.

خطایی در متن پیدا کردید؟ آن را انتخاب کنید، Ctrl + Enter را فشار دهید و ما همه چیز را درست می کنیم!

آژانس فدرال آموزش

موسسه آموزشی دولتی

آموزش عالی حرفه ای

"آکادمی آموزشی دولتی کارلیان"

کار درسی با موضوع:

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و کاربرد آن

تکمیل شده توسط: دانش آموز Koryagina Valeria Aleksandrovna

بررسی شده توسط: کارپیکووا ناتالیا میخایلوونا

پتروزاوودسک 2013

معرفی

فصل 1. بررسی ادبیات

1.5.4 اثر فلات

1.5.6 تقویت

نتیجه

معرفی

بیست سال گذشته با معرفی گسترده روش های ژنتیک مولکولی در علوم زیستی، پزشکی و کشاورزی مشخص شده است.

در اوایل دهه 1970، به نظر می رسید که زیست شناسی مولکولی به درجه خاصی از بلوغ رسیده است. در این دوره، موضوع اصلی تحقیقات ژنتیک مولکولی میکروارگانیسم ها بود. انتقال به یوکاریوت ها مشکلات کاملاً جدیدی را برای محققان ایجاد کرد که با استفاده از روش های تجزیه و تحلیل ژنتیکی موجود در آن زمان قابل حل نبود. پیشرفت در توسعه ژنتیک مولکولی به لطف ظهور یک ابزار آزمایشی جدید - اندونوکلئازهای محدود کننده امکان پذیر شد. در سال‌های بعد، تعداد روش‌های آنالیز مستقیم DNA، بر اساس رویکردهای کیفی متفاوت، به سرعت شروع به افزایش کرد.

فن آوری های مدرن در بسیاری از موارد این امکان را فراهم کرده است که مطالعه ساختار ساختاری و عملکردی ژنوم های هسته ای و خارج هسته ای موجودات مختلف در سطح عمیق تری آغاز شود. این امر برای توسعه روش های جدید برای تشخیص و درمان بیماری های مختلف از اهمیت ویژه ای برخوردار بود. امکان استفاده از دستاوردهای ژنتیک مولکولی در زیست شناسی و اصلاح نژاد جمعیت برای شناسایی و تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی جمعیت ها، واریته ها و سویه ها، شناسایی و تایید افراد با ارزش اقتصادی، ایجاد ارگانیسم های اصلاح شده ژنتیکی و حل مسائل دیگر کم اهمیت نبود.

هر روشی مزایا و معایب خاص خود را دارد. هیچ روش جهانی وجود ندارد که بتواند تمام مشکلات پیش آمده را حل کند. بنابراین انتخاب روشی خاص برای تحقیق در حال انجام یکی از مهمترین مراحل هر کار علمی است.

فصل 1. بررسی ادبیات

1.1 تاریخچه کشف واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

در سال 1983 ک.ب. Mullis و همکاران روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را منتشر و ثبت اختراع کردند که قرار بود تأثیر عمیقی بر تمام زمینه های تحقیق و کاربرد اسیدهای نوکلئیک داشته باشد. اهمیت این روش برای زیست شناسی مولکولی و ژنتیک به قدری آشکار و آشکار شد که هفت سال بعد نویسنده جایزه نوبل شیمی را دریافت کرد.

در ابتدای استفاده از روش، پس از هر چرخه گرمایش - خنک‌کننده، لازم بود DNA پلیمراز به مخلوط واکنش اضافه شود، زیرا در دمای بالا که برای جداسازی رشته‌های مارپیچ DNA غیرفعال می‌شد، لازم بود. روش واکنش نسبتاً ناکارآمد بود و به زمان و آنزیم زیادی نیاز داشت. در سال 1986، روش واکنش زنجیره ای پلیمراز به طور قابل توجهی بهبود یافت. پیشنهاد شده است که از DNA پلیمرازهای باکتری های گرمادوست استفاده شود. معلوم شد که این آنزیم ها در برابر حرارت پایدار هستند و می توانند چرخه های واکنش زیادی را تحمل کنند. استفاده از آنها امکان ساده سازی و خودکارسازی PCR را فراهم کرد. یکی از اولین DNA پلیمرازهای مقاوم در برابر حرارت از باکتری جدا شد ترموس آبیو نام برد طاق-پلیمراز

توانایی تکثیر هر بخش DNA که توالی نوکلئوتیدی آن مشخص است و بدست آوردن آن به شکل همگن و کمیت آماده سازی پس از اتمام PCR، PCR را به روشی جایگزین برای شبیه سازی مولکولی قطعات کوتاه DNA تبدیل می کند. در این مورد، نیازی به استفاده از تکنیک‌های روش‌شناختی پیچیده‌ای که در مهندسی ژنتیک در طول شبیه‌سازی مرسوم استفاده می‌شوند، وجود ندارد. توسعه روش PCR قابلیت‌های روش‌شناختی ژنتیک مولکولی و به‌ویژه مهندسی ژنتیک را بسیار گسترش داده است، به طوری که پتانسیل علمی بسیاری از حوزه‌های آن را به شدت تغییر داده و تقویت کرده است.

1.2 انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

· Nested PCR- برای کاهش تعداد محصولات جانبی واکنش استفاده می شود. دو جفت پرایمر استفاده می شود و دو واکنش متوالی انجام می شود. جفت دوم پرایمر ناحیه ای از DNA را در محصول واکنش اول تقویت می کند.

· PCR معکوس- زمانی استفاده می شود که فقط یک منطقه کوچک در توالی مورد نظر شناخته شده باشد. این روش به ویژه هنگامی که به تعیین توالی های همسایه پس از درج DNA در ژنوم می رسد مفید است. برای انجام PCR معکوس، یک سری برش DNA با استفاده از آنزیم های محدود کننده انجام می شود<#"justify">آغازگر واکنش زنجیره ای پلیمراز

· PCR مخصوص گروه- PCR برای بستگان<#"center">1.3 واکنش زنجیره ای پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) که در اواسط دهه 1980 کشف شد، می‌تواند تعداد کپی‌های یک نمونه اصلی را در عرض چند ساعت میلیون‌ها بار چند برابر کند. در طول هر چرخه واکنش، دو نسخه از مولکول اصلی تشکیل می شود. هر یک از نسخه های سنتز شده DNA می تواند به عنوان الگویی برای سنتز نسخه های جدید DNA در چرخه بعدی عمل کند. بنابراین، تکرار مکرر چرخه ها منجر به افزایش تعداد کپی ها در پیشرفت هندسی می شود. از محاسبات به دست می آید که حتی با 30 چرخه، تعداد کپی های مولکول اصلی بیش از 1 میلیارد خواهد بود. حتی اگر در نظر بگیریم که همه آمپلیکون ها در طول هر چرخه کپی نمی شوند، با وجود این، تعداد کل کپی ها رقم بسیار بزرگی است.

هر چرخه واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) شامل مراحل زیر است:

· دناتوره شدن - افزایش دما باعث می شود مولکول DNA دو رشته ای باز شود و به دو تک رشته تقسیم شود.

· بازپخت - کاهش دما به پرایمرها اجازه می دهد تا به مناطق مکمل مولکول DNA متصل شوند.

· ازدیاد طول - آنزیم DNA پلیمراز رشته مکمل را تکمیل می کند.

برای تکثیر یک قطعه انتخاب شده، از دو آغازگر الیگونوکلئوتیدی (پرایمر) که در کنار یک ناحیه DNA خاص قرار دارند استفاده می شود. پرایمر گرا 3 - به سمت یکدیگر و به سمت دنباله ای که باید تقویت شود به پایان می رسد. DNA پلیمراز سنتز (تکمیل) زنجیره های DNA مکمل متقابل را انجام می دهد که با آغازگرها شروع می شود. در طول سنتز DNA، آغازگرها به صورت فیزیکی در زنجیره مولکول‌های DNA تازه سنتز شده ادغام می‌شوند. هر رشته از یک مولکول DNA که با استفاده از یکی از آغازگرها تشکیل می شود، می تواند به عنوان الگویی برای سنتز یک رشته DNA مکمل با استفاده از آغازگر دیگری عمل کند.

1.4 انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

واکنش زنجیره ای پلیمراز در لوله های پلی پروپیلن جدار نازک ویژه ای انجام می شود که از نظر اندازه با سیکلر حرارتی (تقویت کننده) مورد استفاده سازگار است - دستگاهی که مشخصات دما و زمان مراحل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را کنترل می کند.

1.5 اصل روش واکنش زنجیره ای پلیمراز

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) یک روش تقویت DNA در شرایط آزمایشگاهی است که می تواند برای جداسازی و تکثیر یک توالی DNA خاص میلیاردها بار در عرض چند ساعت استفاده شود. توانایی به دست آوردن تعداد زیادی کپی از یک منطقه کاملاً تعریف شده از ژنوم مطالعه یک نمونه DNA موجود را بسیار ساده می کند.

برای انجام یک واکنش زنجیره ای پلیمراز، تعدادی از شرایط باید رعایت شود:

1.5.1 وجود تعدادی از اجزاء در مخلوط واکنش

اجزای اصلی مخلوط واکنش (PCR) عبارتند از: Tris-HCl، KCl، MgCl. 2مخلوطی از تری فسفات های نوکلئوتیدی (ATP، GTP، CTP، TTP)، آغازگرها (الیگونوکلئوتیدها)، آماده سازی DNA، DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت. هر یک از اجزای مخلوط واکنش مستقیماً در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) دخالت دارند و غلظت معرف ها مستقیماً بر روند تقویت تأثیر می گذارد.

· Tris-HCl - pH مخلوط واکنش را تعیین می کند، ظرفیت بافر ایجاد می کند. فعالیت DNA پلیمراز به pH محیط بستگی دارد، بنابراین مقدار pH مستقیماً بر روند واکنش زنجیره ای پلیمراز تأثیر می گذارد. به طور معمول مقدار pH بین 8 تا 9.5 است. مقدار pH بالا به این دلیل است که pH بافر Tril-HCl با افزایش دما کاهش می یابد.

· KCl - غلظت کلرید پتاسیم تا 50 میلی مولار بر روند دناتوره شدن و فرآیندهای بازپخت تأثیر می گذارد؛ غلظت های بالاتر از 50 میلی مولار DNA پلیمراز را مهار می کند.

· MgCl 2- از آنجایی که DNA پلیمراز منیزیم است 2+- آنزیم وابسته، سپس غلظت یون منیزیم بر فعالیت آنزیم (Mg 2+تشکیل کمپلکس با NTP - این کمپلکس ها بستر پلیمراز هستند). غلظت بالا منجر به افزایش در تقویت غیر اختصاصی می شود و غلظت کم منجر به مهار واکنش می شود؛ بهینه (برای پلیمرازهای مختلف) در محدوده 0.5 - 5 میلی مولار است. علاوه بر این، غلظت نمک های منیزیم بر روند دناتوراسیون و فرآیندهای بازپخت تأثیر می گذارد - افزایش غلظت Mg. 2+باعث افزایش دمای ذوب DNA می شود (یعنی دمایی که در آن 50 درصد رشته های DNA دو رشته ای به رشته های تک رشته ای جدا می شوند).

· NTP - تری فسفات های نوکلئوتیدی مونومرهای مستقیم اسیدهای نوکلئیک هستند. برای جلوگیری از خاتمه زنجیره، نسبت مساوی از هر چهار نوکلئوتید تری فسفات توصیه می شود. غلظت کم این اجزا در مخلوط واکنش احتمال خطا را هنگام ساخت زنجیره DNA مکمل افزایش می دهد.

· آغازگرها - بهینه ترین آنها استفاده از آغازگرهایی با اختلاف دمای ذوب بیش از 2 تا 4 است. o ج- گاهی در طول نگهداری طولانی مدت در دمای 4 o C یا پس از تعداد زیادی انجماد و ذوب، پرایمرها ساختارهای ثانویه - دایمرها را تشکیل می دهند و کارایی PCR را کاهش می دهند. رفع این مشکل به جوجه کشی در حمام آب ختم می شود (T=95 o ج) به مدت 3 دقیقه و سپس خنک شدن سریع تا 0o با.

· آماده سازی DNA - کمیت و کیفیت آماده سازی DNA (ماتریس) به طور مستقیم بر روند و پارامترهای واکنش زنجیره ای پلیمراز تأثیر می گذارد. مقادیر بیش از حد نمونه DNA واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را مهار می کند. ناخالصی های مواد مختلف موجود در آماده سازی DNA نیز می تواند اثربخشی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را کاهش دهد: استات سدیم، کلرید سدیم، ایزوپروپانول، اتانول، هپارین، فنل، اوره، هموگلوبین و غیره.

· DNA پلیمراز - هنگام استفاده از مقدار کمی DNA پلیمراز، کاهش سنتز محصول نهایی به نسبت مستقیم با اندازه قطعات مشاهده می شود. بیش از 2-4 برابر پلیمراز منجر به ظهور طیف های منتشر و 4-16 برابر - طیف های غیر اختصاصی کم مولکولی می شود. محدوده غلظت های مورد استفاده 0.5 - 1.5 واحد فعالیت در هر 25 میکرولیتر مخلوط PCR است.

علاوه بر اجزای اصلی مخلوط PCR، تعدادی از مواد اضافی استفاده می شود که شاخص های کمی و کیفی PCR را بهبود می بخشد: استامید (5٪) - حلالیت اجزای اصلی را افزایش می دهد. بتائین (نمک سدیم) - تثبیت DNA پلیمراز، کاهش دمای ذوب DNA، یکسان کردن دمای ذوب. آلبومین گاوی (10-100 میکروگرم در میلی لیتر) - تثبیت DNA پلیمراز. دی متیل سولفوکسید (1-10٪) - افزایش حلالیت اجزای اصلی. فرمامید (2-10٪) - افزایش ویژگی بازپخت. گلیسرول (15-20٪) - افزایش پایداری حرارتی آنزیم، کاهش دمای دناتوراسیون نمونه DNA. سولفات آمونیوم - کاهش دمای دناتوراسیون و بازپخت.

1.5.2 حالت چرخه ای و دما

ظاهر کلی یک برنامه واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) به شرح زیر است:

صحنه. دناتوره سازی اولیه طولانی مدت آماده سازی DNA. چرخه 1

صحنه. دناتوره سازی سریع آماده سازی DNA. بازپخت پرایمرها. ازدیاد طول.30 - 45 چرخه.

صحنه. ازدیاد طول. خنک کردن مخلوط واکنش. چرخه 1.

هر عنصر مرحله - دناتوراسیون، بازپخت، ازدیاد طول - دارای ویژگی های دمایی و زمانی فردی است. پارامترهای دما و زمان برای هر عنصر به صورت تجربی، مطابق با شاخص های کمی و کیفی محصولات تقویت انتخاب می شوند.

دناتوره سازی. در طی این عنصر از واکنش زنجیره ای پلیمراز، یک مولکول DNA دو رشته ای به دو تک رشته ای تقسیم می شود. پارامترهای دمای دناتوراسیون در محدوده 90 - 95 می باشد o C، اما در مورد نمونه DNA با محتوای بالای گوانین و سیتوزین، دما باید به 98 افزایش یابد. o ج. دمای دناتوراسیون باید برای دناتوره کردن کامل رشته‌های DNA و جلوگیری از «سرد شدن ناگهانی» یا بازپخت سریع کافی باشد، با این حال، DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت در دماهای بالا پایداری کمتری دارد. بنابراین، انتخاب پارامترهای دمای دناتوراسیون بهینه برای نسبت پرایمر/نمونه (تهیه DNA) یک شرط مهم در هنگام انجام تقویت است. اگر دمای دناتوراسیون در مرحله اول بالاتر از 95 باشد o C، توصیه می شود پس از دناتوراسیون اولیه، DNA پلیمراز را به مخلوط واکنش اضافه کنید. مدت زمان این عنصر از مرحله در طی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) باید برای دناتوره کردن کامل DNA کافی باشد، اما در عین حال تأثیر قابل توجهی بر فعالیت DNA پلیمراز در دمای معین نداشته باشد.

آنیلینگ. دمای بازپخت (T آ ) یکی از مهمترین پارامترهای واکنش زنجیره ای پلیمراز است. دمای بازپخت برای هر آغازگر خاص به صورت جداگانه انتخاب می شود. این بستگی به طول و ترکیب نوکلئوتیدی پرایمر دارد. معمولاً 2 - 4 کمتر است o از مقدار نقطه ذوب (T متر ) آغازگر. اگر دمای بازپخت سیستم کمتر از حد مطلوب باشد، تعداد قطعات تقویت‌شده غیر اختصاصی افزایش می‌یابد و برعکس، دمای بالاتر تعداد محصولات تقویت‌شده را کاهش می‌دهد. در این حالت، غلظت آمپلیکون‌های خاص می‌تواند به شدت کاهش یابد، تا زمانی که واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) مهار شود. افزایش زمان بازپخت همچنین منجر به افزایش تعداد آمپلیکون های غیر اختصاصی می شود.

ازدیاد طول. به طور معمول، هر نوع DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت، دمای بهینه برای فعالیت دارد. سرعت سنتز رشته DNA مکمل توسط آنزیم نیز برای هر پلیمراز خاص است (به طور متوسط ​​30 - 60 نوکلئوتید در ثانیه یا 1 - 2 هزار باز در دقیقه است) بنابراین زمان افزایش طول بسته به نوع انتخاب می شود. DNA پلیمراز و طول ناحیه تقویت شده

1.5.3 اصول اولیه برای انتخاب پرایمرها

هنگام ایجاد یک سیستم آزمایش PCR، یکی از وظایف اصلی انتخاب صحیح پرایمرها است که باید تعدادی از معیارها را برآورده کند:

پرایمرها باید خاص باشند. توجه ویژه ای به 3 می شود - انتهای آغازگرها، زیرا از آنهاست که Taq پلیمراز شروع به تکمیل رشته DNA مکمل می کند. اگر ویژگی آنها ناکافی باشد، احتمالاً فرآیندهای نامطلوبی در لوله آزمایش با مخلوط واکنش رخ می دهد، یعنی سنتز DNA غیر اختصاصی (قطعات کوتاه یا بلند). در الکتروفورز به شکل نوارهای اضافی سنگین یا سبک قابل مشاهده است. این در ارزیابی نتایج واکنش تداخل دارد، زیرا به راحتی می توان یک محصول تقویتی خاص را با DNA خارجی سنتز شده اشتباه گرفت. برخی از پرایمرها و dNTP ها برای سنتز DNA غیر اختصاصی مصرف می شوند که منجر به کاهش قابل توجه حساسیت می شود.

پرایمرها نباید دایمر و حلقه تشکیل دهند، یعنی. رشته های دوتایی پایدار نباید در نتیجه بازپخت پرایمرها به خود یا به یکدیگر تشکیل شوند.

1.5.4 اثر فلات

لازم به ذکر است که فرآیند تجمع محصولات تقویتی خاص در یک پیشرفت هندسی تنها برای مدت زمان محدودی به طول می انجامد و سپس بازده آن به شدت کاهش می یابد. این به دلیل به اصطلاح اثر فلات است.

اثر مدت فلات برای توصیف فرآیند تجمع محصولات PCR در آخرین چرخه های تقویت استفاده می شود.

بسته به شرایط و تعداد چرخه های واکنش تقویت، در زمانی که اثر حاصل می شود فلات تحت تأثیر استفاده از سوبستراها (dNTP ها و آغازگرها)، پایداری واکنش دهنده ها (dNTPs و آنزیم)، مقدار بازدارنده ها، از جمله پیروفسفات ها و DNA دوبلکس، رقابت برای واکنش دهنده ها توسط محصولات غیر اختصاصی یا دایمرهای آغازگر، غلظت یک محصول خاص. و دناتوره شدن ناقص در غلظت های بالای محصولات تقویتی.

هرچه غلظت اولیه DNA هدف کمتر باشد، خطر شکست واکنش بیشتر است. فلات." این نقطه ممکن است قبل از اینکه محصولات تقویت کننده خاص کافی برای تجزیه و تحلیل وجود داشته باشد رخ دهد. فقط سیستم های آزمایشی بهینه شده می توانند از این امر جلوگیری کنند.

1.5.5 تهیه نمونه بیولوژیکی

برای جداسازی DNA، بسته به وظایفی که در دست دارد از تکنیک های مختلفی استفاده می شود. ماهیت آنها در استخراج (استخراج) DNA از یک آماده سازی بیولوژیکی و حذف یا خنثی سازی ناخالصی های خارجی برای به دست آوردن یک آماده سازی DNA با خلوص مناسب برای PCR است.

روش به دست آوردن یک آماده سازی DNA خالص توصیف شده توسط Marmur استاندارد در نظر گرفته می شود و قبلاً کلاسیک شده است. این شامل پروتئولیز آنزیمی و به دنبال آن پروتئین زدایی و رسوب مجدد DNA با الکل است. این روش به شما امکان می دهد یک آماده سازی DNA خالص را بدست آورید. با این حال، کاملاً کار فشرده است و شامل کار با مواد تهاجمی و با بوی قوی مانند فنل و کلروفرم است.

یکی از روش های رایج در حال حاضر، روش استخراج DNA است که توسط بوم و همکاران پیشنهاد شده است. این روش مبتنی بر استفاده از یک عامل آشوب‌گردان قوی، گوانیدین تیوسیانات (GuSCN)، برای لیز سلولی و جذب بعدی DNA بر روی یک حامل (دانه‌های شیشه‌ای، خاک دیاتومه، شیر شیشه‌ای و غیره) است. پس از شستشو، DNA در نمونه باقی می ماند و روی حامل جذب می شود و با استفاده از یک بافر شستشو به راحتی از آن جدا می شود. این روش مناسب، از نظر فناوری پیشرفته و مناسب برای تهیه نمونه برای تقویت است. با این حال، از دست دادن DNA به دلیل جذب غیرقابل برگشت در حامل و همچنین در طول شستشوهای متعدد امکان پذیر است. این امر به ویژه هنگام کار با مقادیر کمی از DNA در یک نمونه مهم است. علاوه بر این، حتی مقادیر کمی از GuSCN می تواند PCR را مهار کند. بنابراین، هنگام استفاده از این روش، انتخاب صحیح جاذب و رعایت دقیق نکات ظریف تکنولوژیکی بسیار مهم است.

گروه دیگری از روش‌های آماده‌سازی نمونه مبتنی بر استفاده از مبدل‌های یونی نوع Chilex است که برخلاف شیشه، DNA را جذب نمی‌کند، بلکه ناخالصی‌هایی است که در واکنش تداخل دارند. به عنوان یک قاعده، این فناوری شامل دو مرحله است: جوشاندن نمونه و جذب ناخالصی ها در مبدل یونی. این روش به دلیل سادگی اجرا بسیار جذاب است. در بیشتر موارد برای کار با مواد بالینی مناسب است. متأسفانه، گاهی اوقات نمونه هایی با ناخالصی وجود دارد که با استفاده از مبدل های یونی قابل حذف نیستند. علاوه بر این، برخی از میکروارگانیسم ها را نمی توان با جوشاندن ساده از بین برد. در این موارد لازم است مراحل تکمیلی پردازش نمونه معرفی شود.

بنابراین، انتخاب روش آماده سازی نمونه باید با درک اهداف تجزیه و تحلیل مورد نظر در نظر گرفته شود.

1.5.6 تقویت

برای انجام واکنش تقویت، لازم است مخلوط واکنش تهیه شود و نمونه DNA آنالیز شده به آن اضافه شود. مهم است که برخی از ویژگی های آنیل پرایمر را در نظر بگیرید. واقعیت این است که، به عنوان یک قاعده، نمونه بیولوژیکی تجزیه و تحلیل شده حاوی مولکول های مختلف DNA است که آغازگرهای مورد استفاده در واکنش دارای همسانی جزئی و در برخی موارد قابل توجه هستند. علاوه بر این، پرایمرها می توانند به یکدیگر بازپخت شوند و دایمرهای آغازگر را تشکیل دهند. هر دو منجر به مصرف قابل توجه پرایمرها برای سنتز محصولات جانبی (غیر اختصاصی) محصولات واکنش می شوند و در نتیجه حساسیت سیستم را به میزان قابل توجهی کاهش می دهند. این امر خواندن نتایج واکنش را در طول الکتروفورز دشوار یا غیرممکن می کند.

1.6 ترکیب مخلوط واکنش استاندارد PCR

x بافر PCR (محلول 100 میلی مولار Tris-HCl، pH 9.0، محلول KCl 500 میلی مولار، محلول MgCl2 25 میلی مولار ) …….2.5 µl

آب (MilliQ)……………………………………………….8/18 µl

مخلوطی از تری فسفات های نوکلئوتیدی (dNTPs)

محلول میلی‌مولار هر………………………………………….0.5 µl

پرایمر 1 (محلول 10 میلی مولار) ……………………………………………………….1 µl

پرایمر 2 (محلول 10 میلی مولار) ……………………………………………………….1 µl

DNA پلیمراز (5 واحد در میکرولیتر) ……………………………………………… 0.2 میکرولیتر

نمونه DNA (20 نانوگرم در میکرولیتر) ……………………………………………………………………………………………………………………………..

1.7 ارزیابی نتایج واکنش

برای ارزیابی صحیح نتایج PCR، درک این نکته مهم است که این روش کمی نیست. از نظر تئوری، محصولات تکثیر مولکول‌های DNA هدف را می‌توان با استفاده از الکتروفورز پس از 30-35 چرخه شناسایی کرد. با این حال، در عمل، این فقط در مواردی انجام می شود که واکنش در شرایط نزدیک به ایده آل انجام می شود، که اغلب در زندگی چنین نیست. درجه خلوص آماده سازی DNA تأثیر زیادی بر کارایی تقویت دارد، به عنوان مثال. وجود بازدارنده های خاصی در مخلوط واکنش که در برخی موارد خلاص شدن از شر آنها بسیار دشوار است. گاهی اوقات، به دلیل وجود آنها، حتی ده ها هزار مولکول DNA هدف را نمی توان تقویت کرد. بنابراین، اغلب هیچ رابطه مستقیمی بین مقدار اولیه DNA هدف و مقدار نهایی محصولات تقویت وجود ندارد.

فصل 2: ​​کاربردهای واکنش زنجیره ای پلیمراز

PCR در بسیاری از زمینه ها برای آزمایش و آزمایش های علمی استفاده می شود.

پزشکی قانونی

PCR برای مقایسه به اصطلاح "اثر انگشت ژنتیکی" استفاده می شود. نمونه ای از مواد ژنتیکی از محل جنایت - خون، بزاق، مایع منی، مو و غیره مورد نیاز است. با ماده ژنتیکی مظنون مقایسه می شود. مقدار بسیار کمی از DNA کافی است، از نظر تئوری یک کپی. DNA به قطعات شکسته شده و سپس با استفاده از PCR تکثیر می شود. قطعات با استفاده از الکتروفورز DNA جدا می شوند. الگوی حاصل از آرایش نوارهای DNA اثر انگشت ژنتیکی نامیده می شود.

ایجاد پدری

نتایج الکتروفورز قطعات DNA تکثیر شده توسط PCR. پدر کودک. مادر. کودک برخی از ویژگی های نقش ژنتیکی هر دو والدین را به ارث برد که در نتیجه اثری جدید و منحصر به فرد ایجاد کرد.

اگرچه اثر انگشت ژنتیکی منحصر به فرد است، اما هنوز هم می توان با ایجاد چندین اثر انگشت، روابط خانوادگی برقرار کرد. همین روش را می توان برای ایجاد ارتباط تکاملی بین موجودات، کمی تغییر داد.

تشخیص پزشکی

PCR سرعت قابل توجهی در تشخیص بیماری های ارثی و ویروسی را امکان پذیر می کند. ژن مورد نظر با استفاده از پرایمرهای مناسب با PCR تکثیر می شود و سپس برای شناسایی جهش ها توالی یابی می شود. عفونت های ویروسی را می توان بلافاصله پس از عفونت، هفته ها یا ماه ها قبل از ظهور علائم تشخیص داد.

پزشکی شخصی

گاهی اوقات داروها برای برخی از بیماران سمی یا آلرژی زا هستند. دلایل این امر تا حدی به دلیل تفاوت های فردی در حساسیت و متابولیسم داروها و مشتقات آنها است. این تفاوت ها در سطح ژنتیکی مشخص می شود. به عنوان مثال، در یک بیمار یک سیتوکروم خاص ممکن است فعال تر باشد، در دیگری - کمتر. به منظور تعیین نوع سیتوکروم یک بیمار، پیشنهاد می شود قبل از استفاده از دارو، آنالیز PCR انجام شود. این تجزیه و تحلیل ژنوتیپ اولیه نامیده می شود.

شبیه سازی ژن

شبیه سازی ژن، فرآیند جداسازی ژن ها و در نتیجه دستکاری های مهندسی ژنتیک، به دست آوردن مقدار زیادی از محصول یک ژن است. PCR برای تقویت یک ژن استفاده می شود، که سپس در یک ناقل قرار می گیرد - قطعه ای از DNA که یک ژن خارجی را به همان ارگانیسم یا ارگانیسم دیگری که برای رشد مناسب است منتقل می کند. به عنوان مثال، پلاسمیدها یا DNA ویروسی به عنوان ناقل استفاده می شوند. قرار دادن ژن ها در یک ارگانیسم خارجی معمولاً برای تولید محصول آن ژن - RNA یا اغلب یک پروتئین استفاده می شود. به این ترتیب پروتئین های زیادی در مقادیر صنعتی برای استفاده در کشاورزی، پزشکی و غیره به دست می آید.

توالی یابی DNA

در روش توالی یابی با استفاده از دی اکسی نوکلئوتیدهای نشاندار شده با یک برچسب فلورسنت یا ایزوتوپ رادیواکتیو، PCR بخشی جدایی ناپذیر است، زیرا در طول پلیمریزاسیون است که مشتقات نوکلئوتیدهای نشاندار شده با برچسب فلورسنت یا رادیواکتیو به زنجیره DNA وارد می شوند. این واکنش را متوقف می‌کند و اجازه می‌دهد تا موقعیت نوکلئوتیدهای خاص پس از جدا شدن زنجیره‌های سنتز شده در ژل مشخص شود.

جهش زایی

در حال حاضر PCR به روش اصلی برای انجام جهش زایی تبدیل شده است. استفاده از PCR امکان ساده‌سازی و تسریع فرآیند جهش‌زایی و همچنین قابل اطمینان‌تر کردن و تکرارپذیری آن را فراهم کرده است.

روش PCR امکان آنالیز وجود توالی‌های ویروس پاپیلومای انسانی را در بخش‌های بیوپسی تومورهای دهانه رحم انسان با پارافین 40 سال قبل از این مطالعه فراهم کرد. علاوه بر این، با استفاده از PCR، تکثیر و شبیه سازی قطعات DNA میتوکندری از بقایای فسیلی یک مغز انسان 7 هزار ساله امکان پذیر شد!

با استفاده از لیزات اسپرم‌های فردی انسان، توانایی تجزیه و تحلیل همزمان دو جایگاه واقع در کروموزوم‌های غیر همولوگ مختلف نشان داده شد. این رویکرد فرصتی منحصر به فرد برای تجزیه و تحلیل ژنتیکی خوب و مطالعه نوترکیبی کروموزومی، پلی‌مورفیسم DNA و غیره فراهم می‌کند. روش آنالیز اسپرم‌های منفرد بلافاصله کاربرد عملی در پزشکی قانونی پیدا کرد، زیرا تایپ HLA سلول‌های هاپلوئید تعیین پدری یا شناسایی را ممکن می‌سازد. یک جنایتکار (کمپلکس HLA مجموعه‌ای از ژن‌های مجتمع اصلی سازگاری بافتی انسان است؛ مکان‌های کمپلکس HLA چندشکلی‌ترین مکان‌های شناخته شده در مهره‌داران عالی هستند: در یک گونه، در هر مکان تعداد غیرعادی زیادی از آلل‌های مختلف وجود دارد - اشکال جایگزین همان ژن).

با استفاده از PCR، می توان ادغام صحیح ساختارهای ژنتیکی خارجی را در یک منطقه از پیش تعیین شده از ژنوم سلول های مورد مطالعه تعیین کرد. DNA سلولی کل به دو آغازگر اولیگونوکلئوتیدی بازپخت می شود، که یکی از آنها مکمل بخشی از DNA میزبان در نزدیکی نقطه درج است و دیگری برای توالی قطعه یکپارچه در رشته DNA ضد موازی. واکنش زنجیره ای پلیمراز، در مورد ساختار DNA کروموزومی بدون تغییر در محل درج مورد نظر، منجر به تشکیل قطعات DNA تک رشته ای با اندازه ناشناخته می شود و در مورد درج برنامه ریزی شده، قطعات DNA دو رشته ای یک اندازه شناخته شده، با فاصله بین محل های بازپخت دو آغازگر تعیین می شود. علاوه بر این، درجه تقویت ناحیه ژنوم آنالیز شده در حالت اول به صورت خطی به تعداد چرخه ها و در حالت دوم نمایی خواهد بود. تجمع تصاعدی یک قطعه تقویت شده با اندازه از پیش تعیین شده در طول PCR به ما امکان می دهد پس از تقسیم الکتروفورتیک آماده سازی DNA به صورت بصری آن را مشاهده کنیم و در مورد قرار دادن یک توالی خارجی در ناحیه معینی از DNA کروموزومی نتیجه گیری بدون ابهام داشته باشیم.

نتیجه

روش PCR در حال حاضر بیشترین کاربرد را به عنوان روشی برای تشخیص انواع بیماری های عفونی دارد. PCR به شما امکان می دهد تا علت عفونت را شناسایی کنید حتی اگر نمونه گرفته شده برای تجزیه و تحلیل فقط حاوی چند مولکول DNA از پاتوژن باشد. PCR به طور گسترده در تشخیص زودهنگام عفونت HIV، هپاتیت ویروسی و غیره استفاده می شود. امروزه تقریبا هیچ عامل عفونی وجود ندارد که با استفاده از PCR نتوان آن را تشخیص داد.

فهرست ادبیات استفاده شده

1.Padutov V.E.، Baranov O.Yu.، Voropaev E.V. روشهای آنالیز ژنتیکی مولکولی - Mn.: Unipol، 2007. - 176 p.

2.PCR "زمان واقعی" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. و غیره.؛ ویرایش شده توسط d.b. n D.V. ریبریکووا پیشگفتار L.A. اوسترمن و آکادمیک RAS و RAAS E.D. Sverdlov; ویرایش دوم، برگردان و اضافی - M.: BINOM. آزمایشگاه دانش، 1388. - 223 ص.

.پاتروشف L.I. سیستم های ژنتیکی مصنوعی - M.: Nauka، 2005. - در 2 جلد.

.بیوتکنولوژی مولکولی ب. گلیک، جی پاسترناک. اصول و کاربردها 589 ص، 2002

5.شچلکونوف S.N. مهندسی ژنتیک. - نووسیبیرسک: سیب. دانشگاه انتشارات، 2004. - 496 ص.

ویرایش شده توسط A.A. ووربیوا "واکنش زنجیره ای پلیمراز و کاربرد آن برای تشخیص در درماتوونرولوژی"؛ خبرگزاری پزشکی - 72 صفحه

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. سو/ - مجله پزشکی

تدریس خصوصی

برای مطالعه یک موضوع به کمک نیاز دارید؟

متخصصان ما در مورد موضوعات مورد علاقه شما مشاوره یا خدمات آموزشی ارائه خواهند کرد.
درخواست خود را ارسال کنیدبا نشان دادن موضوع در حال حاضر برای اطلاع از امکان اخذ مشاوره.