Какие компоненты участвуют в реакции агглютинации. Варианты ускоренных реакций агглютинации. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты. Реакции прямой гемагглютинации

Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов.

Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами (рис. 7.37). Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя , выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.

Рис. 7.37 а,б . Реакция агглютинации с IgM -антителами (а) и IgG -антителами (б )

1. Определение возбудителя, выделенного от больного Ориентировочная реакция агглютинации на стекле (рис. 7.38). К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.

Рис. 7.38.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного (рис. 7.39). К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного.

Рис. 52

2. Определение антител в сыворотке крови больного
Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного (рис. 7.39). К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.
- Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
- Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.
3. Реакция агглютинации для определения групп крови Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (табл. б) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (И), В (III). Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I).

Таблица 7.6. Определение групп крови АВО

Результаты реакции		Групповая
		принадлежность
		исследуемой крови
эритроцитов со	сыворотки (плазмы)
стандартными	со стандартными
сыворотками

Реакция агглютинации (РА) - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита. Образовавшийся осадок называют агглютинатом.

РА используют:

1. Для обнаружения антител в сыворотке крови больного (серодиагностика).

2. Для определения вида и серовара выделенной от больного чистой культуры патогенных микроорганизмов (серотипирование).

Реакцию агглютинации используют для определения антител в сыворотке крови больных, например, при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), бруцеллёзе (реакции Райта, Хеддлсона), туляремии, лептоспирозах и других инфекционных болезнях, а также для определения выделяемого от больного возбудителя (кишечные инфекции, коклюш и др.). РА применяется для определения групп крови, резус - фактора и др.

Для реакции необходимы следующие компоненты:

1. Антиген (агглютиноген) должен быть корпускулярным, то есть это взвесь живых или убитых микроорганизмов (диагностику м), эритроцитов или других клеток. Обычно используют суточную культуру микроорганизмов, выращенную на скошенном агаре. Культуру смывают 3 - 4 мл изотонического раствора, переносят в стерильную пробирку, определяют густоту. Взвесь должна быть гомогенной и содержать до 3 млрд. микробных клеток в 1 мл. Применение взвеси убитых микробов - диагностикумов - облегчает работу (готовятся на производстве).

2. Антитела (агглютинины) находятся в сыворотке больного (при серодиагностике) или в агглютинирующей сыворотке (при серотипировании). Агглютинирующие сыворотки получают путём иммунизации кроликов убитыми бактериями.

Титром агглютинирующей сыворотки называется наибольшее её разведение, в котором на реагирует с соответствующим антигеном в определённых условиях опыта.

Агглютинирующие сыворотки могут быть нативными (неадсорбированными) и адсорбированными. Нативные сыворотки в небольших разведениях взаимодействуют не только с тем видом микроорганизмов, которым иммунизировали животное для получения сыворотки, но и с родственными видами микроорганизмов, т. к. в них присутствуют групповые антитела (антитела к микроорганизмам, имеющим общие антигены). Нативные сыворотки используются для развёрнутой реакции агглютинации (при серодиагностике), где учитывается не только наличие реакции, но и динамика нарастания титра антител.

Если из нативной сыворотки извлечь (адсорбировать) групповые антитела путём взаимодействия с родственными бактериями, имеющими групповые антигены, получаются адсорбированные сыворотки. Адсорбированные сыворотки могут быть монорецепторными (или типоспецифическими), содержащими антитела только к одному антигенному рецептору, Поливалентные сыворотки состоят из смеси нескольких адсорбированных или неадсорбированных сывороток. Адсорбированные сыворотки используют для реакции агглютинации на стекле.

При иммунизации животных подвижными бактериями с Н-антигеном получают Н-агглютинирующие сыворотки, содержащие Н-антитела (например, сальмонеллёзная монорецепторная Н-агглютинирующая сыворотка). Иммунизацией О-антигеном получают О-агглютинирующие сыворотки, содержащие О-антитела, (например, сальмонеллёзная групповая адсорбированная О-агглютинирующая сыворотка, противохолерная О-агглютинирующая сыворотка). Иммунизацией Н- и О-антигенами получают сыворотки с Н- и О -антителами.

Причём О-агтлютинины дают мелкозернистый агглютинат, а Н-агглютинины - крупнохлопчатый осадок.

3. Электролит - изотонический раствор NaCl (0,9 % раствор хлорида натрия, приготовленный на дистиллированной воде).

Существует два основных метода постановки реакции агглютинации: реакция на стекле (иногда ее называют ориентировочной или пластинчатой) и развернутая реакция (в пробирках)

Постановка реакции агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капели сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Диагностическая агглютинирующая сыворотка берётся в одном разведении, которое в зависимости от её титра составляет 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100. В одну из капель сыворотки и каплю изотонического раствора петлей вносят культуру исследуемого микроорганизма и тщательно перемешивают. Капля хлорида натрия с микроорганизмами - контроль антигена, капля сыворотки без микроорганизмов - контроль сыворотки. Нельзя переносить культуру из капли с сывороткой в каплю с NaCl. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остается прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерное помутнение, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината, то результат считают положительным. Если в капле с сывороткой и антигеном равномерное помутнение, то это отрицательный результат. Реакция отчётливее видна на тёмном фоне.

Сыворотка

1. контроль антигена

2. контроль сыворотки

Агглютинация крови — это склеивание и оседание в виде осадка эритроцитов, бактерий и других клеток, которые несут антигены.

Процесс происходит под воздействием агглютининов, которые являются специфическими веществами. В роли этих веществ выступают лектины или антитела.

Возможные виды агглютинации при определении группы крови

Агглютинация бывает специфической и неспецифической. В первом случае реакция происходит с участием трех компонентов:

антигенов;
антител;
электролитов (применяется изотонический раствор).

Используются все возможные виды агглютинации при определении группы крови, однако это не единственный случай.

С какой целью используется?

Реакция агглютинации крови применяется для того, чтобы выявить возбудителя инфекционного заболевания. При этом он оседает, и его легко обнаружить в осадке. Данный процесс используется, как уже упоминалось выше, и при Именно об этом и пойдет речь дальше.

Каковы особенности?

Эритроциты содержат антигены типа А и В. Они связываются с антителами ά и β соответственно. Группы крови и реакции агглютинации:

1, 0 (ά, β) - отсутствуют антигены на поверхности эритроцитов;
2, А (β) - присутствует антиген А и антитело β;
3, В (ά) - содержится антиген В и антитело ά;
4, АВ (00) - присутствуют два антигена, антитела отсутствуют.

Стоит отметить, что антигены уже наблюдаются у эмбриона. Что касается антител, они появляются после рождения, на первом месяце жизни.

От группы крови зависит совместимость людей. В этом и состоит причина отторжения плода организмом матери. Другими словами, у нее присутствуют антитела к антигенам крови будущего ребенка. В этом случае возникает несовместимость. Кроме того, группа крови обязательно учитывается при переливании.

Подготовка

Группы крови и реакции агглютинации — совместимые понятия, которые зачастую используются в медицине.

Перед тестом важно придерживаться определенных инструкций. Следует на время исключить употребление некоторых продуктов и лекарственных препаратов. Это поможет сделать результаты более точными. Рекомендации, которых нужно придерживаться, назначает врач. Дело в том, что у разных лабораторий могут не совпадать диапазоны полученных значений, то есть они немного отличаются.

Условия для проведения теста

Чтобы группа крови была определена точно, важно подобрать правильное оснащение. К таковому относятся:

и пипетка;
стеклянные палочки;
стандартные изогемагглютинирующие сыворотки;
сухие фаянсовые тарелки, которые разделены на 4 сектора.

Существуют требования и к условиям проведения теста:

дневное освещение;
температура в помещении выше +16 ˚С;
использование объемов крови и сыворотки в соотношении 1:10;
достоверные результаты получаются в течение 5 минут.

Выше представлены основные условия и инструменты. Агглютинация крови может проводиться несколькими способами, и каждый из них выдвигает индивидуальные требования.

Методы

Возможные методы определения группы крови с помощью агглютинации:

стандартный метод;
перекрестная реакция;
использование цоликлонов;
экспресс-методика с применением набора «Эритротест-группокарт».

Стандартный метод

Агглютинация крови проявляется с использованием эритроцитов пациента. Также применяются стандартные сыворотки, которые содержат известные антигены.

На плоскую тарелку размещается по 1 капле четырех сывороток. Затем с помощью стеклянных палочек на нее вносится кровь пациента, подлежащая исследованию. В данном случае удобно использовать глазные пипетки. Следует придерживаться соотношения 1:10. Сыворотка и кровь осторожно перемешивается. В течение пяти минут можно проводить оценку.

Расшифровка результатов теста простым методом

По истечении указанного времени в каплях сыворотки наблюдается просветление. В некоторых можно увидеть, что агглютинация эритроцитов произошла (мелкие хлопья), в других она отсутствует.

Существуют следующие варианты:

реакции нет во всех пробах сывороток − 1 группа;
свертывание произошло везде, кроме 2 пробы - 2 группа;
отсутствие реакции только в 3 пробе - 3 группа;
агглютинация произошла везде - 4 группа.

Таким образом, главное — правильно распределить сыворотки. Тогда расшифровать результат не составит труда. Если агглютинация крови проявляется слабо, рекомендуется провести анализ повторно. В случае с мелкими хлопьями их рассматривают под микроскопом.

Перекрестная реакция

Иногда простым способом невозможно точное определение группы крови. Агглютинация в таком случае проводится с помощью метода перекрестной реакции. В отличие от первого варианта теста, важное значение здесь имеют стандартные эритроциты. Кровь пациента набирается в пробирку, центрифугируется, а затем пипеткой откачивается сыворотка для дальнейших исследований.

Она в количестве 2 капель помещается на тарелку, потом в нее добавляются стандартные эритроциты групп А и В. Содержимое размешивается путем покачивания емкости.

Результаты метода перекрестной реакции

Через пять минут пробы готовы к рассмотрению. Варианты такие:

склеивание произошло в обеих каплях - 1 группа;
хлопья не наблюдаются ни в одной из проб - 4 группа;
процесс виден в одном образце - 2 или 3 группа (в зависимости от того, где именно свернулась кровь).

Метод с использованием цоликлонов

Для определения группы крови агглютинация таким способом проводится с применением синтетических заменителей сывороток. Они называются цоликлонами. В них содержатся искусственные заменители ά и β-агглютинов, известных как эритротесты (розового и синего цвета соответственно). Реакция происходит между ними и эритроцитами крови пациента.

Такой метод является самым точным и надежным. В основном он не требует повторного проведения исследования. Оценка результатов осуществляется аналогичным образом, как в случае стандартного метода. Особенность состоит в том, что должна обязательно быть подтверждена реакцией со специфическим синтетическим заменителем (анти-АВ). Кроме того, в ней не наблюдается склеивание при добавлении раствора хлорида натрия.

Экспресс-методика с набором «Эритротест-группокарт»

Рассматривая возможные методы анализа при определении группы крови, стоит отметить, что данный способ имеет свои особенности. Они заключаются в том, что результат можно оценить не только в лаборатории, но и в полевых условиях. Для проведения исследования используется специальный набор. Он включает в себя карточку с лунками, на дне которых уже присутствуют высушенные реагенты. Помимо анти-АВ, анти-А и анти-В, применяется анти-D, позволяющий определить резус-фактор.

Этот метод не требует особой подготовки, разрешено использовать кровь, которая взята из пальца, допускается наличие в ней консервантов. Сначала необходимо внести в каждую лунку по капле воды, чтобы растворить ингредиенты. После этого добавляется кровь, слегка размешивается. Через три минуты будет получен результат.

Ложная агглютинация

Иногда данные, полученные после проведения теста, не соответствуют действительности. Такое явление зависит от определенных факторов.

Выделяют три вида ложной реакции:

Псевдоагглютинация. Истинное склеивание не происходит, эритроциты просто складываются в виде монетных столбиков. Если добавить пару капель физиологического раствора, они распадаются. Подобное явление распознается под микроскопом.

Холодная агглютинация крови. Такая реакция наблюдается в том случае, если условия для проведения исследования были неблагоприятными. Когда температура ниже +16 ˚С, может проявляться склеивание.

Панагглютинация. При наличии инфекции в крови результаты тестов могут быть ложными. Такое явление также возможно в случае с онкологическими заболеваниями, при сепсисе.

Агглютинация очень важна в медицине. Она позволяет не только определять группу крови, но и выявлять возбудителя заболеваний, а также наличие инфекций. Главное, придерживаться рекомендаций врача при подготовке к данной процедуре. Что касается медицинского персонала, его задача состоит в создании благоприятных условий и соблюдении всех правил. Только таким образом можно добиться точных результатов при выполнении агглютинации крови.

Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками. В результате такого взаимодействия образуются частицы-агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат). В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие, грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Протекает реакция в две фазы: первая — специфическое соединение антигена и антитела, вторая — кеспецифическая, т. е. образование видимого агглютината. Выпадение агглютината происходит в присутствии электролитов, например хлорида натрия. Находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют подвижность.

Реакцию агглютинации широко применяют для серо-логической диагностики инфекционных заболеваний и определения антигенной структуры выделенных микробов. Для установления антигенной структуры возбудителя, выделенного из организма больного или носителя, используют специфическую иммунную сыворотку, полученную иммунизацией животных (кролика, осла, барана) определенными микроорганизмами. Идентификацию микроба проводят в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными или монорецепторными сыворотками или в пробирках с видовыми агглютинирующими сыворотками. Адсорбированные сыворотки содержат антитела только к специфическим для данного микроба антигенам, а монорецепторные — только к одному специфическому антигену возбудителя.

Видовые сыворотки содержат антитела ко всем антигенам определенного микроба.

Принадлежность выделенной культуры микроорганизма к данному виду определяется при агглютинации его известной сывороткой до титра антител, указанного на этикетке ампулы с сывороткой. Титром антител сыворотки считают последнее разведение ее, в котором еще наблюдается агглютинация культуры микробов, использованных для иммунизации животного. Адсорбированные и монорецепторные сыворотки используют обычно в реакции агглютинации на стекле неразведенными.

При.определении наличия антител в сыворотке крови больного ее разводят изотоническим раствором хлорида натрия начиная с разведения 1: 50 до 1: 800 или более. В каждое разведение добавляют взвесь живых или убитых микробов. Препараты, содержащие микробы, убитые нагреванием или формалином, называют диагностикумами. Диагностикумы, полученные путем прогревания культур микроорганизмов, содержат только соматические антигены. При использовании только формалина у микробов сохраняются и жгутиковые антигены.

При наличии антител в крови больного происходит склеивание взятого в реакцию диагностикума и образование осадка (агглютината) на две пробирки. В этом случае результаты реакции агглютинации расценивают как положительные. В контрольной пробирке, куда вносят изотонический раствор хлорида натрия и диагностикум, взвесь микробов должна быть гомогенной (отрицательная реакция агглютинации).

Учет результатов реакции агглютинации при некоторых заболеваниях, например лептоспирозе, проводят только микроскопически в темном поле зрения микроскопа (микроагглютинация). Для постановки серологического диагноза заболевания учитывают диагностический заболевание. Обычно он соответствует разведению сыворотки 1: 100 или 1: 200.

Антитела в сыворотке крови больного с помощью реакции агглютинации можно выявить при заболевании брюшным тифом и паратифах (реакция Видаля), бруцеллезе (реакция Райта), туляремии и др.
Реакция Кастеллани. При некоторых инфекционных заболеваниях или иммунизации микроорганизмами, имеющими в своем составе групповые антигены, в сыворотке крови, помимо специфических для данного вида антител, появляются еще и групповые. В этом случае родственные виды бактерий будут агглютинироваться полученными сыворотками.

Кастеллани предложил метод адсорбции групповых антител из иммунных сывороток, основанный на удалении их с помощью микроорганизмов родственных видов, которые имеют групповые антигены, но лишены специфических. Культура таких микроорганизмов, добавленная в сыворотку, адсорбирует неспецифические групповые антитела, и после удаления комплекса антиген — антитело с помощью центрифугирования в сыворотке остаются только специфические иммуноглобулины. Сыворотки, обработанные по методу Кастеллани, могут быть использованы в реакции агглютинации как высокоспецифичные.