PCR의 기초. 폴리 메라 제 연쇠 반응. 혈액 서비스 실무에 PCR 적용

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방법 폴리 메라 제 연쇠 반응거의 30년 전에 미국 과학자에 의해 발견되었습니다. 캐리 멀리스. 이 기술은 진단 도구로 의학에서 널리 사용되며 그 본질은 특수 효소를 사용하여 DNA 섹션을 복사하는 것입니다. 중합효소) 인위적으로 시험관 내에서.

이 방법은 의학의 어떤 영역에서 사용됩니까?

DNA 복사는 왜 수행되며 어떻게 의학에 도움이 됩니까?
이 기술을 사용하면 다음이 가능합니다.

유전자를 분리하고 복제합니다.
유전질환과 전염병을 진단합니다.
친자관계를 결정합니다. 아이는 생물학적 부모로부터 일부 유전적 특징을 물려받았지만, 고유한 유전적 정체성을 갖고 있습니다. 부모 유전자와 동일한 일부 유전자의 존재를 통해 우리는 관계 구축에 관해 이야기할 수 있습니다.

중합효소연쇄반응은 법의학 실무에도 사용됩니다.

범죄 현장에서 법의학 과학자들은 유전 물질 샘플을 수집합니다. 여기에는 머리카락, 타액, 혈액이 포함됩니다. 이후 중합효소 반응 기술 덕분에 DNA를 증폭해 채취한 검체의 신원을 의심자의 유전물질과 비교할 수 있다.

중합효소 연쇄반응은 의학에서 효과적으로 사용됩니다.

폐학 실습에서 - 세균성 및 바이러스성 폐렴, 결핵을 구별합니다.
부인과 및 비뇨기과 진료 - 우레아플라스마증, 클라미디아, 마이코플라스마 감염, 가드네렐라증, 헤르페스, 임질을 확인합니다.
위장병학 실습에서.
혈액학 - 종양 바이러스 및 거대 세포 바이러스 감염을 확인합니다.
바이러스성 간염, 디프테리아, 살모넬라증과 같은 전염병의 신속한 진단에 사용됩니다.

현재 이 방법은 전염병 진단에 가장 일반적입니다. 바이러스성 간염, HIV, 성병, 결핵, 진드기 매개 뇌염).

반응 중에는 무슨 일이 일어나는가?

반응 자체는 화학적으로 간단합니다. 반응의 DNA 소스는 혈액 한 방울, 머리카락, 피부 조각 등이 될 수 있습니다. 이론적으로 반응에는 필요한 시약, 시험관, 생물학적 시료 및 열원이 필요합니다.

중합효소 반응을 통해 생물학적 물질이 포함된 샘플에 병원체의 DNA 분자가 하나 또는 여러 개만 포함되어 있는 경우에도 감염을 감지할 수 있습니다.

반응 중에 DNA 중합 효소 효소 덕분에 배가가 발생합니다 ( 복제) DNA 섹션. 디옥시리보핵산 자체( DNA로 약칭)은 유전 정보를 저장하고 딸세포로 전달하기 때문에 우리에게 중요합니다. DNA는 반복되는 블록으로 구성된 나선 모양을 가지고 있습니다. 이 블록은 DNA의 가장 작은 단위인 뉴클레오티드를 구성합니다. 뉴클레오티드는 아미노산으로 형성됩니다.

DNA 섹션의 복제 과정은 반복되는 주기 동안 발생합니다. 이러한 각 주기에서 원래의 DNA 단편이 복사되어 두 배가 될 뿐만 아니라 이전 증폭 주기에서 이미 두 배가 된 단편도 복사됩니다. 이 모든 것은 기하학적 진행 과정과 유사합니다.

존재한다:

자연증폭( 즉 DNA를 복제하고 증식시키는 과정이다.) 이는 우리 몸에서 발생하며 결정론적이고 미리 결정된 과정입니다.
중합효소 연쇄반응으로 인해 발생하는 인공적인 증폭. 이 경우, 복사 과정이 제어되어 짧은 핵산 부분이라도 복제할 수 있습니다.

각 복제 주기가 완료되면 핵산 단편의 수가 기하급수적으로 증가합니다. 그래서 그 과정 자체를 '연쇄반응'이라고 부른다.

30~40주기 후에 조각의 수는 수십억에 이릅니다.

증폭용 시험관 내에서 (시험관 내에서) 특정 외부 DNA 단편( 즉, DNA는 환자의 것이 아니라 병원체의 것입니다.). 생성된 용액에 특정 단편이 포함되어 있지 않으면 중합효소의 작용에 따른 연쇄 반응이 진행되지 않습니다. 이는 PCR의 특이성이 높다는 사실을 설명합니다.

PCR 진단 단계

1. DNA는 연구 중인 물질로부터 분리됩니다.
2. DNA는 특수한 뉴클레오티드 용액에 첨가됩니다.
3. DNA 단백질이 응고되도록 용액을 섭씨 90~95도의 온도로 가열합니다.
4. 온도를 60도까지 낮추십시오.
5. 온도가 상승하고 하강하는 주기가 반복될수록 핵산 부위의 수가 증가합니다.

6. 전기영동을 수행하여 결과를 합산하고 배가 결과를 계산합니다.

이 진단의 장점은 무엇입니까?

다양성: 모든 핵산 샘플이 이 방법에 적합합니다.
높은 특이성: 병원체는 그 병원체에 특이적인 독특한 DNA 사슬 서열을 가지고 있습니다. 따라서 PCR 결과는 신뢰할 수 있으며 한 병원체의 유전자와 다른 병원체의 유전자를 혼동하는 것은 불가능합니다.
단일 병원체 분자의 존재에도 민감합니다.

연구에 필요한 소량의 재료. 피 한 방울이라도 괜찮습니다. 최소한의 샘플량을 사용하여 결과를 얻는 능력은 소아과, 신생아학, 신경학 연구는 물론 법의학 실습에서도 매우 중요합니다.
급성뿐만 아니라 무증상, 만성 감염을 판별하는 능력.
많은 병원성 배양물은 다른 방법을 사용하여 시험관 내에서 배양하는 것이 매우 어렵지만, 중합효소 반응을 통해 배양물이 필요한 양만큼 증식될 수 있습니다.

이 진단에는 어떤 단점이 있습니까?

PCR을 하려는 물질에 살아있는 병원체의 DNA뿐만 아니라 죽은 병원체의 DNA도 포함되어 있다면 두 DNA 모두 증폭이 일어나게 됩니다. 따라서 진단 후 처방되는 치료법이 완전히 정확하지 않을 수도 있습니다. 얼마 후 치료 효과를 모니터링하는 것이 좋습니다.
미생물 존재에 대한 민감도 증가는 어떤 면에서는 단점으로 간주될 수도 있습니다. 결국 인체에는 일반적으로 기회 감염성 미생물, 즉 장, 위 및 기타 내부 장기에 사는 미생물이 포함되어 있습니다. 이러한 미생물은 특정 불리한 조건(위생 요건 미준수, 오염된 식수 등)에서만 인간에게 해를 끼칠 수 있습니다. PCR 기술은 병리를 유발하지는 않지만 이러한 미생물의 DNA도 증폭시킵니다.
다양한 테스트 시스템의 PCR 결과는 서로 다를 수 있습니다. 이 기술에는 여러 가지 수정 사항이 있습니다. 중첩된», « 비대칭», « 거꾸로 된», « 양적» PCR 및 기타.

기사 마지막 부분을 참조하세요.
중합효소연쇄반응(PCR) 1983년 미국 과학자 Kary Mullis가 발명했습니다. 이후 그는 이 발명으로 노벨상을 받았습니다. 현재 PCR 진단은 감염성 질환을 진단하는 가장 정확하고 민감한 방법 중 하나입니다.
중합효소연쇄반응(PCR)- 분자 생물학의 실험 방법으로, 생물학적 물질(샘플)에서 특정 핵산 단편(DNA)의 작은 농도를 크게 증가시키는 방법입니다.
PCR 방법은 인공적인 조건(시험관 내)에서 효소를 사용하여 DNA의 특정 부분을 반복적으로 두 배로 늘리는 방법을 기반으로 합니다. 결과적으로, 시각적 검출에 충분한 양의 DNA가 생성됩니다. 이 경우 지정된 조건을 만족하는 부분만 복사되며, 해당 부분이 연구 중인 샘플에 있는 경우에만 복사됩니다.
PCR은 단순히 DNA 복사본 수를 늘리는 것(이 과정을 증폭이라고 함) 외에도 유전 물질을 이용한 다양한 조작(돌연변이 도입, DNA 단편 접합)을 허용하며 예를 들어 생물학 및 의료 분야에서 널리 사용됩니다. , 질병(유전성, 전염성) 진단, 친자 확인, 유전자 복제, 돌연변이 도입 및 새로운 유전자 분리를 위해.

특이성과 적용

PCR 수행

가장 간단한 경우 PCR을 수행하려면 다음 구성 요소가 필요합니다.

증폭이 필요한 DNA 섹션이 포함된 DNA 템플릿
원하는 단편의 말단에 상보적인 두 개의 프라이머;
내열성 DNA 중합효소;
데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(A, G, C, T);
중합효소의 작동에 필요한 Mg2+ 이온;
완충액.

PCR은 일반적으로 최소 0.1°C의 정확도로 시험관을 주기적으로 냉각 및 가열하는 장치인 열순환기에서 수행됩니다. 반응 혼합물의 증발을 방지하려면 바셀린과 같은 끓는점이 높은 오일을 시험관에 추가하십시오. 특정 효소를 첨가하면 PCR 반응의 수율이 높아질 수 있습니다.
반응의 진행

일반적으로 PCR은 20~35주기를 수행하며 각 주기는 3단계로 구성됩니다. 이중 가닥 DNA 주형을 94 - 96°C(또는 특히 내열성 중합효소가 사용되는 경우 98°C)로 0.5 - 2분 동안 가열하여 DNA 가닥을 분리합니다. 이 단계를 변성이라고 합니다. 두 사슬 사이의 수소 결합이 파괴됩니다. 때로는 첫 번째 주기 전에 반응 혼합물을 2~5분 동안 예열하여 매트릭스와 프라이머를 완전히 변성시킵니다.
가닥이 분리되면 프라이머가 단일 가닥 주형에 결합할 수 있도록 온도가 낮아집니다. 이 단계를 어닐링이라고 합니다. 어닐링 온도는 프라이머에 따라 다르며 일반적으로 녹는점보다 4~5°C 낮은 온도에서 선택됩니다. 스테이지 시간은 0.5~2분입니다.

DNA 중합효소는 프라이머를 프라이머로 사용하여 주형 가닥을 복제합니다. 이것이 신장 단계이다. 신장 온도는 중합효소에 따라 달라집니다. 일반적으로 사용되는 중합효소는 72°C에서 가장 활성이 높습니다. 연장 시간은 DNA 중합효소의 유형과 증폭된 단편의 길이에 따라 달라집니다. 일반적으로 신장 시간은 염기쌍 1000개당 1분으로 간주됩니다. 모든 주기가 완료된 후 모든 단일 가닥 단편을 완성하기 위해 추가 최종 신장 단계가 수행되는 경우가 많습니다. 이 단계는 10~15분 동안 지속됩니다.
연구에 필요한 재료를 준비하고 연구실로 운반

성공적인 분석을 위해서는 환자로부터 자료를 정확하게 수집하고 적절하게 준비하는 것이 중요합니다. 실험실 진단에서 대부분의 오류(최대 70%)는 시료 준비 단계에서 정확하게 발생하는 것으로 알려져 있습니다. INVITRO 연구실에서는 혈액을 수집하기 위해 현재 진공 시스템을 사용하고 있는데, 이는 환자에게 최소한의 부상을 입히고 다른 한편으로는 혈액과 접촉하지 않는 방식으로 물질을 수집할 수 있습니다. 인력이든 환경이든. 이는 물질의 오염(contamination)을 방지하고 PCR 분석의 객관성을 보장합니다.

DNA - 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid) - 살아있는 유기체의 발달과 기능을 위한 유전 프로그램의 저장, 세대 간 전달 및 구현을 보장하는 두 가지 유형의 핵산 중 하나인 생물학적 중합체입니다. 세포에서 DNA의 주요 역할은 RNA와 단백질의 구조에 대한 정보를 장기간 저장하는 것입니다.

RNA-리보핵산은 화학적 구조가 DNA와 유사한 생물학적 고분자입니다. RNA 분자는 DNA와 동일한 단량체 단위(뉴클레오티드)로 구성됩니다. 자연에서 RNA는 대개 단일 가닥으로 존재합니다. 일부 바이러스에서는 RNA가 유전 정보의 전달자입니다. 세포에서는 DNA에서 단백질로 정보를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. RNA는 DNA 주형에서 합성됩니다. 이 과정을 전사라고 합니다. DNA에는 메신저 또는 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA) 및 수송 RNA(tRNA) 등 수행하는 기능이 다른 세 가지 유형의 RNA 합성을 담당하는 정보가 포함된 영역이 있습니다. 세 가지 유형의 RNA는 모두 어떤 방식으로든 단백질 합성에 관여합니다. 그러나 단백질 합성에 관한 정보는 mRNA에만 담겨 있습니다.

뉴클레오티드는 핵산 분자의 기본 반복 단위로, 질소 함유 염기, 5탄당(5탄당) 및 하나 이상의 인산염 그룹의 화학적 조합의 산물입니다. 핵산에 존재하는 뉴클레오티드는 하나의 인산염 그룹을 포함합니다. 아데닌(A), 아데닌 함유, 구아닌(G) - 구아닌, 시토신(C) - 시토신, 티민(T) - 티민, 우라실(U) - 우라실 등 포함된 질소 염기에 따라 명명됩니다. DNA에는 A, T, G, C의 4가지 유형의 뉴클레오티드가 포함되어 있으며, RNA에는 A, U, G, C의 4가지 유형이 포함되어 있습니다. 모든 DNA 뉴클레오티드의 당은 데옥시리보스, RNA-리보스입니다. 핵산이 형성되면 뉴클레오티드가 결합하여 분자의 당-인산 골격을 형성하며, 한쪽에는 염기가 있습니다.

프라이머는 주형 가닥을 복제하는 데 사용되는 짧은 DNA입니다. 각 프라이머는 이중 가닥 주형의 가닥 중 하나에 상보적이며 증폭된 영역의 시작과 끝을 구성합니다.

문학

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Patrushev L.I. 인공 유전 시스템 - M.: Nauka, 2005 - 2권 - ISBN 5-02-033278-X

중요한!

이 섹션의 정보는 자가 진단 및 자가 치료에 사용할 수 없습니다. 통증이 있거나 기타 질병이 악화되는 경우 진단 검사는 주치의에 의해서만 처방되어야 합니다. 진단을 내리고 적절한 치료를 처방하려면 의사에게 문의해야 합니다.

중합효소연쇄반응(PCR, PCR - 중합효소연쇄반응)은 생물학적 시료에서 특정 DNA 단편(유전자)의 여러 복사본을 얻는 방법입니다.

분자 생물학 방법인 PCR의 본질은 조건 하에서 특수 효소를 사용하여 특정 유전자(DNA의 일부)를 선택적으로 반복적으로 복제하는 것입니다. 시험관 내에서. PCR의 중요한 특징은 특정 조건을 충족하는 특정 DNA 섹션(유전자)의 복사본을 생성한다는 것입니다. DNA를 복제하는 과정의 동의어는 '증폭'입니다. DNA 복제 생체 내증폭이라고도 볼 수 있습니다. 그러나 복제와 달리 중합효소 연쇄반응 과정은 DNA의 짧은 부분(최대 40,000개 염기쌍)을 증폭시킵니다.

기본 원리들

따라서 PCR은 반복되는 온도 주기 동안 시험관 내에서 특정 DNA 단편을 반복적으로 복제하는 것입니다. 하나의 온도 사이클 내에서 반응 과정은 어떻게 발생합니까?

뉴클레오티드 사슬의 형성은 DNA 중합효소에 의해 수행됩니다. 그러나 효소가 작동하려면 발사대가 필요합니다. 플랫폼은 "프라이머"(시더)입니다. 즉, 15-20개 뉴클레오티드 길이의 합성 올리고뉴클레오티드입니다. 두 개의 프라이머(정방향 및 역방향)가 있어야 하며, 이는 DNA 주형의 섹션에 상보적이며, DNA 중합효소에 의해 여러 번 복사되는 것은 프라이머에 의해 제한된 DNA 단편입니다. 중합효소의 작업은 DNA 주형 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 순차적으로 추가하는 것입니다. 따라서 한 온도 주기에서 두 개의 새로운 DNA 단편이 다시 합성됩니다(DNA 분자가 이중 가닥이므로 처음에는 두 개의 매트릭스가 있습니다). 따라서 25~35주기에 걸쳐 프라이머에 의해 결정된 수십억 개의 DNA 영역 복사본이 시험관에 축적됩니다. 별도의 사이클 구조는 다음과 같이 나타낼 수 있습니다.

DNA 변성(용융, DNA 사슬의 발산) - 95°C - 1 또는 2분;
프라이머 어닐링(프라이머는 DNA 주형에 결합하며, 이 단계의 온도는 프라이머의 뉴클레오티드 구성에 따라 결정됩니다) - 60°C(예:) - 1분;
DNA 신장(중합효소가 DNA 사슬을 합성함) - 72°C - 1분(시간은 합성된 단편의 길이에 따라 다름)

실험실에서 중합효소 연쇄반응 방법을 사용하기 위한 장비는 다음으로 구성되어야 합니다.

(또는 열순환기라고도 함)
s용 시스템(PCR 결과 시각화용);
시스템(PCR 결과 분석용);
(샘플 준비용)
세트(기계식 또는 전자식).

PCR 실험실의 전체 기능을 위한 기본 및 보조 장비 외에도 멸균 팁, 테스트 튜브, 테스트 튜브용 랙 및 디스펜서 등 일부 소모품이 필요합니다.

본격적인 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 기존 PCR 실험실의 시약 베이스에는 완충액이 포함된 DNA 중합효소 효소, 프라이머(DNA 주형의 분석 부분의 시작과 끝에 상보적인 작은 합성 DNA 단편), 뉴클레오티드(A, T, G, C)의 혼합물. 정제수도 꼭 필요합니다.

PCR 방법의 장점

연구의 높은 민감도

이 방법의 민감도는 10 5 개의 세포 샘플에서 한 번 발생하더라도 PCR로 증폭하여 표적 서열을 식별할 수 있을 정도입니다.

분석의 특이성

PCR을 사용하면 다른 미생물의 DNA와 숙주 유기체의 DNA가 있는 상태에서 특정 감염원의 DNA를 검출하고 유전자형 분석을 수행할 수 있습니다. 반응성분(프라이머)을 구체적으로 선택함으로써 밀접하게 관련된 미생물의 DNA를 동시에 검출할 수 있습니다.

PCR 방법의 다양성

사실 전염병이나 유전성 인간 질병에 대한 PCR 진단의 경우 동일한 장비를 사용할 수 있고, 샘플 준비 및 분석을 위한 보편적 절차와 동일한 유형의 시약 키트를 따를 수 있습니다.

시간을 절약

PCR의 중요한 장점은 배양 미생물 작업 단계가 없다는 것입니다. 시료 준비, 반응 성능 및 결과 분석이 단순화되고 대부분 자동화됩니다. 덕분에 결과를 얻는 데 걸리는 시간이 4~5시간으로 단축될 수 있습니다.

PCR 방법의 효율성

연구된 임상 자료의 폭

환자의 생물학적 물질은 중합효소연쇄반응의 시료로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 물, 토양, 식품, 미생물, 면봉 등 DNA 분자를 고감도로 식별할 수 있는 다른 많은 기질도 사용할 수 있습니다. .

이 고유한 방법의 위의 모든 장점(높은 민감도 및 특이성, 감염원 식별 및 인간 유전자의 유전형 분석, 높은 효율성 및 시간 절약, 기기 기반의 다양성)을 통해 PCR 방법은 오늘날 임상에서 널리 사용될 수 있습니다. 진단, 의료 행위, 과학 연구, 품질 관리 및 기타 여러 분야.

PCR의 응용

현대 분자생물학 방법인 중합효소연쇄반응의 적용 분야는 다양합니다. 이는 주로 분석할 수 있는 물질의 범위(다소 고품질 DNA를 분리할 수 있는 거의 모든 것이 연구 대상이 될 수 있음)와 선택된 프라이머에 기인합니다. PCR의 주요 적용 분야:

임상 의학

전염병 진단
유전병 진단
돌연변이 검출
유전형 분석
세포 기술
유전자 여권 생성

생태학

환경 모니터링
식품 분석
유전자 변형 생물체(GMO) 분석

법의학과 범죄학

개인 식별
친자관계 확립

약리학

수의학

과학 연구(분자 생물학, 유전학)

PCR 실험실 조직

주문정보

이름	용량	생산	방법	고양이 번호

콘텐츠

새로운 진단 방법에 관심이 있는 사람이라면 PCR 방법이 무엇인지 알아보아야 한다. 실험실 연구 분야의 현대 기술 역량은 초기 단계에서 많은 질병을 발견할 수 있는 기회를 제공합니다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 현재 가장 정확하고 새로운 방법으로 간주됩니다.

PCR 분석

PCR 분석 - 그게 뭐죠? 이 방법은 분자 생물학의 원리를 사용합니다. 물질을 연구하기 위해 병원체의 DNA 및 RNA 단편을 반복적이고 빠르게 복사하는 특수 효소가 사용됩니다. 검사 대상 물질(혈액, 소변, 대변 등)에 따라 PCR 분석 유형이 다릅니다. 처리 후 실험실 직원은 얻은 결과를 데이터베이스와 비교하여 병원체의 농도와 유형을 식별합니다.

PCR 분석은 생체재료로 튜브를 가열 및 냉각하는 특수 사이클러(장치)에 배치됩니다. 조각 복제에는 온도 변화가 필요합니다. 결과의 정확성은 온도 체제의 정확성에 따라 달라집니다. 중합효소 연쇄 반응 방법은 다음을 확인하는 데 도움이 됩니다.

감염성 단핵구증;
거대세포바이러스 감염;
바이러스성 간염 G, C, B, A;
성병/성병(STI/STD): 가드네렐라증, 트리코모나스증, 우레아플라스마증;
헤르페스 감염;
발암성 바이러스;
리스테리아증;
헬리코박터 파일로리 감염;
진드기 매개 뇌염, 보렐리아증;
결핵;
칸디다 증.

피

현재 기술의 최신성으로 인해 PCR 혈액 검사의 가격은 여전히 높습니다. 생체재료를 준비하기 위해 특정 요구 사항을 충족할 필요는 없습니다. 신체 활동, 스트레스, 식이 요법의 변화로 인한 구성 변화도 연구 결과에 영향을 미치지 않습니다. PCR 혈액 검사는 항균제를 복용해야만 손상될 수 있으므로 검사를 받기 전에 치료와 검사 사이에 잠시 멈춰야 합니다.

PCR 혈액 검사는 바이러스 또는 비정형 발현이 있는 만성, 급성 감염성 병리를 진단하기 위한 가장 일반적인 옵션입니다. 혈청학적 연구 방법은 실행에 있어서 특정한 어려움을 안고 있습니다. 병원체의 존재는 인체에 항체가 존재하는지에 따라 결정됩니다. 환자의 상태가 발달할 시간을 허용하지 않는 경우 결과는 거짓 음성일 수 있습니다.

도말 표본

산부인과 분야에서는 감염성 미생물의 존재를 연구하기 위해 PCR 도말 분석이 사용됩니다. 물질에 대한 작업은 혈액과 동일한 원리에 따라 수행됩니다. 쉽게 식별하기 위해 병원체의 DNA 조각을 여러 개 확대합니다. 이는 또한 여성의 숨겨진 감염을 탐지하는 데도 도움이 됩니다. 분석을 위해 타액, 가래, 소변, 혈액 등 다양한 생물학적 체액을 채취할 수 있습니다. 산부인과에서는 정확한 결정을 위해 자궁 경부 질 점막의 도말이 자주 사용됩니다.

PCR 수행에 대한 특정 징후가 있습니다. 종종 항생제에 내성이 있는 병원체를 확인하기 위해 이를 수행해야 합니다. 여성의 경우 이 방법을 사용하는 진단의 주요 징후는 다음과 같습니다.

어려운 임신;
STI의 급성기;
STI가 만성 단계로 진행된 것으로 의심되는 경우;
불임의 원인을 찾아보세요.

칼라

감염을 발견하기 위해 의사는 PCR 대변 검사를 처방할 수 있습니다. 검사 후 가장 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 생체재료를 수집하기 전에 다음 규칙을 준수해야 합니다.

며칠 전에 완하제 복용을 중단하십시오: 오일, 좌약;
예를 들어 철분을 함유하고 있어 대변에 특정 색을 부여하는 약물은 제외하십시오.

오줌

필요한 경우 의사는 검사를 위해 소변을 채취할 수도 있습니다. 높은 정확도는 바이러스 DNA를 추출할 수 있는 모든 생물학적 유체로 작업할 수 있는 가능성을 열어줍니다. PCR 소변 검사를 받으려면 물질을 수집하기 전에 다음 제한 사항을 준수해야 합니다.

시술 최소 1일 전에 성관계를 중단하십시오.
검사 3주 전에 항균 치료를 완료해야 합니다. 약물로 인해 그림이 흐려질 수 있기 때문입니다.
공복에 검사를 받아야 합니다. (액체도 금지됩니다.)
당신은 첫 번째 아침 자료를 취해야 합니다.

PCR 테스트 결과

위에서부터 PCR 분석이 무엇인지 명확하고 이 연구 방법의 명확한 장점이 보입니다. 이 진단 절차의 또 다른 장점은 결과를 쉽게 해독할 수 있다는 것입니다. PCR 분석에 소요되는 시간(과정 자체는 약 5시간이 소요되지만 실험실에서는 1~2일 만에 데이터 생성)을 고려하면 이 진단 방법은 많은 감염을 식별하는 데 가장 좋은 옵션이 됩니다. 결과에 따라 의사는 검사에 대해 다음과 같이 말할 수 있습니다.

음성 – 테스트 재료에 원하는 병원체가 포함되어 있지 않았습니다.
양성 - 병원체의 RNA와 DNA가 발견되었습니다.

때로는 미생물의 정량적 측정이 수행됩니다. 이는 기회감염성 병원체에 의해 발생하는 질병에 필요합니다. 이들 바이러스의 특징은 과도한 양으로만 나타난다는 점이며, 기존 연구를 통해 발견하는 것은 매우 문제가 됩니다. 이 요소는 간염, HIV와 같은 바이러스 감염을 효과적으로 치료하기 위한 치료 전략을 선택하는 데 중요합니다.

12번 감염자

감염에 대한 PCR 진단이 무엇인지, 얼마나 효과적인지 완전히 이해하려면 최대 12개의 병원체를 분리할 수 있다는 것을 알아야 합니다. 텍스트는 실험실 조건에서만 수행됩니다. 연구를 위해 바이러스의 RNA 및 DNA 단편의 양을 여러 번 증가시키는 특수 효소가 사용됩니다. 12개 감염에 대한 PCR 분석을 통해 다음을 검출할 수 있습니다.

결핵균;
거대 세포 바이러스;
C형, G, B, A형 간염;
헤르페스 1, 2종;
엡스타인-바 바이러스(감염성 단핵구증);
예를 들어 클라미디아와 같이 성적으로 전염되는 감염;
리스테리아증;
칸디다 감염;
헬리코박터 파일로리;
보렐리아증, 진드기 매개 뇌염.

C형 간염의 경우

이 진단 방법은 혈액 내 바이러스의 존재를 확인하는 데 도움이 됩니다. 이는 의사에게 그 존재 여부에 대해 이야기할 기회를 제공합니다. C형 간염에 대한 PCR 분석에는 정성적 분석과 정량적 분석의 두 가지 유형이 있습니다. 첫 번째 옵션은 해당 옵션의 존재만을 나타내며 "감지됨"/"감지되지 않음"이라는 문구가 있을 수 있습니다. 이 유형의 테스트는 10-500 IU/ml의 감도를 갖습니다. 이는 체내 병원체 함량이 낮을 경우 분석이 '검출되지 않음'임을 시사합니다.

정량 분석은 더 정확하며 혈액 내 감염 농도를 보여줍니다. 이 지표는 "바이러스 부하"라고 하며 특정 혈액량당 바이러스 RNA의 양으로 측정됩니다. 다른 실험실에서의 디코딩은 다를 수 있습니다. IU/ml 측정 외에도 "복사" 단위가 사용됩니다. 1 IU = 4 복사본이라는 공식을 사용하여 IU당 복사본을 계산할 수 있습니다. 바이러스 존재 여부에 대한 해독 값이 800,000IU/ml(또는 800*103)을 초과하면 이는 병원체 함량이 높다는 것을 나타냅니다.

결핵의 경우

검사는 아침에 해야 합니다. 이는 밤새 형성된 가래 덩어리 전체가 위에서 떠나는 것을 방지하는 데 중요합니다. 결핵에 대한 PCR 분석은 ELISA, Mantoux, 단층촬영만큼 중요합니다. 이 검사는 마이코박테리아의 존재, 소변 상태, 총 면역글로불린, ESR을 확인하고 현재 폐 상태를 결정하는 데 도움이 됩니다. PCR 분석 시 정확한 결과를 얻으려면 다음 규칙을 준수하여 수행해야 합니다.

파종은 3회 실시하지만, 위 내용물의 완전한 흡인은 병원 환경에서만 실시해야 합니다.
마이코박테리아는 진단의 50% 미만에서 위에 존재하는 종괴의 배양으로 검출됩니다. 최적의 조건이 확보된 경우에도 대신 초음파 검사를 권장합니다.
결과가 음성이더라도 ESR, 면역글로불린 또는 기타 지표의 변화로 인해 결핵이 발생할 가능성을 완전히 배제할 수는 없습니다.
PCR 중 물질 배양은 기관지경 검사의 일부로 얻은 경우 병리학적 상태에 덜 민감하며, 이는 어린이의 결핵 의심을 배제합니다.

HIV의 경우

많은 사람들에게 이 진단은 사형 선고로 간주됩니다. 이러한 이유로, 잦은 성관계 후에 사람은 자신의 신체가 보내는 신호에 더 주의를 기울이게 됩니다(때로는 신호를 만들어내는 경우도 있음). 이 질병을 확인하거나 반박하는 가장 신뢰할 수 있는 방법은 HIV에 대한 PCR 테스트입니다. 이 테스트를 사용하여 다음과 같은 가능한 건강 문제를 확인할 수 있습니다.

혈청 음성 기간 동안 HIV 존재에 대한 반박/확인.
HIV-1, HIV-2의 유전자형 결정.
의심스러운 면역블롯 결과가 있는 경우 병리학적 과정에 대한 설명을 명확히 합니다.
수혈 후 감염.
질병의 보균자인 어머니에게서 태어난 어린이의 HIV 상태 결정.
신체의 바이러스 부하를 모니터링하는 데 도움이 됩니다.

HPV의 경우

유두종 바이러스는 모든 사람에게서 발견될 수 있으며 오랫동안 잠복해 있을 수 있습니다. 발달은 면역력 약화, 스트레스 또는 정서적 폭발로 인해 유발됩니다. HPV에 대한 PCR 검사는 혈액 내 바이러스 농도를 결정하는 데 도움이 됩니다. 따라서 정성적 판단보다는 정량적 판단을 내리는 것이 좋습니다. 이 데이터는 악성 감염 가능성을 예측하는 데 도움이 됩니다.

HPV의 존재를 진단하는 방법은 물질로부터 바이러스 DNA를 분리하는 PCR의 주요 특성을 기반으로 합니다. 테스트의 민감도가 높기 때문에 소량의 박테리아도 검출됩니다. 정량적 연구는 의사에게 질병의 위험 정도를 판단하고 미래에 대한 예측을 할 수 있는 기회를 제공합니다. 이 진단은 콘딜로마를 발견한 모든 남성과 여성에게 필수입니다. 정량적 PCR 분석은 HPV 발병의 원인, 즉 일시적인 면역 저하 또는 만성 질환을 파악하는 데 도움이 됩니다.

헤르페스의 경우

미생물학의 이러한 유형의 진단은 헤르페스에 대한 PCR 분석을 높은 정확도로 수행하는 데 도움이 됩니다. 바이러스 DNA 조각의 복사는 원하는 유전자가 물질에 존재하는 경우에만 발생합니다. 이 경우, 검사 결과를 통해 병원체의 유무를 알 수 있습니다. 이는 혈액 내 낮은 농도에서도 검출될 수 있습니다.

PCR 검사의 또 다른 장점은 감염 후 임상 증상이 나타나기 전에 즉시 헤르페스 바이러스 감염을 검출할 수 있다는 것입니다. 헤르페스 유형(1 또는 2)을 확인할 수 있습니다. 검사를 받기 위해 특별한 준비가 필요하지 않지만 의사는 혈액 채취 전에 다음을 거부할 것을 권장합니다.

볶은 것;
심각한;
술;
지방.

임신 중

아이를 임신할 때, 여성의 상태를 등록하기 위해 이 연구를 수행하는 것이 매우 중요합니다. 임신 중 PCR 분석은 다양한 질병의 존재를 확인하는 가장 효과적인 방법 목록에 포함되어 있습니다. 이 검사는 병리를 확인하는 것뿐만 아니라 자궁 내 어린이의 감염 가능성을 결정하는 데도 필요합니다. PCR 진단 덕분에 자궁 내 많은 감염의 진행 정도와 발달 정도를 확인할 수 있게 되었습니다.

PCR 검사 받기

PCR 분석이 어떻게 수행되는지 궁금하신 경우 생체 물질의 유형을 고려하여 각 개별 사례를 고려해야 합니다. 긁기, 도말 또는 혈액 채취에는 고유한 특성이 있습니다. 예를 들면 다음과 같습니다.

혈장은 아침에 기증됩니다.
소변은 아침에만 멸균 용기에 담긴 실험실 조건에서 채취됩니다.
얼룩이나 긁힘은 최소 3일 동안 성관계를 금한 후에만 나타납니다.
월경 중과 월경 2일 후에는 도말을 할 수 없습니다.

PCR 검사를 받을 수 있는 곳

이러한 유형의 연구는 현대적이고 첨단 기술의 진단 방법을 의미합니다. PCR 방법을 사용한 테스트는 전체 결과를 얻기 위해 필요한 모든 장비를 갖춘 실험실에서 수행되어야 합니다. 자격을 갖추고 훈련을 받은 인력도 똑같이 중요한 역할을 합니다. 크고 진지하며 잘 알려진 실험실을 선호하십시오. 이는 결과를 빠르게 얻는 데 도움이 될 뿐만 아니라 신뢰성도 보장합니다.

가격

환자들이 자주 관심을 갖는 또 다른 질문: PCR 테스트 비용은 얼마입니까? 방법의 참신함과 고가의 장비를 구입해야 하기 때문에 테스트 가격이 상대적으로 높습니다. PCR 비용은 검사할 감염 유형에 따라 다릅니다. 대략적인 테스트 가격과 시기는 다음과 같습니다.

STI는 하루 안에 확인되며 가격은 400-500 루블입니다.
헤르페스, HPV, Epstein-Barr 바이러스, 세포막글로바이러스는 24시간 이내에 발견되며 가격은 300-500 루블입니다.
간염 분석은 5일 이내에 수행되며 정성적 옵션의 가격은 500 루블, 정량적 옵션은 2000 루블입니다.
헬리코박터 파이로리균은 24시간 이내에 검출되며 가격은 400루블입니다.
항원, HIV 항체, 가격 - 380 루블부터.
HIV RNA의 정성 분석, 가격 – 3,500 루블부터.
HIV RNA의 정량 분석, 가격 – 11,000 문지름부터.

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주목!기사에 제시된 정보는 정보 제공의 목적으로만 제공됩니다. 기사의 자료는 자기 치료를 권장하지 않습니다. 자격을 갖춘 의사만이 특정 환자의 개별적인 특성에 따라 진단을 내리고 치료 권장 사항을 제시할 수 있습니다.

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주립 교육 기관

고등 전문 교육

"카렐리안 주립 교육학 아카데미"

주제에 대한 교과 과정:

중합효소연쇄반응(PCR) 및 그 응용

완료자: 학생 Koryagina Valeria Aleksandrovna

확인자: Karpikova Natalya Mikhailovna

페트로자보츠크 2013

소개

제1장 문헌고찰

1.5.4 고원 효과

1.5.6 증폭

결론

소개

지난 20년 동안 생물학, 의학 및 농업 과학에 분자 유전학 방법이 널리 도입되었습니다.

1970년대 초반에 이르러 분자생물학은 어느 정도 성숙해진 것처럼 보였다. 이 기간 동안 분자유전학 연구의 주요 대상은 미생물이었습니다. 진핵생물로의 전환은 당시 존재했던 유전자 분석 방법으로는 해결할 수 없었던 완전히 새로운 문제를 연구자에게 제시했습니다. 새로운 실험 도구인 제한 엔도뉴클레아제의 출현으로 분자 유전학 개발의 획기적인 발전이 가능해졌습니다. 이후 몇 년 동안 질적으로 다른 접근법을 기반으로 한 직접 DNA 분석 방법의 수가 급격히 증가하기 시작했습니다.

많은 경우 현대 기술 덕분에 다양한 유기체의 핵 및 핵외 게놈의 미세한 구조적, 기능적 구성을 더 깊은 수준에서 연구할 수 있게 되었습니다. 이는 다양한 질병을 진단하고 치료하는 새로운 방법을 개발하는 데 특히 중요했습니다. 인구, 품종 및 계통의 유전적 다양성을 식별 및 분석하고, 경제적으로 가치 있는 개인을 식별 및 인증하고, 유전자 변형 유기체를 생성하고 기타 문제를 해결하기 위해 인구 생물학 및 육종 분야에서 분자 유전학의 성과를 사용할 가능성이 그다지 중요하지 않았습니다.

각 방법에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 발생하는 모든 문제를 해결할 수 있는 보편적인 방법은 없습니다. 따라서 수행되는 연구를 위한 특정 방법을 선택하는 것은 모든 과학 작업에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다.

제1장 문헌고찰

1.1 중합효소연쇄반응(PCR) 발견의 역사

1983년 K.B. Mullis 등은 핵산 연구 및 응용의 모든 분야에 지대한 영향을 미칠 운명인 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 발표하고 특허를 받았습니다. 분자 생물학과 유전학에 대한 이 방법의 중요성은 너무나 크고 명백하여 7년 후 저자는 노벨 화학상을 수상했습니다.

이 방법을 사용하기 시작할 때 각 가열-냉각 주기 후에 DNA 중합효소를 반응 혼합물에 첨가해야 했습니다. DNA 중합효소는 DNA 나선 가닥을 분리하는 데 필요한 고온에서 비활성화되었기 때문입니다. 반응과정은 상대적으로 비효율적이었고 많은 시간과 효소가 필요했다. 1986년에는 중합효소 연쇄반응 방법이 크게 개선되었습니다. 호열성 박테리아의 DNA 중합효소를 사용하는 것이 제안되었습니다. 이 효소는 열에 안정하고 많은 반응 주기를 견딜 수 있는 것으로 나타났습니다. 이를 사용하면 PCR을 단순화하고 자동화할 수 있습니다. 최초의 열안정성 DNA 중합효소 중 하나가 박테리아에서 분리되었습니다. 테르무스 아쿠아티쿠스그리고 이름이 붙은 타크-중합효소.

뉴클레오티드 서열이 알려진 모든 DNA 세그먼트를 증폭시키고 PCR 완료 시 이를 균질한 형태와 제조량으로 얻을 수 있는 능력으로 인해 PCR은 짧은 DNA 단편의 분자 클로닝을 위한 대체 방법이 됩니다. 이 경우 기존 복제 과정에서 유전공학에서 사용되는 복잡한 방법론적 기법을 사용할 필요가 없다. PCR 방법의 개발은 분자 유전학, 특히 유전 공학의 방법론적 역량을 크게 확장하여 많은 분야의 과학적 잠재력을 근본적으로 변화시키고 강화했습니다.

1.2 중합효소연쇄반응(PCR)의 종류

· 중첩 PCR- 반응 부산물의 양을 줄이기 위해 사용됩니다. 두 쌍의 프라이머가 사용되며 두 번의 순차적 반응이 수행됩니다. 두 번째 프라이머 쌍은 첫 번째 반응 생성물 내의 DNA 영역을 증폭시킵니다.

· 역 PCR- 원하는 서열 내의 작은 영역만 알려진 경우에 사용됩니다. 이 방법은 DNA가 게놈에 삽입된 후 인접한 서열을 결정할 때 특히 유용합니다. 역 PCR을 수행하기 위해 제한 효소를 사용하여 일련의 DNA 절단이 수행됩니다.<#"justify">중합효소 연쇄반응 프라이머

· 그룹 특정 PCR- 친인척 PCR<#"center">1.3 중합효소연쇄반응

1980년대 중반에 발견된 중합효소연쇄반응(PCR)은 몇 시간 내에 원본 샘플의 복사본 수를 수백만 배로 늘릴 수 있습니다. 각 반응 주기 동안 원래 분자로부터 두 개의 복사본이 형성됩니다. 합성된 각 DNA 사본은 다음 주기에서 새로운 DNA 사본을 합성하기 위한 주형 역할을 할 수 있습니다. 따라서 주기가 반복적으로 반복되면 기하학적 수열의 복사본 수가 증가합니다. 계산에 따르면 30주기를 거치더라도 원래 분자의 복사본 수는 10억 개가 넘습니다. 각 주기 동안 모든 앰플리콘이 복제되지 않는다는 점을 고려하더라도, 그럼에도 불구하고 총 복사본 수는 상당히 큰 수치입니다.

각 중합효소 연쇄 반응(PCR) 주기는 다음 단계로 구성됩니다.

· 변성 - 온도가 증가하면 이중 가닥 DNA 분자가 풀리고 두 개의 단일 가닥 DNA 분자로 분리됩니다.

· 어닐링 - 온도를 낮추면 프라이머가 DNA 분자의 상보적인 영역에 결합할 수 있습니다.

· 신장 - 효소 DNA 중합효소가 상보적인 가닥을 완성합니다.

선택된 단편을 증폭시키기 위해 특정 DNA 영역 옆에 있는 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머(프라이머)가 사용됩니다. 프라이머 지향 3 - 서로를 향해 그리고 증폭이 필요한 서열을 향해 끝납니다. DNA 중합효소는 프라이머를 시작으로 상호 보완적인 DNA 사슬을 합성(완성)합니다. DNA 합성 중에 프라이머는 새로 합성된 DNA 분자 사슬에 물리적으로 통합됩니다. 프라이머 중 하나를 사용하여 형성된 DNA 분자의 각 가닥은 다른 프라이머를 사용하여 상보적인 DNA 가닥의 합성을 위한 주형 역할을 할 수 있습니다.

1.4 중합효소연쇄반응(PCR) 수행

중합효소 연쇄반응은 사용된 열 순환기(증폭기)와 크기가 호환되는 특수 얇은 벽의 폴리프로필렌 튜브에서 수행됩니다. 이 장치는 중합효소 연쇄반응(PCR) 단계의 온도 및 시간 특성을 제어하는 장치입니다.

1.5 중합효소연쇄반응법의 원리

중합효소연쇄반응(PCR)은 몇 시간 내에 특정 DNA 서열을 수십억 번 분리하고 증식시키는 데 사용할 수 있는 시험관 내 DNA 증폭 방법입니다. 엄격하게 정의된 게놈 영역의 엄청난 수의 복사본을 얻을 수 있는 능력은 기존 DNA 샘플에 대한 연구를 크게 단순화합니다.

중합효소 연쇄반응을 수행하려면 다음과 같은 여러 조건이 충족되어야 합니다.

1.5.1 반응 혼합물에 여러 성분의 존재

반응(PCR) 혼합물의 주요 구성 요소는 Tris-HCl, KCl, MgCl입니다. 2, 뉴클레오티드 삼인산염(ATP, GTP, CTP, TTP), 프라이머(올리고뉴클레오티드), 샘플 DNA 준비, 열안정성 DNA 중합효소의 혼합물. 반응 혼합물의 각 구성 요소는 중합효소연쇄반응(PCR)에 직접적으로 관여하며, 시약의 농도는 증폭 과정에 직접적인 영향을 미칩니다.

· Tris-HCl - 반응 혼합물의 pH를 결정하고 완충 용량을 생성합니다. DNA 중합효소의 활성은 환경의 pH에 따라 달라지므로 pH 값은 중합효소 연쇄반응 과정에 직접적인 영향을 미칩니다. 일반적으로 pH 값은 8~9.5입니다. 온도가 증가함에 따라 Tril-HCl 완충액의 pH가 떨어지기 때문에 높은 pH 값이 사용됩니다.

· KCl - 최대 50mM의 염화칼륨 농도는 변성 과정에 영향을 미치고 50mM 이상의 농도에서는 DNA 중합효소를 억제합니다.

· MgCl 2- DNA 중합효소는 Mg이기 때문에 2+- 의존성 효소, 마그네슘 이온의 농도가 효소의 활성에 영향을 미칩니다(Mg 2+NTP와 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 중합효소의 기질입니다. 농도가 높으면 비특이적 증폭이 증가하고, 농도가 낮으면 반응이 억제됩니다(다양한 중합효소에 대한). 최적 범위는 0.5 - 5mM입니다. 또한 마그네슘 염의 농도는 변성 및 어닐링 과정 과정에 영향을 미칩니다. 즉 Mg 농도가 증가합니다. 2+DNA의 녹는점(즉, 이중 가닥 DNA 가닥의 50%가 단일 가닥으로 분리되는 온도)이 증가합니다.

· NTP - 뉴클레오티드 삼인산염은 핵산의 직접적인 단량체입니다. 사슬 종결을 방지하려면 4개의 뉴클레오티드 삼인산염을 모두 동일한 비율로 사용하는 것이 좋습니다. 반응 혼합물에서 이러한 구성 요소의 농도가 낮으면 상보적인 DNA 사슬을 구성할 때 오류가 발생할 가능성이 높아집니다.

· 프라이머 - 가장 최적의 방법은 녹는점 차이가 2~4 이하인 프라이머를 사용하는 것입니다. 영형 C. 때로는 4도에서 장기간 보관하는 동안 영형 C 또는 다수의 동결 및 해동 후에 프라이머는 2차 구조인 이량체를 형성하여 PCR 효율을 감소시킵니다. 이 문제를 해결하려면 수조(T=95)에서 배양해야 합니다. 영형 C) 3분 동안 0o까지 급속 냉각 와 함께.

· DNA 준비 - DNA 준비(매트릭스)의 양과 품질은 중합효소 연쇄 반응의 과정과 매개변수에 직접적인 영향을 미칩니다. 과도한 양의 DNA 샘플은 중합효소연쇄반응(PCR)을 억제합니다. DNA 준비에서 발견되는 다양한 물질의 불순물(아세트산나트륨, 염화나트륨, 이소프로판올, 에탄올, 헤파린, 페놀, 요소, 헤모글로빈 등)도 중합효소 연쇄반응(PCR)의 효과를 감소시킬 수 있습니다.

· DNA 폴리머라제 - 소량의 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우 단편의 크기에 정비례하여 최종 생성물의 합성 감소가 관찰됩니다. 2~4배의 중합효소 과잉은 확산 스펙트럼의 출현으로 이어지며, 4~16배의 저분자량 비특이적 스펙트럼이 나타납니다. 사용되는 농도 범위는 PCR 혼합물 25μl당 활성 0.5~1.5단위입니다.

PCR 혼합물의 주요 구성 요소 외에도 PCR의 정성 및 정량 지표를 향상시키는 여러 가지 추가 물질이 사용됩니다. 아세트아미드(5%) - 주요 구성 요소의 용해도를 증가시킵니다. 베타인(나트륨염) - DNA 중합효소의 안정화, DNA의 녹는점을 낮추는 것, 녹는점을 균등하게 하는 것; 소 알부민(10-100μg/ml) - DNA 중합효소의 안정화; 디메틸 설폭사이드(1-10%) - 주요 성분의 용해도를 증가시킵니다. 포름아미드(2-10%) - 어닐링의 특이성을 증가시킵니다. 글리세롤(15-20%) - 효소의 열 안정성을 증가시키고 DNA 샘플의 변성 온도를 낮춥니다. 황산암모늄 - 변성 및 어닐링 온도를 낮춥니다.

1.5.2 순환 및 온도 모드

중합효소연쇄반응(PCR) 프로그램의 일반적인 모습은 다음과 같습니다.

단계. 1차 DNA 준비의 장기간 일차 변성.

단계. DNA 준비의 신속한 변성. 프라이머의 어닐링. 신장.30 - 45주기.

단계. 긴 신장. 1차 반응 혼합물을 냉각합니다.

변성, 어닐링, 신장 등 단계의 각 요소는 개별 온도 및 시간 특성을 갖습니다. 각 요소의 온도 및 시간 매개변수는 증폭 산물의 정성적 및 정량적 지표에 따라 경험적으로 선택됩니다.

변성. 중합효소 연쇄 반응의 이 요소 동안 이중 가닥 DNA 분자는 두 개의 단일 가닥 DNA 분자로 분리됩니다. 변성 온도 매개변수는 90 - 95 범위에 있습니다. 영형 C. 단, 구아닌과 시토신의 함량이 높은 DNA 시료의 경우에는 온도를 98℃까지 올려야 한다. 영형 C. 변성 온도는 DNA 가닥을 완전히 변성시키고 "플래시 냉각"이나 급속한 어닐링을 방지하기에 충분해야 합니다. 그러나 열안정성 DNA 중합효소는 고온에서 안정성이 떨어집니다. 따라서 프라이머/샘플(DNA 준비) 비율에 대한 최적의 변성 온도 매개변수를 선택하는 것은 증폭을 수행할 때 중요한 조건입니다. 1단계 변성온도가 95도 이상인 경우 영형 C, 초기 변성 후에 반응 혼합물에 DNA 중합효소를 첨가하는 것이 좋습니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 중 이 단계 요소의 지속 시간은 DNA를 완전히 변성시키기에 충분해야 하지만 동시에 주어진 온도에서 DNA 중합효소의 활성에 큰 영향을 미치지 않아야 합니다.

가열 냉각. 어닐링 온도(T ㅏ )은 중합효소 연쇄반응의 가장 중요한 매개변수 중 하나입니다. 각 특정 프라이머의 어닐링 온도는 개별적으로 선택됩니다. 이는 프라이머의 길이와 뉴클레오티드 구성에 따라 다릅니다. 보통 2~4정도 낮아요 영형 융점 값(T 중 ) 입문서. 시스템 어닐링 온도가 최적 온도보다 낮으면 비특이적 증폭 단편의 수가 증가하고, 반대로 온도가 높을수록 증폭된 산물의 수가 감소합니다. 이 경우 특정 앰플리콘의 농도는 중합효소 연쇄반응(PCR)이 억제될 때까지 급격하게 감소할 수 있습니다. 어닐링 시간을 늘리면 비특이적 앰플리콘 수도 증가합니다.

연장. 일반적으로 각 유형의 열안정성 DNA 중합효소는 활성에 최적인 개별 온도를 가지고 있습니다. 효소에 의한 상보적 DNA 가닥의 합성 속도도 각 중합효소에 따라 다르므로(평균적으로 초당 30~60개 뉴클레오티드 또는 분당 1~2,000개 염기), 연장 시간은 유형에 따라 선택됩니다. DNA 중합효소의 길이와 증폭된 영역의 길이.

1.5.3 프라이머 선택의 기본 원칙

PCR 테스트 시스템을 만들 때 주요 작업 중 하나는 다음과 같은 여러 기준을 충족해야 하는 올바른 프라이머를 선택하는 것입니다.

프라이머는 구체적이어야 합니다. 3에 특별한 관심이 집중됩니다. - 프라이머의 끝. 왜냐하면 Taq 중합효소가 상보적인 DNA 가닥을 완성하기 시작하기 때문입니다. 특이성이 충분하지 않으면 반응 혼합물이 포함된 시험관에서 바람직하지 않은 과정, 즉 비특이적 DNA(짧거나 긴 단편)의 합성이 발생할 가능성이 높습니다. 이는 무겁거나 가벼운 추가 밴드의 형태로 전기영동에서 볼 수 있습니다. 이는 특정 증폭 산물과 합성된 외래 DNA를 혼동하기 쉽기 때문에 반응 결과 평가를 방해합니다. 비특이적 DNA 합성을 위해 일부 프라이머와 dNTP가 소모되어 민감도가 크게 저하됩니다.

프라이머는 이합체나 루프를 형성해서는 안 됩니다. 프라이머가 자체적으로 또는 서로 어닐링된 결과로 안정적인 이중 가닥이 형성되어서는 안 됩니다.

1.5.4 고원 효과

기하학적 진행으로 특정 증폭 산물이 축적되는 과정은 제한된 시간 동안만 지속되며 그 이후에는 그 효과가 심각하게 떨어진다는 점에 유의해야 합니다. 이는 소위 고원 효과 때문입니다.

기간 효과 고원 마지막 증폭 주기에서 PCR 산물이 축적되는 과정을 설명하는 데 사용됩니다.

증폭반응의 조건과 주기수에 따라 효과가 나타나는 시점 고원 기질(dNTP 및 프라이머)의 활용도, 반응물(dNTP 및 효소)의 안정성, 피로인산염 및 DNA 이중체를 포함한 억제제의 양, 비특이적 생성물 또는 프라이머 이합체에 의한 반응물 경쟁, 특정 생성물의 농도에 의해 영향을 받습니다. 및 고농도의 증폭 산물에서 불완전한 변성이 있습니다.

표적 DNA의 초기 농도가 낮을수록 반응이 실패할 위험이 높아집니다. 이 지점은 분석할 특정 증폭 산물이 충분하기 전에 발생할 수 있습니다. 잘 최적화된 테스트 시스템만이 이를 피할 수 있습니다.

1.5.5 생물학적 시료 준비

DNA를 분리하기 위해 수행되는 작업에 따라 다양한 기술이 사용됩니다. 이들의 본질은 생물학적 제제로부터 DNA를 추출(추출)하고 외부 불순물을 제거 또는 중화하여 PCR에 적합한 순도의 DNA 제제를 얻는 데 있습니다.

Marmur가 설명한 순수한 DNA 제제를 얻는 방법은 표준으로 간주되며 이미 고전적이 되었습니다. 이는 효소적 단백질 분해에 이어 탈단백화 및 알코올을 이용한 DNA 재침전을 포함합니다. 이 방법을 사용하면 순수한 DNA 준비물을 얻을 수 있습니다. 그러나 이는 상당히 노동 집약적이며 페놀 및 클로로포름과 같은 공격적이고 강한 냄새가 나는 물질을 다루는 작업이 포함됩니다.

현재 널리 사용되는 방법 중 하나는 Boom et al.이 제안한 DNA 추출 방법입니다. 이 방법은 강력한 카오트로픽제인 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN)를 사용하여 세포 용해 및 이후 담체(유리 구슬, 규조토, 유리 우유 등)에 DNA를 흡착하는 데 기반을 두고 있습니다. 세척 후 DNA는 샘플에 남아 캐리어에 흡착되며, 용출 완충액을 사용하여 쉽게 제거됩니다. 이 방법은 편리하고 기술적으로 진보되었으며 증폭용 샘플을 준비하는 데 적합합니다. 그러나 캐리어에 대한 비가역적인 흡착과 수많은 세척으로 인해 DNA 손실이 발생할 수 있습니다. 이는 샘플에서 소량의 DNA로 작업할 때 특히 중요합니다. 또한, 미량의 GuSCN이라도 PCR을 억제할 수 있습니다. 따라서 이 방법을 사용할 때 흡착제를 올바르게 선택하고 기술적 뉘앙스를 신중하게 준수하는 것이 매우 중요합니다.

샘플 준비 방법의 또 다른 그룹은 유리와 달리 DNA를 흡수하지 않고 오히려 반응을 방해하는 불순물을 흡수하는 Chilex 유형 이온 교환기의 사용을 기반으로 합니다. 일반적으로 이 기술에는 시료를 끓이는 단계와 이온 교환기에서 불순물을 흡착하는 두 단계가 포함됩니다. 이 방법은 실행이 간편하기 때문에 매우 매력적입니다. 대부분의 경우 임상 자료 작업에 적합합니다. 불행하게도 때때로 이온 교환기를 사용하여 제거할 수 없는 불순물이 포함된 샘플이 있습니다. 또한 일부 미생물은 단순히 끓여도 파괴되지 않습니다. 이러한 경우에는 샘플 처리의 추가 단계를 도입할 필요가 있습니다.

따라서, 의도된 분석의 목적을 이해하고 시료 준비 방법을 선택해야 합니다.

1.5.6 증폭

증폭 반응을 수행하려면 반응 혼합물을 준비하고 분석된 DNA 샘플을 여기에 추가해야 합니다. 프라이머 어닐링의 일부 기능을 고려하는 것이 중요합니다. 사실, 분석된 생물학적 샘플에는 일반적으로 반응에 사용된 프라이머가 부분적이며 경우에 따라 중요한 상동성을 갖는 다양한 DNA 분자가 포함되어 있습니다. 또한, 프라이머는 서로 어닐링하여 프라이머 이량체를 형성할 수 있습니다. 둘 다 부산물(비특이적) 반응 생성물의 합성을 위한 프라이머의 상당한 소비로 이어지며 결과적으로 시스템의 민감도가 크게 감소합니다. 이로 인해 전기영동 중에 반응 결과를 읽는 것이 어렵거나 불가능해집니다.

1.6 표준 PCR 반응 혼합물의 구성

x PCR 완충액(100mM Tris-HCl 용액, pH 9.0, 500mM KCl 용액, 25mM MgCl2 용액 ) …….2.5μl

물 (MilliQ)..........................................................18.8 µl

뉴클레오티드 삼인산염(dNTP)의 혼합물

각각의 mM 용액...........................................................0.5 µl

프라이머 1 (10mM 용액) ..............................................1 µl

프라이머 2 (10mM 용액) ..............................................................1 µl

DNA 폴리머라제 (5 단위/μl) .............................. 0.2 μl

DNA 샘플(20ng/μl) ..............1μl

1.7 반응 결과 평가

PCR 결과를 올바르게 평가하려면 이 방법이 정량적이지 않다는 점을 이해하는 것이 중요합니다. 이론적으로 단일 표적 DNA 분자의 증폭 산물은 30~35주기 후에 전기영동을 사용하여 검출할 수 있습니다. 그러나 실제로 이는 이상에 가까운 조건에서 반응이 일어나는 경우에만 수행되며, 이는 실제 생활에서는 자주 발생하지 않습니다. DNA 준비물의 순도는 증폭 효율에 특히 큰 영향을 미칩니다. 어떤 경우에는 제거하기가 극도로 어려울 수 있는 특정 억제제의 반응 혼합물에 존재합니다. 때로는 존재로 인해 수만 개의 표적 DNA 분자조차 증폭될 수 없습니다. 따라서 표적 DNA의 초기 양과 증폭 산물의 최종 양 사이에는 직접적인 관계가 없는 경우가 많습니다.

2장: 중합효소 연쇄반응의 응용

PCR은 테스트 및 과학 실험을 위해 많은 분야에서 사용됩니다.

법의학

PCR은 소위 "유전자 지문"을 비교하는 데 사용됩니다. 범죄 현장에서 혈액, 타액, 정액, 머리카락 등 유전 물질 샘플이 필요합니다. 피의자의 유전물질과 비교됩니다. 아주 적은 양의 DNA, 이론적으로는 하나의 사본이면 충분합니다. DNA는 조각으로 분해된 후 PCR을 사용하여 증폭됩니다. 단편은 DNA 전기영동을 사용하여 분리됩니다. DNA 밴드 배열의 결과 패턴을 유전적 지문이라고 합니다.

친자관계 확립

PCR로 증폭된 DNA 단편의 전기영동 결과. 아버지. 어린이. 어머니. 아이는 양쪽 부모의 유전적 각인의 일부 특징을 물려받아 새롭고 독특한 각인을 갖게 되었습니다.

유전적 지문은 독특하지만 여러 개의 지문을 만들어도 가족 관계를 확립할 수 있습니다. 동일한 방법을 약간 수정하여 적용하여 유기체 간의 진화 관련성을 확립할 수 있습니다.

의료 진단

PCR을 사용하면 유전성 및 바이러스성 질병의 진단 속도를 크게 높이고 촉진할 수 있습니다. 관심 유전자는 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭된 후 서열 분석을 통해 돌연변이를 식별합니다. 바이러스 감염은 감염 직후, 증상이 나타나기 몇 주 또는 몇 달 전에 발견될 수 있습니다.

맞춤형 의약품

때때로 약물은 일부 환자에게 독성이 있거나 알레르기를 일으키는 것으로 판명됩니다. 그 이유는 부분적으로 약물과 그 파생물의 감수성과 대사에 있어서 개인차 때문입니다. 이러한 차이는 유전적 수준에서 결정됩니다. 예를 들어, 한 환자에서는 특정 시토크롬이 더 활동적일 수 있고 다른 환자에서는 덜 활동적일 수 있습니다. 해당 환자가 어떤 유형의 시토크롬을 가지고 있는지 확인하려면 약을 사용하기 전에 PCR 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이 분석을 예비 유전형 분석이라고 합니다.

유전자 복제

유전자 복제는 유전자를 분리하고 유전 공학 조작의 결과로 특정 유전자의 생성물을 대량으로 얻는 과정입니다. PCR은 유전자를 증폭시키는 데 사용되며, 이 유전자는 벡터(외래 유전자를 성장에 편리한 동일한 유기체 또는 다른 유기체로 전달하는 DNA 조각)에 삽입됩니다. 예를 들어, 플라스미드나 바이러스 DNA가 벡터로 사용됩니다. 외부 유기체에 유전자를 삽입하는 것은 일반적으로 해당 유전자의 산물인 RNA 또는 가장 흔히 단백질을 생산하는 데 사용됩니다. 이러한 방식으로 농업, 의학 등에 사용하기 위해 많은 단백질이 산업적 양으로 얻어집니다.

DNA 시퀀싱

형광 표지 또는 방사성 동위원소로 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 사용하는 서열 분석 방법에서 PCR은 필수적인 부분입니다. 왜냐하면 중합 중에 형광 또는 방사성 표지로 표지된 뉴클레오티드의 유도체가 DNA 사슬에 삽입되기 때문입니다. 이렇게 하면 반응이 중지되어 합성된 사슬이 젤에서 분리된 후 특정 뉴클레오티드의 위치를 결정할 수 있습니다.

돌연변이 유발

현재 PCR은 돌연변이 유발을 수행하는 주요 방법이 되었습니다. PCR을 사용하면 돌연변이 유발 과정을 단순화하고 속도를 높일 수 있을 뿐만 아니라 신뢰도와 재현성을 높일 수 있습니다.

PCR 방법을 사용하면 본 연구 40년 전에 인간 자궁경부 종양의 파라핀 포매 생검 절편에서 인간 유두종바이러스 서열의 존재를 분석할 수 있었습니다. 더욱이, PCR을 사용하면 7000년 된 인간 뇌의 화석 잔해에서 미토콘드리아 DNA 조각을 증폭하고 복제하는 것이 가능했습니다!

개별 인간 정자의 용해물을 사용하여 서로 다른 비상동 염색체에 위치한 두 유전자좌를 동시에 분석하는 능력이 입증되었습니다. 이 접근법은 정밀한 유전자 분석과 염색체 재조합, DNA 다형성 등에 대한 연구를 위한 독특한 기회를 제공합니다. 반수체 세포의 HLA 유형 지정을 통해 친자 관계를 확인하거나 식별할 수 있기 때문에 개별 정자를 분석하는 방법은 법의학에서 즉시 실용적인 적용을 찾았습니다. 범죄자(HLA 복합체는 인간의 주요 조직적합성 복합체의 유전자 집합입니다. HLA 복합체의 유전자좌는 고등 척추동물에서 알려진 모든 것 중 가장 다형성이 높습니다. 종 내에서 각 유전자좌에는 비정상적으로 많은 수의 서로 다른 대립유전자가 있습니다. - 동일한 유전자의 대체 형태).

PCR을 사용하면 연구 대상 세포 게놈의 미리 결정된 영역에 외부 유전자 구조가 올바르게 통합되었는지 확인할 수 있습니다. 전체 세포 DNA는 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 어닐링되는데, 그 중 하나는 삽입 지점 근처의 숙주 DNA 부분에 상보적이고 다른 하나는 역평행 DNA 가닥의 통합 단편 서열에 상보적입니다. 중합효소연쇄반응은 의도한 삽입 부위의 염색체 DNA 구조가 변하지 않은 경우 크기를 알 수 없는 단일 가닥 DNA 단편이 형성되고, 계획된 삽입의 경우 이중 가닥 DNA 단편이 형성됩니다. 두 프라이머의 어닐링 부위 사이의 거리에 의해 결정되는 알려진 크기. 또한 첫 번째 경우 분석된 게놈 영역의 증폭 정도는 주기 수에 선형적으로 의존하고 두 번째 경우에는 지수적입니다. PCR 중에 미리 결정된 크기의 증폭된 단편이 기하급수적으로 축적되면 DNA 준비의 전기영동 분별 후 이를 시각적으로 관찰할 수 있으며 염색체 DNA의 특정 영역에 외부 서열이 삽입되는 것에 대해 명확한 결론을 내릴 수 있습니다.

결론

PCR법은 현재 다양한 감염성 질환을 진단하는 방법으로 가장 널리 사용되고 있다. PCR을 사용하면 분석을 위해 채취한 샘플에 병원체의 DNA 분자가 몇 개만 포함되어 있어도 감염의 원인을 확인할 수 있습니다. PCR은 HIV 감염, 바이러스 간염 등의 조기 진단에 널리 사용됩니다. 오늘날 PCR을 사용하여 검출할 수 없는 감염원은 거의 없습니다.

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