☰

Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Методы гельминтологических исследований делятся на прямые и косвенные

Исходный уровень знаний и навыков.

Учащийся должен знать:

1. Представителей трема­тод описторха, парагонима, фасциолу, дикроцелия.

2. Жизненные циклы, пу­ти заражения трема­тод, клиническую картину болезни, сроки хранения фекалий

Учащийся должен уметь:

1. Определить яйца трематод по ри­сункам, таблицам.

2. Формировать меры про­филактики.

3. Приготовить нативный мазок, большой мазок, мазок по Като, оценить свою работу, работать с микроскопом.

4. Опре­делять яйца трематод в препаратах, соблю­дать правила охраны труда, соблюдать правила сан.-эпид. режима.

Структура занятия:

Теоретическая часть:

Ø Микролекция.

Практическая часть:

Ø Приготовление нативного мазка, большого мазка, мазка по Като, оценка работы, микроскопия

Микролекция.

Сбор и доставка материала

Окончательный диагноз гельминтозов может быть установлен только с учетом результатов лабораторных исследований. Основным методом лабораторной диагностики гельминтозов является обнаружение яиц или личинок гельминтов в фекалиях, моче, крови и других биологических жидкостях при микроскопическом исследовании. Материалами для исследований служат испражнения, содержимое двенадцатиперстной кишки, кровь, мокрота, биопсированные ткани и другие материалы.

Сбор материала для исследования производят в чистую стеклянную или пластиковую посуду, которая сопровождается направлением с указанием ФИО обследуемого. При массовом обследовании допускается сбор фекалий в стаканчики из парафинированной бумаги, целлофановые пакеты.

Испражнения для анализов должны доставляться в лабораторию непозднее одних суток, а при подозрении на стронгилоидоз - немедленно после их выделения. При нарушении этого правила постановка диагноза в связи с разрушением яиц или личинок нередко становится трудной или невозможной.

Для выявления яиц и личинок некоторых видов гельминтов используют специальные методы: метод Бормана, перианальный соскоб, метод мазков-отпечатков с помощью липкой ленты, культивирование личинок на фильтровальной бумаге (метод Харада и Мори) и др.

Практическая часть:

Наиболее распространенным методом исследования фекалий на наличие в них яиц гельминтов являются методы нативного мазка, толстого мазка под целлофаном и большого мазка.

При изучении яиц гельминтов под микроскопом целесообразно сопоставлять видимое изображение с его характеристикой в определителе яиц гельминтов.

Метод нативного мазка

Оборудование:

предметные стекла;

широкая кювета;

пластиковые палочки;

карандаш;

50 %-ный водный раствор глицерина (смешивают равные части глицерина и дистиллированной воды);

сосуд с 0,5% -ным раствором полидеза;

микроскоп.

Ход работы

1. Разложить предметные стекла в кювете, пронумеровать предметные стекла.

2. Нанести пипеткой по 2 капли 50 %-ного водного раствора глицерина на расстоянии 4 см одна от другой на предметные стекла.

3. Взять палочкой кусочек фекалий, размером со спичечную головку (30-50 мг), внести его в каплю глицерина и растереть до равномерной суспензии.

4. На каждом стекле готовят по два нативных мазка, которые не должны сливаться между собой и не доходить до краев, чтобы не испачкать пальцы лаборанта. Для каждой пробы используют новые палочки.

5. Препараты, не накрывая покровными стеклами, исследовать под микроскопом (объектив 8х, окуляр 10-15х).

6. По окончании исследования погрузить препараты в сосуд с 0,5% -ным раствором полидеза.

Метод толстого мазка под целлофаном.

Метод предложен К. Като, М. Миуром в 1954 г. Мазок представляет собой слой неразбавленных фекалий на предметном стекле, спрессованный под листком тонкого гигроскопического целлофана, пропитанного глицерином.

Рис. Приготовление толстого мазка под целлофаном:

а - нативный мазок; б - придавливание резиновой пробкой комочка фекалий, покрытых целлофаном; в - толстый мазок под целлофаном (по Ю.А. Березанцеву и Е.Г.Автушенко, 1976)

Оборудование:

широкая кювета;

полоски целлофана 22x30 мм, обработанные смесью Като в течение 24 ч;

смесь Като (3 % -ный раствор малахитового зеленого -6 мл, 6 % -ный раствор фенола - 500 мл, глицерин - 500 мл, 3,5 мл смеси хватает на 100 полосок);

резиновые пробки крупные;

пинцет анатомический;

пластиковые палочки;

карандаш;

микроскоп.

Ход работы

1. Разложить в кювете предметные стекла, пронумеровать предметные стекла.

2. Набрать палочкой фекалии размером с полгорошины (50-60 мг) и поместить на предметное стекло в центр.

3. Достать из банки пинцетом целлофановую полоску, обработанную по Като, и наложить на пробу кала на предметном стекле.

4. Придавить целлофан резиновой пробкой, чтобы кал распределился равномерно, не вытекая за края полоски.

5. Оставить препарат до просветления на 60 мин и затем исследовать под микроскопом (объектив 8-40х, окуляр 10х).

6. По окончании исследования препарат опустить в сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза.

7. Убрать рабочее место, вымыть руки.

Метод большого мазка.

Метод был предложен Ю.А. Березанцевым и Е.Г. Автушенко в 1973 г. Суть метода основывается на применении бинокулярного микроскопа и нативного мазка на стекле 6x9 см, позволяющего одномоментно исследовать до 200-300 мг кала.

Оборудование:

предметные стекла 6x9 см и 7x10 см;

пластиковые палочки;

50 %-ный раствор глицерина (глицерин и дистиллированная вода в равных частях);

сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза;

микроскоп;

эмалированная кювета;

карандаш.

Ход работы

1. Разложить предметные стекла 7x10 см в кювете, пронумеровать предметные стекла.

2. Затем на каждое предметное стекло положить второе предметное стекло 6x9 см.

3. Нанести пипеткой на предметное стекло размером 6x9 см 15-20 капель 50 % -ного раствора глицерина.

4. Взять палочкой из разных мест кусочки кала величиной со среднюю горошину (200-300 мг) и опустить его в раствор 50 %-ного глицерина на предметном стекле.

5. Растереть палочкой кусочек кала в глицерине до равномерной суспензии, чтобы занимаемая им площадь составляла около 33-34 см 2 . Мазок не покрывать покровными стеклами.

6. Взять большое покровное стекло 7x10 см за края вместе с находящимся на нем большим мазком (чтобы не запачкать пальцы).

7. Исследовать большой мазок при увеличении 34х (объектив 2х, окуляр 17х) и 50х (объектив 4х, окуляр 12,5х). В сомнительных случаях исследования проводят на большом увеличении.

8. По окончании исследования препарат опустить в сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза.

9. Убрать рабочее место, вымыть руки.

При таком методе исследования определяются крупные яйца гельминтов (аскариды, власоглава, анкилостомид, острицы, лентеца широкого, тениид, фасциолы). Они выглядят несколько иначе, в связи с чем необходим некоторый опыт, чтобы их быстро обнаружить. Большие мазки можно применять для исследования на яйца шистосом и личинок угрицы кишечной. Большой мазок содержит в 6-10 раз больше исследуемого материала, чем нативный мазок. Во столько же раз выше его эффективность.


Похожая информация.


Чаще всего заражение гельминтами происходит через зараженную пищу, воду, а также через немытые руки.

Прямые и косвенные методы диагностики гельминтозов

На сегодняшний день разработано множество методов диагностики гельминтозов, однако всех их можно разделить на две большие группы: прямые и косвенные. К прямым методам диагностики относятся те исследования, которые позволяют непосредственно выявить гельминты, их фрагменты, личинки или яйца. Косвенные методы диагностики гельминтозов основываются на выявлении вторичных изменений, характерных для той или иной разновидности гельминтоза.

Самыми популярными прямыми методами диагностики гельминтозов являются макро- и микрогельминтоскопические методы исследований.

Макрогельминтоскопические методы исследования

Вопросы читателей

18 October 2013, 17:25 Добрый день. Уже около почти год ощущаю зуд вокруг анального отверстия. Никаких болевых ощущений. Подскажите к кому обратится и что это может быть? Спасибо

Задать вопрос
Микрогельминтоскопические методы исследования
Иммунологические методы исследования

Диагностики гельминтозов основаны на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к тем или иным гельминтам. Для иммунологического исследования применяется метод непрямой гемагглютинации, иммуноферментного анализа, иммуноэлектрофореза, иммуноабсорбции и другие серологические методы исследований крови.

Иммунологические методы исследования применяются для диагностики альвеококкоза, эхинококкоза, цистицеркоза, аскаридоза, шистосомоза и других гельминтозов.

Анализ желчи и дуоденального содержимого
Биопсия
Электропунктурная диагностика

Электропунктурная диагностика основана на анализе сопротивления кожи при раздражении ее слабым электрическим током. Электропунктурная диагностика при подозрении на гельминтоз может проводиться двумя способами: по методу Фолля или с помощью резонансного тестирования.

Инструментальные методы исследования

При гельминтозах также проводится ультразвуковое исследование, ФЭДГС, и компьютерная диагностика. Эти методы позволяют определить степень вреда, нанесенного гельминтами, а также определить состояние отдельных органов.

При обнаружении яиц гельминтов на различных объектах окру­жающей среды (почва, вода, овощи и др.) всегда необходимо опре­делять их жизнеспособность по внешнему виду, окрашиванием ви­тальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е.

Скармливанием лаборатор­ным животным.

Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при ма­лом, затем при большом увеличении. У деформированных и мерт­вых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плаз­ма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдви­нуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, ко­торые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней час­ти тела, по мере их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли - так называемые нитки жемчуга.

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власо­главов, остриц следует вызывать активные движения личинок лег­ким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жиз­неспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отсло­ившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце ли­чинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнару­живается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зер­нистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются ва­куоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина 0,5 г, натрия бикарбоната 0,09 г, дистиллированной воды 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36-38 “С на 4 ч. При этом живые зародыши осво­бождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также раство­ряются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6-8 ч в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1 % раствор натрия сульфида, или 20 % раствор натрия гипохлорида, или же в 1 % раствор хлорной воды при 36-38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 сут. Незрелые и мертвые он­косферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10 мин - 2 ч. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1 % раствора натрия хлорида, 0,5 % раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36- 38 °С.

Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при сла­бом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводко­вые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с лу­ночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроско­пом с нагревательным столиком при температуре 38-39 °С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные ско­лексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, уд­линяя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5-1 % водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежиз­неспособные сколексы при этом не вывертываются.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на расте­ниях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки тремато­ды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по распо­ложению крючьев на зародыше.

В живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятнико­образные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в сто­роны от средней пары.

Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться сначала от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.

В живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев распо­ложены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сбли­жены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом менее 45°.

Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздви­гает крючья. В погибшем зародыше движение крючьев прекраща­ется, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты под пря­мым, тупым или острым углом.

Иногда наблюдаются сморщивание зародыша, образование зер­нистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5-10 до 38-40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изу­чать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3 % раствор формалина, приготовленный на изотоническом раство­ре натрия хлорида при температуре 24-30 °С, яйца власоглавов в 3 % раствор соляной кислоты при температуре 30-35 °С, яйца ост­риц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37 “С. Чашки Петри следует открывать 1-3 раза в неделю для луч­шей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2-3 мес свиде­тельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гель­минтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых суток развивает­ся до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (вы­сотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из рав­ных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консис­тенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклян­ной трубки. В течение 1-2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25-30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личин­ки, а через 5-7 сут они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооружен­ным глазом. Естественно развивающиеся в воде яйца трематод, на­пример описторхов, дифиллоботриид, фасциол и др., помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают неболь­шой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол сле­дует учесть, что они быстрее развиваются в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22-24 °С через 9-12 сут формиру­ется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц тре­матод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. При культивирова­нии воду меняют через 2--3 сут.

Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26-30 °С в течение 5-6 сут личинки расползают­ся по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюллеборна).

Метод Harada и Mori (1955). В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой бе­рут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровально# бумаге (15X150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накры­вают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На про­бирке пишут номер и фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят в течение 8-10 сут при температуре 28 °С. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу филь­тровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под повер­хность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а оса­док переносят на предметное стекло, накрывают покровным стек­лом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок не­обходимо пользоваться данными, представленными в табл. 13.

Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов. Мертвые тка­ни в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем жи­вые. Эти особенности используют в гельминтологии для определе­ния жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдель­ных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Таблица 13. Дифференциальная диагностика филярневидных личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для дифференциального распознавания живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцируют метиле­новый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый си­ний в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают, зародыши мертвых яиц окрашива­ются в синий цвет.

Метод окрашивания неприменим для незрелых яиц аскарид и власоглавов; пигментированная оболочка прокрашивается, и поэтому не видно, окрасилась ли зародышевая клетка внутри яйца.

Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10 ООО осуществля­ют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жид­кости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Пре­парат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости, после чего этот же препарат просмат­ривают повторно через 2-3 ч. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 ч. Мертвые ли­чинки окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полно­стью).

Указывается на возможность окраски препаратов раствором йода при определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц. В ка­честве красителя в этом случае используют 5 % спиртовой раствор йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аска­ридий в течение 1-3 с окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторха и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раство­ром толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10 000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают сафранином (в разведе­нии 1:10 000 10 % раствора спирта). Спирт удаляет краску с оболо­чек, а сафранин придает им красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет, зародыш у мертвых - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином либо в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000 или же индигокармином в разведении 1:1000-1:2000.

Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2-7 ч.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня ре­комендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезиловый синий (1:8000) - через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окра­шивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бес­цветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 - в течение 3-5 ч; 3) 50 % ра­створ пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 ч при температуре 29-30 “С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокраши­ваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5-20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно дос­таточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообраз­но применять метиленовый синий для окрашивания мертвых пле­роцеркоидов.

Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жиз­неспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в каче­стве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивиро­вании плесневого гриба Peniciliium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.

Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежиз­неспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкило­стомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид - красный. Менее яр­кая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый цвет: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.

Физико-химические методы стимуляции выхода мирацвдия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физико­химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздей­ствием на яйца трематоды специальной реакционной среды в соче­тании с последовательными приемами - созданием перепада тем­ператур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.

Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предвари­тельно охлаждают до 10-12 °С. Все последующие операции осуще­ствляют при комнатной температуре (18-22 °С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержа­щей 100-400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5-10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осто­рожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробир­ку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного све­тового микроскопа (Х200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка актив­но выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3-5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красите­лем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчи­тывают мирацидии.

Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 М трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0-9,5. В буфер добавля­ют этанол до 10-13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работаю­щий в щелочных пределах pH, например 0,05 М фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол - 12 частей; краситель (маточный раствор) - 1-10 частей; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей - 0,05 М трис-HCl буфер, pH 9,5.

Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Гер­ман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц тре­матоды, помещают в центрифужную пробирку на 1-2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипет­кой 1-2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28-30 °С 2-3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на пред­метное стекло и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (18-22 °С), при этом каждые 25-30 мин (по мере подсыхания) до­бавляют по 1-2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллиро­ванной воде. После этого препарат микроскопируют при 100-200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу рас­крывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3-7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30-40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5-0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1- 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05-0,4 %) обусловли­вает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких про­зрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окраши­вания и подсчета мирацидиев.

Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов.

Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены в 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференциро­вать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюо­ресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стекла­ми; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.

Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гель­минтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц обо­лочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболоч­ка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевым в разведении 1:10 ООО и 1: 50 ООО от 30 мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки ост­риц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают туск­лый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином - у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от ли­лово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминес­цируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки строн­гилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мерт­вые - ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке ра­створами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюорохромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яр­кое свечение.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресни­чек, но спустя 10-15 мин после гибели проявляются ярким «горя­щим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.

Для обнаружения фрагментов гельминтов фекалии просматривают невооруженным , затем смешивают с водой и исследуют небольшими порциями в чашке Петри на темном фоне. Все подозрительные частицы помещают на предметное стекло в каплю воды и исследуют под лупой. Можно суточную порцию поместить в цилиндр с добавлением 5-10-кратного количества воды. После размешивания сосуд оставляют до полного осаждения взвешенных частиц. Поверхностный слой жидкости сливают и наливают чистую воду. Отмытый осадок просматривают небольшими порциями в невооруженным глазом или под лупой. Для обнаружения яиц применяют микроскопические методы исследования.

Метод нативного мазка. Небольшое количество кала из разных мест исследуемой порции растирают на предметном стекле в капле 50% раствора глицерина, изотонического раствора хлорида натрия или воды. Смесь накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом.

Метод всплывания по Фюллеборну. Одну часть испражнений размешивают в 20 частях насыщенного раствора хлорида натрия (удельный вес 1,18), добавляемого небольшими порциями. Всплывшие на поверхность крупные частицы немедленно удаляют, а смесь оставляют на 45 мин. В течение этого времени яйца гельминтов, имеющие меньший удельный вес, чем раствор хлорида натрия, всплывают на поверхность. Поверхностную пленку снимают проволочной петлей диаметром около 1 см и переносят на предметное стекло для исследования под микроскопом.

Метод Калантарян. Эффективность метода всплывания повышается при замене хлорида натрия насыщенным раствором азотнокислого натрия. В этом случае смесь выдерживают 10-15 мин.

Поверхностную пленку, образующуюся после отстаивания смеси кала с раствором хлорида натрия или азотнокислого натрия, можно снимать и предметным стеклом. С этой целью баночку, налитую до краев смесью испражнений с раствором соли, накрывают предметным стеклом так, чтобы нижняя его поверхность соприкасалась с жидкостью. После отстаивания стекло снимают и, быстро повернув кверху поверхностью, на которой находится пленка, просматривают под микроскопом.

Соскоб сперианальных складок (для выявления яиц остриц и онкосфер бычьего цепня) делают утром до совершения туалета. Деревянным шпателем, смоченным в воде или в 50% растворе глицерина, производят соскабливание вокруг анального отверстия. Полученный материал переносят на предметное стекло в каплю воды или 50% раствора глицерина и просматривают под микроскопом. Шпатель можно заменить влажным ватным тампоном, которым протирают перианальную область, затем хорошо прополаскивают в воде. Воду центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом.

Метод Берманна (для выявления личинок). Металлическую сетку с нанесенными на нее 5-6 г фекалий укрепляют на стеклянной воронке, вставленной в штатив. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом. Воронку наполняют водой, подогретой до t° 50°, так, чтобы нижняя часть сетки с калом соприкасалась с водой. Личинки активно переходят в воду и скапливаются в нижней части резиновой трубки. Через 4 часа жидкость спускают в центрифужные пробирки, центрифугируют и осадок просматривают под микроскопом.

Анализ мокроты, носовой слизи и влагалищных выделений для выявления яиц легочной трематоды парагонимуса, личинок аскарид и анкилостомид, яиц остриц, фрагментов эхинококкового пузыря. Исследуемую порцию слизи (выделений) намазывают на стекло и просматривают на черном и белом фоне макроскопически, а затем под микроскопом. Можно добавить к исследуемому материалу 25% раствор антиформина, тщательно взболтать и выдержать 1-1,5 часа в для растворения слизи. Смесь центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом.

Анализ дуоденального и желудочного сока для выявления яиц печеночных трематод, анкилостомид, личинок Strongyloides. Все три порции дуоденального содержимого, полученные при , центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом. Так же исследуют и .

Исследование тканей. Для выявления личинок трихинелл кусочки биопсированной мышцы тщательно расщепляют на волоконца, сдавливают между компрессорными стеклами (толстые стекла с винтами) и исследуют под микроскопом с затененным светом. Для выявления цистицерков мышцы расслаивают препаровальными иглами, выделенный пузырек очищают от окружающей ткани, сдавливают между двумя предметными стеклами и исследуют под лупой.

Анализ крови (для выявления личинок филярий). Исследуют висячую каплю на покровном стекле, окантованном вазелином. Можно 0,3 мл крови смешать с 10-кратным количеством 3% раствора . Смесь центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом. Для обогащения препаратов к 1 мл венозной крови прибавляют 3 мл 2% раствора формалина или 5-кратное количество жидкости, состоящей из 95 мл 5% раствора формалина, 5 мл уксусной кислоты и 2 мл концентрированного спиртового раствора гематоксилина. Смесь центрифугируют, осадок промывают дистиллированной водой путем и исследуют под микроскопом. Для дифференцирования разных видов филярий исследуют мазки, окрашенные по методу Гимзы - Романовского.

Методы иммунологической диагностики. Применяют (агглютинации, связывания комплемента) и аллергические диагностические пробы (см.) с из соответствующего вида гельминта.

Гельминтологические методы исследования. Рис. Яйца гельминтов. 1-10 - яйца круглых червей (нематод): 1 - 3 - аскариды (1 - оплодотворенное яйцо, 2 - оплодотворенное яйцо без белковой оболочки, 3 - неоплодотворенное яйцо); 4 - аскариды кошачьей; 5 -аскариды плотоядных; 5 -острицы; 7 - власоглава; 8 - томинкса; 9 - анкилостомид; 10 - трихо-стронгилид. 11- 15 - яйца ленточных червей (цестод): 11 - цепня бычьего; 12 - цепня карликового; 13 - цепня крысиного; 14 - цепня тыквовидного; 15 -лентеца широкого. 16 - 24 - яйца сосальщиков (трематод): 16 - трематоды (шистосомы) японской; 17 - трематоды (шистосомы) моче - половой; 18 - трематоды (шистосомы) Мансона; 19 - трематоды (парогонимус) легочной; 20 - трематоды (описторхис) сибирской (кошачьей); 21 - трематоды (клонорхис) китайской; 22 - трематоды (метагонимуса) кишечной; 23 - трематоды (фасциолы) печеночной; 24 - трематоды (дикроцелиум) ланцетовидной.

Прежде чем проводить лечебно-профилактические мероприятия при определенных гельминтозах сельскохозяйственных и промысловых животных, необходимо своевременно поставить точный диагноз болезни. Существуют две группы методов диагностики гельминтозов - прижизненные и посмертные. Кроме того, надо уметь дифференцировать гельминтозы и другие инвазионные, а также инфекционные заболевания.

Прижизненная диагностика гельминтозов

Диагноз на гельминтозы при жизни животных ставят на основании результатов лабораторных методов исследований и диагностических дегельминтизаций (прямых методов), а также иммунобиологических реакций (косвенных методов). Подсобную роль в диагностике гельминтозов играют данные исследований промежуточных хозяев (при биогельминтозах), клинические и эпизоотологические наблюдения. Основные методы диагностики - лабораторные исследования, позволяющие часто обнаруживать возбудителей гельминтозов или их яйца и личинки в экскретах (фекалиях, моче, мокроте), секретах (желчи), тканях (крови, мышцах), органах (кусочках кожи), в содержимом пунктатов и абсцессов.

Лабораторные методы диагностики гельминтозов животных легко выполнимы и достаточно точны, поэтому их широко применяют в производственных условиях (в ветеринарных лабораториях и в других ветеринарных учреждениях). В зависимости от целевого назначения лабораторные исслелования подразделяют на гельминтоовоскопические, гельминтоларвоскопические и гельминтоскопические методы исследований.

Гельминтоларвоскопические методы исследований используют для обнаружения личинок гельминтов (диктиокаул, мюллерий и др.). Из этой группы нередко применяют исследование фекалий по методам Бермана-Орлова и Вайда.

Гельминтоскопические или макрогельминтоскопические исследования применяют с диагностической целью для обнаружения выделяемых наружу гельминтов или их фрагментов (члеников нестод). В практических условиях этим способом устанавливают диагноз на аскаридоз свиней, дрепанидотениоз гусей и другие гельминтозы.

Из лабораторных методов диагностики гельминтозов животных большое практическое значение имеют: а) гельминтокопрологические исследования (исследование фекалий); б) исследование выделений других органов; в) исследование тканей.

Гельминтокопрологические исследования

Для этих же целей предложен специальный прибор, состоящий из стальных браншей, переходных ветвей и двух прикрепленных к ветвям полусферических поверхностей. Взятие фекалий из прямой кишки животных при помощи этого прибора облегчает труд ветеринарных работников и повышает производственную культуру этой манипуляции.

У кроликов фекалии в количестве нескольких шариков извлекают путем надавливания на брюшную стенку в области прямой кишки. Иногда допускается взятие проб фекалий с пола, если они свежие и известно, от какого животного. От одного животного берут не менее 10-20 г фекалий. От птиц, пушных зверей, собак, кошек и диких хищников (в зоопарках) фекалии собирают с чистого пола клеток (групповые пробы).

Все пробы фекалий этикетируют: по краю пакета или листа бумаги (где он не будет соприкасаться с экскрементами) простым карандашом пишут номер пробы (иногда и кличку коров). К пробам фекалий прилагают опись, в которой указывают наименование хозяйства, бригады, вид, пол и возраст животных (для взрослых - кличку или инвентарный номер) и дату взятия проб. В сопроводительной желательно указать цель исследований фекалий (например, для контроля проведенной дегельминтизации). Необходимо стараться быстрее доставить пробы фекалий в ветеринарную лабораторию и исследовать их без задержки, потому что при комнатной температуре через 16-20 часов из яиц кишечных стронгилят выходят личинки, что затрудняет диагностику диктиокаулеза и протостронгилидозов, а также других гельминтозов.

Если пробы фекалий в день взятия не исследуют, то их помещают в холодильник или подвал при температуре не выше 10°. Дезинфицирующие средства не приостанавливают развитие личинок внутри яиц гельминтов. Результаты исследования фекалий регистрируют в специальном журнале.

Оборудование для гельминтокопрологических исследований. Достоверность гельминтокопрологических исследований в значительной степени зависит от качества лабораторного оборудования. В 1968 г. на Украине разработан набор стандартного оборудования для массового исследования фекалий на гельмннтозы. Он состоит из предметов, изготовленных преимущественно из ударопрочного полистерола двух цветов, которые легко моются и обезвреживаются (выдерживают кипячение), а также удобны при транспортировке. В состав набора входят стаканчики различной емкости, воронки, конические пробирки, ситечки разных размеров, штатив с пятью планками (каждая на шесть воронок), кювет (по размерам штатива), коробки для хранения посуды, а также резиновые груши, стеклянные палочки и металлические петли (рис. 1).

В отличие от ранее применявшегося разнородного оборудования новый набор повышает эффективность лабораторных исследований фекалий и производительность труда ветеринарных работников, позволяет шире проводить количественные гельминтокопрологические исследования стандартизированными методами (контроль дегельминтизаций), а также улучшает эстетическую сторону этой работы.

Различают качественные и количественные методы исследований фекалий.

Качественные гельминтокопрологические исследования

Качественные методы исследований позволяют установить, какими гельминтами заражены животные.

Гельминтоовоскопические методы. Для прижизненной диагностики гельминтозов предложено большое количество методов гельминтоовоскопии, из которых рассмотрим только те, которыми чаще пользуются в ветеринарной практике.

Большинство гельминтокопрологических методов диагностики основано на разнице удельного веса яиц, личинок гельминтов или их фрагментов, с одной стороны, и жидкости, в которой взвешены исследуемые фекалии, - с другой. В зависимоти от соотношения удельного веса этих компонентов различают методы флотации, осаждения и комбинированные.

Методы флотации. При методах флотации (всплывания) используют жидкости (насыщенные растворы солей), удельный вес которых больше веса яиц гельминтов. В лабораторной практике наиболее широко применяют насыщенный раствор поваренной соли (удельный вес 1,18). Для приготовления такого раствора в кастрюлю с кипящей водой постепенно добавляют при помешивании хлорид натрия до образования на дне небольшого осадка (на 1 л воды берут около 400 г поваренной соли). Горячий раствор фильтруют в бутыль через несколько слоев марли или вату и применяют после остывания (на дне бутыли должен образоваться кристаллический осадок).

Реже в ветеринарных лабораториях используют насыщенные растворы сульфата магния с удельным весом 1,35 (920 г на 1 л горячей воды), гипосульфита натрия с удельным весом от 1,37 до 1,41, в зависимости от температуры окружающей среды (1750 г на 1 л горячей воды) и азотнокислого натрия с удельным весом 1,4 (соотношение селитры и горячей воды 1:1).

Метод Фюллеборна характеризуется простотой выполнения и высокой эффективностью при большинстве нематодозов и цестодозов животных, поэтому он занимает первое место среди других, гельминтокопрологических методов диагностики. В стеклянный, полистероловый или пластмассовый стаканчик емкостью 50-100 мл помещают 3-5 г фекалий и при помешивании стеклянной палочкой постепенно добавляют насыщенный раствор поваренной соли (хлорида натрия) из расчета на одну часть фекалий 15-20 частей флотационной жидкости. Плотные фекалии овец предварительно можно растереть с небольшим количеством раствора соли в фарфоровой ступке, после чего суспензию переливают в стаканчик, добавив необходимое количество раствора хлорида натрия. Всплывшие крупные частицы сразу удаляют палочкой, а взвесь фекалий целесообразно профильтровать в другой стаканчик через сито (иногда употребляют молочные ситечки). После отстаивания заряженной пробы в течение 45-60 минут металлической петлей снимают три капли поверхностной пленки, помещают их на предметное стекло и микроскопируют без покровного стекла. После каждой пробы петли промывают в стакане с водой (вместо рекомендуемых в некоторых руководствах прожиганий их на спиртовке).

Метод Калантарян - видоизмененный метод Фюллеборна. В качестве флотационной жидкости используют насыщенный раствор азотнокислого натрия. Время отстаивания взвеси 15-30 минут. Применяют для диагностики и акантоцефалезов.

Методы осаждения. При методах осаждения используют жидкости с меньшим удельным весом, чем удельный вес яиц.

Метод последовательного промывания. Небольшое количество фекалий (5 г) размешивают в стаканчике с 10-кратным количеством воды. Смесь фильтруют в большой стакан и доливают воду, после чего фильтрат отстаивают 5 минут. Затем сливают или отсасывают спринцовкой верхний слой жидкости до осадка; к осадку добавляют такое же количество воды, перемешивают и отстаивают снова 5 минут. Эти манипуляции повторяют до просветления верхнего слоя жидкости в стакане. Жидкость последний раз сливают, а осадок наносят на стекло или в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом. Этот метод часто применяют для диагностики большинства трематодозов и акантоцефалезов.

Метод Горшкова основан на принципе осаждения с последующей концентрацией яиц гельминтов. 150-300 г фекалий лошади помещают на металлическое сито или марлю в большую стеклянную воронку диаметром в верхней части 15-20 см. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку длиной 10-15 см с зажимом на конце. Фекалии разрыхляют и заливают доверху теплой водой. Фекалии в воронке выдерживают от 4 часов до одних суток, после чего зажим осторожно открывают, часть жидкости выпускают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 минуты. Затем жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом. Этим методом диагностируют драшейоз и габронематоз лошадей.

Комбинированные методы. Основаны на принципе осаждения и флотации яиц гельминтов, поэтому более эффективны в сравнении с предыдущими методами исследований. Ввиду сложности эти методы имеют сравнительно ограниченное применение в производственных условиях.

Метод Дарлинга. Небольшое количество фекалий (3-5 г) размешивают в стаканчике с 20-30 мл воды, смесь процеживают в центрифужные пробирки и центрифугируют 1-2 минуты, после чего верхний слой жидкости сливают, а к осадку доливают смесь равных частей глицерина и поваренной соли. Смесь в пробирках взбалтывают и вторично центрифугируют. Всплывшие на поверхность яйца снимают вместе с пленкой взвеси проволочной петлей, стряхивают на предметное стекло и микроскопируют. При отсутствии глицерина фекалии можно смешивать перед вторичным центрифугированием с насыщенным раствором поваренной соли.

Метод Щербовича. Техника исследования фекалий напоминает предыдущий метод. Отличается от него тем, что перед вторичным центрифугированием к осадку добавляют насыщенный раствор гипосульфита натрия (при макраканторинхозе свиней) или сернокислой магнезии (). По сравнению с методом Дарлинга этот метод более эффективен.

Флотационно-седиментационный метод Демидова рекомендуют для диагностики фасциолеза, а также других трематодозов жвачных. Пробу фекалий (3 г от овец и 5 г от крупного рогатого скота) помещают в стакан емкостью 200 мл и наливают в него доверху насыщенный раствор поваренной соли и тщательно размешивают стеклянной палочкой, после чего взвесь отстаивают 15-20 минут. Всплывшие на поверхность грубые частицы удаляют бумажным совочком, а надосадочную жидкость отсасывают спринцовкой (при исследовании большого количества проб жидкость можно сливать), оставляя на дне 20-30 мл осадка. К осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают. Смесь фильтруют в обычный стакан через марлю или металлическое сито и отстаивают 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка, который переносят в конический стаканчик, пропаласкивают обычный стакан и выливают смыв в маленький. Взвесь отстаивают в коническом стаканчике 3-5 минут, а жидкость в последующем отсасывают (эту процедуру повторяют). Просветленный осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют. Этот метод эффективнее метода последовательного промывания.

Гельминтоларвоскопические методы. Метод Бермана-Орлова. Для исследования фекалий используют аппарат, состоящий из средней воронки (пластмассовой, полистероловой или стеклянной), резиновой трубки (10-15 см длиной), соединенной верхним концом с воронкой, зажима, укрепленного на нижнем конце резиновой трубки, металлического сита или куска марли и штатива (для одного или нескольких аппаратов). Смонтированный аппарат заполняют теплой водой (35-38°). 10-15 г свежих фекалий кладут на сито или завертывают в марлю и осторожно опускают в воронку. Фекалии от овец выдерживают в аппарате 2-4 часа, а от телят - не менее 6-7 часов. Затем зажим на трубке ослабляют, а вытекающую жидкость собирают в пробирку и центрифугируют в течение 2-3 минут. После этого верхний слой жидкости сливают быстрым опрокидыванием пробирки, а оставшуюся на дне жидкость переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Применение зажимов на резиновую трубку в аппарате Бермана связано с неудобствами, поэтому во многих ветеринарных лабораториях нижние концы резиновых трубок непосредственно соединяют с маленькими пробирками. Перед исследованием осадка под микроскопом жидкость не центрифугируют.

Фекалии жвачных можно исследовать на легочные нематодозы (особенно в экспедиционных условиях) упрощенным методом гельминтоларвоскопии (без использования воронок). Для этой цели применяют небольшие полуконические стаканчики (50 мл). Пробы фекалий помещают на ситечки или завертывают в марлю и опускают в стаканчики с водой. Через несколько часов фекалии удаляют, жидкость из стаканчика отсасывают или сливают, а осадок микроскопируют.

Метод Вайда. Несколько шариков фекалий от мелких жвачных помещают в бактериологическую чашку или на часовое стекло и овлажняют их небольшим количеством теплой воды. Через 10-20 минут фекалии удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют под малым увеличением микроскопа. Эффективность этого метода значительно ниже в сравнении с предыдущим методом, поэтому его реже применяют для диагностики диктиокаулеза и протостронгилидозов овец.

Метод дифференциальной диагностики стронгилятозов по инвазионным личинкам. Возбудители большинства кишечных стронгилятозов имеют почти одинаковое строение яиц, поэтому при гельминтоовоскопии можно поставить только групповой диагноз (например, стронгилятозы).

Для установления более точного диагноза (родового) в ветлабораториях иногда получают культуру инвазионных личинок стронгилят. Около 5 г фекалий помещают в бактериологическую чашку, закрывают крышкой и ставят ее в термостат при температуре 25-30° на одну неделю. Затем фекалии с личинками исследуют по методу Бермана-Орлова (для выделения инвазионных личинок из фекалий).

Инвазионные личинки разных родов кишечных стронгилят отличаются по величине тела, строению хвостового конца чехлика и по количеству кишечных клеток. Например, личинки эзофагостом более крупные (до 1 мм длины), нитевидный хвостовой конец чехлика длинный, а кишечник имеет 20-32 клетки; личинки гемонхов средней длины (около 0,8 мм), с нитевидным хвостовым концом чехлика, кишечник имеет 16 клеток.

Периодическое промывание и отстаивание фекалий повторяют до просветления верхнего слоя. Верхний слой жидкости последний раз сливают, а осадок малыми порциями просматривают в кюветках с черным и белым дном. Обнаруженных гельминтов собирают при помощи пинцетов, препаровальных игл и кисточек, просматривают под микроскопом, после чего переносят в консервирующую жидкость. Чтобы выявить мелких нематод, осадок дополнительно исследуют по частям при помощи бинокулярной или штативной лупы с 10-20-кратным увеличением.

Количественные гельминтокопрологические исследования

Стандартизированный метод Фюллеборна менее точен в сравнении с методом Столла, но в виду простоты выполнения его широко применяют в ветеринарной практике для контроля эффективности дегельминтизаций животных. По технике выполнения стандартизированный метод напоминает другие методы качественных гельминтоовоскопических исследований. Однако у него имеется ряд особенностей, основными из которых являются следующие: 1) навески фекалий должны быть равными; 2) посуда одного обьема; 3) время отстаивания водных взвесей фекалий одно и то же; 4) петли одинакового диаметра, исследование равного количества капель.

Для ориентировочного учета интенсивности диктиокаулезной и прогостронгилидозной инвазии у жвачных можно применить стандартизированный метод Бермана-Орлова. Достоверность результатов повышается при увеличение количества и кратности исследований.

Исследование выделений других органов

Исследование содержимого конъюнктивальных полостей применяют для диагностики телязиоза крупного рогатого скота (возбудитель - Thelazia rhodesi). Из спринцовки орошают конъюнктивальные полости водным раствором йода; вытекающую жидкость собирают в кюветку или почковидный тазик и осматривают на наличие телязий. В данном случае водный раствор йода оказывает и лечебное действие.

Исследование истечений из клоаки проводят для прижизненной диагностики . Вытекающую слизь помещают на предметное стекло и исследуют под микроскопом с целью обнаружений яиц возбудителя болезни.

Исследование соскоба с перианальных складок - основной метод диагностики . Лопатковидной палочкой или спичкой, смоченной смесью равных частей глицерина и воды, делают соскоб с перианальных складок промежности и внутренней поверхности корня хвоста. Соскоб переносят на предметное стекло в каплю глицерина с водой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Обнаружение яиц оксиур подтверждает клинический диагноз.

Исследование соскобов кожи из «летних язв» рекомендуется для диагностики кожной формы драшейоза и габронематоза. Соскоб берут со свежеизъязвленной поверхности кожи и помещают в каплю разведенной соляной кислоты (1:1000). Затем препарат расщепляют препаровальными иглами, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом для обнаружения личинок драшей или габронем.

Исследование тканей

Исследование кожи крупного рогатого скота (по Гнединой) применяют для диагностики онхоцеркоза. На нижней брюшной стенке у животного после подготовки операционного поля вырезают небольшой кусочек кожи толщиной 2 мм (с небольшое овсяное зерно), а ранку смазывают настойкой йода. В ветеринарной лаборатории этот кусочек кожи помещают на предметное стекло в физиологический раствор, расщепляют препаровальными иголками, а затем все сливают в центрифужную пробирку и ставят ее на несколько часов в термостат при температуре 37-38°. Затем волокна кожи удаляют, жидкость центрифугируют, а осадок микроскопируют с целью обнаружения подвижных микроонхоцерков.

Исследование кусочков мышц на часто проводят посмертно. Иногда для прижизненной диагностики трихинеллеза используют метод биопсии. Путем оперативного вмешательства вырезают кусочек мышцы (например, из наружных мышц уха), из которых готовят мелкие срезы (с овсяное зерно). Последние помещают на нижнее стекло компрессория, покрывают верхним стеклом и сближают их винтами до полного расплющивания. Просматривают срезы под трихинеллоскопом, малым увеличением микроскопа, с помощью проекционного трихинеллоскопа или проекционной камеры КТ-3.

Диагностические дегельминтизации

Для диагностической дегельминтизации отбирают несколько животных, изолируют от остального поголовья и задают им антгельминтик в терапевтической дозе. Выделенные в течение одних-двух суток фекалии от этих животных собирают и подвергают гельминтоскопическому исследованию на предмет обнаружения возбудителя болезни. В производственных условиях диагностические дегельминтизации нередко проводят для прижизненной диагностики мониезиоза жвачных, дрепанидотениоза гусей, цестодозов плотоядных, аскаридоза свиней и аскаридиоза кур.

Иммунологические реакции

Аллергические кожные реакции предложены для прижизненной диагностики фасциолеза овец, описторхоза плотоядных, и , мониезиоза овец, гемонхоза и диктиокаулеза овец, онхоцеркоза крупного рогатого скота и лошадей и трихинеллеза свиней.

Из серологических методов следует указать на реакцию сколексопреципитации, позволяющую диагностировать ранние стадии эхинококкоза и реакцию преципитации с использованием живых личинок аскарид и трихинелл для выявления соответствующих гельминтозов.

Исследование промежуточных хозяев гельминтов

Результаты гельминтологического обследования животных всегда должны дополняться данными исследований на гельминтозы промежуточных хозяев. Они позволяют выяснять гельминтологическую ситуацию, прогнозировать появление гельминтозов. Промежуточными хозяевами гельминтов могут быть моллюски (пресноводные и сухопутные), ракообразные (циклопы, дафнии, бокоплавы, водяные ослики), дождевые черви, насекомые (мухи, мошки, мокрецы, стрекозы, муравьи, жуки), почвенные клеши.

Эпизоотологическое значение имеет плотность (количественный состав) отдельных видов промежуточных хозяев. Чем она выше, тем больше имеется возможностей для заряжения животных гельминтозями. Наземные промежуточные хозяева находятся в разных местах (в навозных кучах, на выгулах, пастбищных участках и др.). Водные промежуточные хозяева в огромном количестве обитают у берегов стоячих мелких водоемов, в зарослях растений. В этих местах животные (особенно ) часто заражаются гельминтозами.

Промежуточных хозяев на наличие личинок гельминтов надо исследовать в свежем (лучше живом) состоянии под бинокулярной лупой или малым увеличением микроскопа. Личиночные стадии гельминтов в теле промежуточных хозяев находятся на разных стадиях развития, но наиболее заметными являются инвазионные личинки. В итоге исследований определяется экстенсивность (процент) и интенсивность (количество) инвазированности промежуточных хозяев личинками определенных видов гельминтов.

Орибатидные или панцирные, клещи (до 1 мм длины). Обитают в верхних слоях почвы. Это промежуточные хозяева мониезий жвачных и других гельминтов. Для обнаружения личинок ленточных червей (цистицерроидов) предварительно в капле воды на предметном стекле (под контролем лупы) расщепляют на части панцирь орибатидного клеща, затем препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Цистицеркоиды мониезий округлой формы (0,15-0,19 мм в диаметре), снабжены четырьмя присосками и хвостовым придатком. Они очень нежные, поэтому не следует применять метод компрессорного исследования клещей.

Дождевые черви других родов (Criodrilus, Eophila) обитают в водоемах с топкими, илистыми берегами. Они зарегистрированы в качестве промежуточных хозяев возбудителей гистрихоза и порроцекоза уток. Личинка гистрихиса очень крупная (до 3 см длины), беловатого цвета, просвечивает сквозь кожные покровы червя в виде волнистой полосы. Личинки порроцекумов в десять раз меньше предыдущей личинки (2,5-3 мм); они обнаруживаются в кровеносных сосудах при компрессорном исследовании дождевых червей под микроскопом.

Исследование бокоплавов. Бокоплавы достигают длины до 2 см, обитают в морских и пресноводных водоемах. Зарегистрированы они в качестве промежуточных хозяев возбудителей полиморфоза. стрептокароза и тетрамероза птиц. Личинок обнаруживают при компрессорном исследовании этих рачков. Личинки (акантеллы) полиморфуса овальной формы, оранжевого цвета, до 1 мм длины, заметны макроскопически.

Исследование водяных осликов. Водяные ослики от 1 до 1,5 см длины, живут в пресноводных водоемах, являются промежуточными хозяевами возбудителя филиколлеза птиц. При компрессорном исследовании можно выявить личинку (акантеллу) белого цвета, овальной формы, 0,7 мм длины.

Можно также исследовать и других промежуточных хозяев (мошек, мокрецов, мух, стрекоз, жуков, муравьев).

Люминесцентная микроскопия

Метод люминесцентной микроскопии (по В. Г. Эврановой) - новый метод диагностики гельминтозов. Он позволяет дифференцировать однотипные яйца разных видов гельминтов, а также отличать жизнеспособные яйца и личинки от мертвых. Предварительно яйца трематод, цестод и нематод обрабатывают растворами акридина оранжевого и другими флуорохромами. Жизнеспособные яйна и личинки нематод не люминесцируют или слабо люминесцируют, в то время как мертвые ярко светятся и окрашены в оранжевый, желто-зеленый или желтый цвет.

При люминесцентной микроскопии можно дифференцировать яйца главнейших цестод плотоядных, яйца возбудителей и гетеракидоза кур, имеющих, как известно, сходное строение по величине, форме и окраске, а также различать жизнеспособные и мертвые ооцисты кокцидий.

Препараты просматривают под микроскопом МУФ-3 или МЛ-2. Методика люминесцентной микроскопии сравнительно проста и может быть использована в производственных условиях (ветеринарных лабораториях).

Из других исследований, имеющих подсобное значение в установлении диагноза на гельминтозы. можно указать на такие, как выяснение морфологического состава крови (учет эозинофилии), метод определения фракции белков.

Краткая характеристика яиц гельминтов

Яйца представителей разных классов различаются по величине, цвету, форме, строению оболочек и внутреннего содержимого.

Яйца трематод. Чаще овальной формы с крышечкой на одном полюсе. Оболочка гладкая. У некоторых видов оболочка снабжена филаментами (отростками), бугорками. Окраска яиц от светло-серой до коричневой (чаще желтая).

Яйца цестод. Бывают двух типов: лентецов и цепней. У лентенов они напоминают яйца трематод (овальные с крышечкой). Яйца цепней резко отличаются по строению от яиц гельминтов других классов: они чаще средней величины, округлой формы, серого цвета, зрелые (внутри зародыш - онкосфера с тремя парами эмбриональных крючьев).

Яйца нематод. Отличаются от яиц трематод отсутствием крышечки; от яиц цестод - отсутствием онкосферы.

Размеры, форма, строение и цвет оболочек яиц нематод очень разнообразны. Наружная оболочка бывает гладкой, бугристой, ячеистой: толщина оболочек варьирует от тонкой (у стронгилят) до толстой (у трихоцефал). У большинства нематод яйца овальной формы, симметричные, у некоторых - получилиндрические (у драшей). Большинство нематод выделяют наружу незрелые яйца на предсегментационной стадии или нескольких шаров дробления, меньшинство - зрелые (внутри яйца сформирована личинка).

Яйца скребней. Они имеют овальную, эллипсоидную и веретенообразную формы: размер их от среднего до крупного. Выделяемые во внешнюю среду яйца содержат внутри личинку - акантор с десятью эмбриональными крючьями (зрелые).

Клинические наблюдения

Эпизоотологические данные

При диагностике многих гельминтозов сельскохозяйственных животных значительную помощь оказывают эпизоотологические данные (неблагополучие хозяйства по конкретным болезням, сезон года, возраст больных животных, характер пастбищ и водоисточников, метеорологические условия и др.). Например, массовое заболевание с признаками брюшных водянок и падеж овец осенью после дождливого лета и использование под выпасы заболоченных участков пастбищ дает основание заподозрить острую форму фасциолеза. Заболевание гусят летом с признаками расстройства пищеварения (поносы) и нервной системы (парезы) после выпаса их на мелком стоячем водоеме, обильно заселенном циклопами, является основанием для установления предполо-жительного диагноза на дрепанидотениоз. Падеж ягнят весной (через 3-4 недели после начала пастбищного содержания) должен вызвать подозрение о заболевании молодняка овец мониезиозом. Необходимо также учитывать зональные особенности гельминтозов домашних животных, желательно в комплексе с клиническими наблюдениями.