Asas PCR. Tindak balas rantai polimerase. penggunaan PCR dalam amalan perkhidmatan darah

Laman web ini menyediakan maklumat rujukan untuk tujuan maklumat sahaja. Diagnosis dan rawatan penyakit mesti dijalankan di bawah pengawasan pakar. Semua ubat mempunyai kontraindikasi. Perundingan dengan pakar diperlukan!

Kaedah tindak balas rantai polimerase telah ditemui hampir tiga puluh tahun yang lalu oleh seorang saintis Amerika bernama Carrie Mullis. Teknik ini digunakan secara meluas dalam perubatan sebagai alat diagnostik, dan intipatinya adalah untuk menyalin bahagian DNA menggunakan enzim khas ( polimerase) secara buatan in vitro.

Dalam bidang perubatan apakah kaedah ini digunakan?

Mengapa penyalinan DNA dilakukan dan bagaimana ia boleh memberi ubat?
Teknik ini membolehkan:

Mengasingkan dan mengklon gen.
Mendiagnosis penyakit genetik dan berjangkit.
Tentukan paterniti. Seorang kanak-kanak mewarisi beberapa ciri genetiknya daripada ibu bapa kandungnya, tetapi mempunyai identiti genetiknya yang tersendiri. Kehadiran beberapa gen yang sama dengan gen ibu bapa membolehkan kita bercakap tentang mewujudkan hubungan.

Tindak balas rantai polimerase juga digunakan dalam amalan forensik.

Di tempat kejadian, saintis forensik mengumpul sampel bahan genetik. Ini termasuk: rambut, air liur, darah. Selepas itu, terima kasih kepada teknik tindak balas polimerase, DNA boleh diperkuatkan dan identiti sampel yang diambil boleh dibandingkan dengan bahan genetik orang yang disyaki.

Tindak balas rantai polimerase digunakan secara berkesan dalam perubatan:

Dalam amalan pulmonologi - untuk membezakan jenis pneumonia bakteria dan virus, batuk kering.
Dalam amalan ginekologi dan urologi - untuk menentukan ureaplasmosis, klamidia, jangkitan mycoplasma, gardnerellosis, herpes, gonorea.
Dalam amalan gastroenterologi.
Dalam hematologi - untuk penentuan oncovirus dan jangkitan sitomegalovirus.
Dalam diagnosis pesat penyakit berjangkit seperti hepatitis virus, difteria, salmonellosis.

Pada masa ini, kaedah ini paling biasa dalam diagnosis penyakit berjangkit ( hepatitis etiologi virus, HIV, penyakit kelamin, tuberkulosis, ensefalitis bawaan kutu).

Apakah yang berlaku semasa tindak balas?

Tindak balas itu sendiri adalah mudah secara kimia. Sumber DNA untuk tindak balas boleh menjadi setitik darah, rambut, sekeping kulit, dll. Secara teorinya, tindak balas memerlukan reagen yang diperlukan, tabung uji, sampel biologi, dan sumber haba.

Reaksi polimerase memungkinkan untuk mengesan jangkitan, walaupun sampel yang mengandungi bahan biologi hanya mengandungi satu atau beberapa molekul DNA patogen.

Semasa tindak balas, terima kasih kepada enzim DNA polimerase, penggandaan berlaku ( replikasi) bahagian DNA. Asid deoksiribonukleik itu sendiri ( disingkatkan sebagai DNA) adalah penting bagi kami kerana ia memastikan penyimpanan dan penghantaran maklumat genetik kepada sel anak. DNA mempunyai bentuk heliks, yang terdiri daripada blok berulang. Blok ini membentuk nukleotida, yang merupakan unit terkecil DNA. Nukleotida terbentuk daripada asid amino.

Proses replikasi bahagian DNA berlaku semasa kitaran berulang. Dalam setiap kitaran sedemikian, bukan sahaja serpihan DNA asal disalin dan digandakan, tetapi juga serpihan yang telah digandakan dalam kitaran penguatan sebelumnya. Semua ini menyerupai proses janjang geometri.

wujud:

Penguatan semula jadi ( iaitu proses menyalin dan mendarab DNA), yang berlaku dalam badan kita dan merupakan proses yang pasti dan telah ditetapkan.
Penguatan buatan, yang berlaku disebabkan oleh tindak balas rantai polimerase. Dalam kes ini, proses penyalinan dikawal dan membenarkan walaupun bahagian pendek asid nukleik untuk diduplikasi.

Selepas setiap kitaran penyalinan selesai, bilangan serpihan asid nukleik meningkat secara eksponen. Itulah sebabnya proses itu sendiri dipanggil "tindak balas berantai."

Selepas tiga puluh hingga empat puluh kitaran, bilangan serpihan mencapai beberapa bilion.

Untuk amplifikasi dalam vitro (dalam vitro) adalah perlu bahawa serpihan DNA asing tertentu ( iaitu, DNA bukan pesakit, tetapi patogen). Jika penyelesaian yang dicipta tidak mengandungi serpihan tertentu, tindak balas rantai di bawah tindakan polimerase tidak akan berlaku. Ini menerangkan fakta kekhususan tinggi PCR.

Peringkat diagnostik PCR

1. DNA diasingkan daripada bahan yang dikaji.
2. DNA ditambah kepada larutan khas nukleotida.
3. Larutan dipanaskan pada suhu 90 - 95 darjah Celsius supaya protein DNA menggumpal.
4. Kurangkan suhu kepada 60 darjah.
5. Apabila kitaran peningkatan dan penurunan suhu berulang, bilangan tapak asid nukleik bertambah.

6. Dengan melakukan elektroforesis, keputusan disimpulkan dan keputusan penggandaan dikira.

Apakah kelebihan diagnosis ini?

Kepelbagaian: Mana-mana sampel asid nukleik sesuai untuk kaedah ini.
Kekhususan tinggi: patogen mempunyai urutan unik rantai DNA yang khusus untuknya. Oleh itu, keputusan PCR akan boleh dipercayai; adalah mustahil untuk mengelirukan gen satu patogen dengan gen patogen lain.
Kepekaan terhadap kehadiran walaupun satu molekul patogen.

Sebilangan kecil bahan yang diperlukan untuk penyelidikan. Malah setitik darah akan berjaya. Keupayaan untuk mendapatkan keputusan menggunakan jumlah sampel yang minimum adalah sangat penting untuk kajian pediatrik, neonatologi, neurologi, serta dalam amalan perubatan forensik.
Keupayaan untuk menentukan jangkitan lembap, kronik, dan bukan hanya akut.
Banyak kultur patogen adalah sangat sukar untuk ditanam secara in vitro menggunakan kaedah lain, tetapi tindak balas polimerase membolehkan kultur dibiakkan dalam kuantiti yang diperlukan.

Apakah kelemahan diagnosis ini?

Jika bahan yang dimaksudkan untuk PCR mengandungi DNA bukan sahaja patogen hidup, tetapi juga yang mati, penguatan kedua-dua DNA akan berlaku. Sehubungan itu, rawatan yang ditetapkan selepas diagnosis mungkin tidak betul sepenuhnya. Selepas beberapa lama, adalah lebih baik untuk memantau keberkesanan rawatan.
Peningkatan kepekaan terhadap kehadiran mikroorganisma juga boleh dianggap, dalam beberapa cara, sebagai kelemahan. Lagipun, tubuh manusia biasanya mengandungi mikroflora oportunistik, iaitu, ini adalah mikroorganisma yang hidup di dalam usus, perut, dan organ dalaman yang lain. Mikroorganisma ini boleh menyebabkan kemudaratan kepada manusia hanya dalam keadaan tertentu yang tidak menguntungkan - kegagalan untuk mematuhi keperluan kebersihan, air minuman yang tercemar, dsb. Teknik PCR menguatkan DNA walaupun mikroorganisma ini, walaupun mereka tidak membawa kepada patologi.
PCR sistem ujian yang berbeza mungkin menunjukkan keputusan yang akan berbeza antara satu sama lain. Terdapat banyak pengubahsuaian teknik ini: " bersarang», « tidak simetri», « terbalik», « kuantitatif» PCR dan lain-lain.

Pada akhir artikel, lihat
Tindak balas rantai polimerase (PCR) dicipta pada tahun 1983 oleh Kary Mullis (saintis Amerika). Beliau kemudiannya menerima Hadiah Nobel untuk ciptaan ini. Pada masa ini, diagnostik PCR adalah salah satu kaedah yang paling tepat dan sensitif untuk mendiagnosis penyakit berjangkit.
Tindak balas rantai polimerase (PCR)- kaedah eksperimen biologi molekul, kaedah untuk meningkatkan dengan ketara kepekatan kecil serpihan asid nukleik (DNA) tertentu dalam bahan biologi (sampel).
Kaedah PCR adalah berdasarkan penggandaan berulang bahagian DNA tertentu menggunakan enzim di bawah keadaan buatan (in vitro). Akibatnya, kuantiti DNA yang mencukupi untuk pengesanan visual dihasilkan. Dalam kes ini, hanya bahagian yang memenuhi syarat yang ditetapkan disalin, dan hanya jika ia terdapat dalam sampel yang dikaji.
Di samping hanya menambah bilangan salinan DNA (proses ini dipanggil amplifikasi), PCR membenarkan banyak manipulasi lain dengan bahan genetik (pengenalan mutasi, penyambungan serpihan DNA), dan digunakan secara meluas dalam amalan biologi dan perubatan, contohnya. , untuk mendiagnosis penyakit (keturunan, berjangkit), untuk mewujudkan paterniti, untuk mengklon gen, memperkenalkan mutasi, dan mengasingkan gen baru.

Kekhususan dan Aplikasi

Menjalankan PCR

Untuk menjalankan PCR dalam kes yang paling mudah, komponen berikut diperlukan:

Templat DNA yang mengandungi bahagian DNA yang perlu dikuatkan;
dua primer pelengkap kepada hujung serpihan yang dikehendaki;
polimerase DNA termostabil;
deoxynucleotide triphosphates (A, G, C, T);
Ion Mg2+ yang diperlukan untuk operasi polimerase;
larutan penimbal.

PCR dijalankan dalam kitar haba - peranti yang menyediakan penyejukan dan pemanasan berkala bagi tabung uji, biasanya dengan ketepatan sekurang-kurangnya 0.1°C. Untuk mengelakkan penyejatan campuran tindak balas, tambah minyak mendidih tinggi, seperti Vaseline, ke dalam tabung uji. Penambahan enzim tertentu boleh meningkatkan hasil tindak balas PCR.
Kemajuan tindak balas

Biasanya, PCR menjalankan 20 - 35 kitaran, setiap satunya terdiri daripada tiga peringkat. Templat DNA untai dua dipanaskan kepada 94 - 96°C (atau 98°C jika polimerase termostable digunakan) selama 0.5 - 2 minit untuk memisahkan untaian DNA. Peringkat ini dipanggil denaturasi - ikatan hidrogen antara dua rantai dimusnahkan. Kadangkala, sebelum kitaran pertama, campuran tindak balas dipanaskan terlebih dahulu selama 2 - 5 minit untuk menyahtukarkan sepenuhnya matriks dan primer.
Apabila helai telah dipisahkan, suhu diturunkan untuk membolehkan primer terikat pada templat beruntai tunggal. Peringkat ini dipanggil penyepuhlindapan. Suhu penyepuhlindapan bergantung pada primer dan biasanya dipilih 4 - 5°C di bawah suhu leburnya. Masa peringkat ialah 0.5 - 2 minit.

DNA polimerase mereplikasi helai templat menggunakan primer sebagai primer. Ini adalah peringkat pemanjangan. Suhu pemanjangan bergantung kepada polimerase. Polimerase yang biasa digunakan paling aktif pada suhu 72°C. Masa pemanjangan bergantung pada kedua-dua jenis polimerase DNA dan panjang serpihan yang dikuatkan. Biasanya, masa pemanjangan diambil sebagai satu minit setiap seribu pasangan asas. Selepas semua kitaran selesai, langkah pemanjangan akhir tambahan sering dilakukan untuk melengkapkan semua serpihan beruntai tunggal. Peringkat ini berlangsung selama 10 - 15 minit.
Menyediakan bahan untuk penyelidikan dan mengangkutnya ke makmal

Untuk analisis yang berjaya, adalah penting untuk mengumpul bahan dengan betul dari pesakit dan menyediakannya dengan betul. Adalah diketahui bahawa dalam diagnostik makmal majoriti kesilapan (sehingga 70%) dibuat dengan tepat pada peringkat penyediaan sampel. Untuk mengumpul darah di makmal INVITRO, sistem vakum digunakan pada masa ini, yang, dalam satu pihak, mencederakan pesakit secara minimum, dan sebaliknya, membenarkan bahan dikumpulkan sedemikian rupa sehingga ia tidak bersentuhan dengan sama ada kakitangan atau persekitaran. Ini mengelakkan pencemaran (kontaminasi) bahan dan memastikan objektiviti analisis PCR.

DNA - asid deoksiribonukleik - polimer biologi, salah satu daripada dua jenis asid nukleik yang memastikan penyimpanan, penghantaran dari generasi ke generasi dan pelaksanaan program genetik untuk pembangunan dan fungsi organisma hidup. Peranan utama DNA dalam sel ialah penyimpanan jangka panjang maklumat tentang struktur RNA dan protein.

Asid RNA-ribonukleik ialah polimer biologi yang serupa dalam struktur kimianya dengan DNA. Molekul RNA dibina daripada unit monomer yang sama - nukleotida - sebagai DNA. Secara semula jadi, RNA biasanya wujud sebagai satu helai. Dalam sesetengah virus, RNA adalah pembawa maklumat genetik. Dalam sel ia memainkan peranan penting dalam pemindahan maklumat daripada DNA kepada protein. RNA disintesis pada templat DNA. Proses ini dipanggil transkripsi. Terdapat kawasan dalam DNA yang mengandungi maklumat yang bertanggungjawab untuk sintesis tiga jenis RNA, yang berbeza dalam fungsi yang mereka lakukan: RNA messenger atau messenger (mRNA), RNA ribosom (rRNA) dan RNA pengangkutan (tRNA). Ketiga-tiga jenis RNA terlibat dalam sintesis protein dalam satu cara atau yang lain. Walau bagaimanapun, maklumat tentang sintesis protein hanya terkandung dalam mRNA.

Nukleotida ialah unit asas berulang dalam molekul asid nukleik, hasil daripada gabungan kimia asas nitrogen, gula lima karbon (pentose) dan satu atau lebih kumpulan fosfat. Nukleotida yang terdapat dalam asid nukleik mengandungi satu kumpulan fosfat. Mereka dinamakan mengikut asas nitrogen yang terkandung di dalamnya - adenine (A), mengandungi adenine, guanine (G) - guanine, cytosine (C) - cytosine, thymine (T) - thymine, uracil (U) - uracil. DNA mengandungi 4 jenis nukleotida - A, T, G, C, RNA juga mengandungi 4 jenis - A, U, G, C. Gula dalam semua nukleotida DNA ialah deoksiribosa, RNA - ribosa. Apabila asid nukleik terbentuk, nukleotida terikat untuk membentuk tulang belakang gula-fosfat molekul, di sebelahnya terdapat bes.

Primer ialah DNA pendek yang digunakan untuk mereplikasi helai templat. Setiap primer adalah pelengkap kepada salah satu helai templat beruntai dua, membingkai permulaan dan penghujung kawasan yang dikuatkan.

kesusasteraan

Glick B., Pasternak J. Bioteknologi molekul. Prinsip dan Aplikasi. Per. dari bahasa Inggeris - M.: Mir, 2002. - 589 p., ilus. ISBN 5-03-003328-9
Shchelkunov S.N. Kejuruteraan genetik - Novosibirsk: Sibirsk. Univ. rumah penerbitan, 2004. - 496 ms; sakit. ISBN 5-94087-098-8
Patrushev L.I. Sistem genetik buatan - M.: Nauka, 2005 - Dalam 2 jilid - ISBN 5-02-033278-X

PENTING!

Maklumat dalam bahagian ini tidak boleh digunakan untuk diagnosis diri dan rawatan diri. Sekiranya kesakitan atau pemburukan penyakit lain, ujian diagnostik harus ditetapkan hanya oleh doktor yang hadir. Untuk membuat diagnosis dan menetapkan rawatan dengan betul, anda harus menghubungi doktor anda.

Tindak balas rantai polimerase (PCR, PCR - tindak balas rantai polimerase) ialah kaedah mendapatkan berbilang salinan serpihan DNA (gen) tertentu dalam sampel biologi.

Intipati PCR sebagai kaedah biologi molekul adalah penyalinan selektif berulang gen tertentu (sebahagian DNA) menggunakan enzim khas dalam keadaan dalam vitro. Ciri penting PCR ialah penghasilan salinan bahagian DNA tertentu (gen) yang memenuhi syarat tertentu. Sinonim untuk proses penyalinan DNA ialah "amplifikasi." replikasi DNA dalam vivo juga boleh dianggap sebagai amplifikasi. Walau bagaimanapun, tidak seperti replikasi, proses tindak balas rantai polimerase menguatkan bahagian pendek DNA (maksimum 40,000 pasangan asas).

Prinsip asas

Jadi, PCR ialah penyalinan berulang serpihan DNA tertentu secara in vitro semasa kitaran suhu berulang. Bagaimanakah proses tindak balas berlaku dalam satu kitaran suhu?

Pembentukan rantai nukleotida dilakukan oleh enzim DNA polimerase. Walau bagaimanapun, untuk mula bekerja, enzim memerlukan pad pelancaran. Platform adalah "primer" (pembenih) - oligonukleotida sintetik 15-20 nukleotida panjang. Mesti ada dua primer (ke hadapan dan belakang), ia adalah pelengkap kepada bahagian templat DNA, dan serpihan DNA yang dihadkan oleh primer yang akan disalin berkali-kali oleh polimerase DNA. Kerja polimerase adalah untuk menambah nukleotida secara berurutan pelengkap kepada jujukan templat DNA. Oleh itu, dalam satu kitaran suhu, dua serpihan DNA baru disintesis semula (memandangkan molekul DNA terkandas dua kali, pada mulanya terdapat dua matriks). Oleh itu, dalam 25-35 kitaran, berbilion salinan kawasan DNA yang ditentukan oleh primer terkumpul di dalam tabung uji. Struktur kitaran berasingan boleh diwakili seperti berikut:

Denaturasi DNA (pencairan, perbezaan rantai DNA) - 95°C - 1 atau 2 minit;
penyepuhlindapan primer (primer mengikat templat DNA, suhu peringkat ini ditentukan oleh komposisi nukleotida primer) - 60°C (contohnya) - 1 minit;
Pemanjangan DNA (polimerase mensintesis rantai DNA) - 72°C - 1 minit (masa bergantung pada panjang serpihan yang disintesis).

Instrumen untuk menggunakan kaedah tindak balas rantai polimerase di makmal hendaklah terdiri daripada:

(atau, kerana ia juga dipanggil, kitar haba);
sistem untuk s (untuk visualisasi keputusan PCR);
sistem (untuk menganalisis keputusan PCR);
(untuk penyediaan sampel);
set (mekanikal atau elektronik).

Sebagai tambahan kepada peralatan utama dan tambahan untuk makmal PCR berfungsi sepenuhnya, beberapa bahan habis pakai diperlukan: petua steril, tabung uji, rak untuk tabung uji dan dispenser.

Pangkalan reagen dalam makmal PCR konvensional untuk menjalankan tindak balas rantai polimerase sepenuhnya termasuk enzim DNA polimerase dengan penimbal, primer (serpihan DNA sintetik kecil yang melengkapi bahagian permulaan dan akhir templat DNA yang dianalisis), a campuran nukleotida (A, T, G, C). Air yang disucikan juga sangat diperlukan.

Kelebihan kaedah PCR

Sensitiviti tinggi kajian

Kepekaan kaedah adalah sedemikian rupa sehingga mungkin untuk menguatkan dengan PCR dan mengenal pasti jujukan sasaran walaupun ia berlaku sekali dalam sampel 10 5 sel.

Kekhususan ujian

PCR membolehkan anda mengesan DNA agen berjangkit tertentu dengan kehadiran DNA mikroorganisma lain dan DNA organisma tuan rumah, serta menjalankan genotaip. Dengan memilih komponen tindak balas (primer) secara khusus, anda boleh mengesan DNA mikroorganisma yang berkait rapat secara serentak.

Kepelbagaian kaedah PCR

Hakikatnya ialah untuk diagnostik PCR penyakit berjangkit atau penyakit manusia keturunan, anda boleh menggunakan peralatan yang sama, mengikuti prosedur universal untuk penyediaan dan analisis sampel, serta jenis kit reagen yang sama.

Menjimatkan masa

Kelebihan penting PCR ialah ketiadaan peringkat kerja mikrobiologi budaya. Menyediakan sampel, melaksanakan tindak balas dan menganalisis keputusan adalah semudah mungkin dan sebahagian besarnya automatik. Terima kasih kepada ini, masa untuk mendapatkan hasil dapat dikurangkan menjadi 4-5 jam.

Kecekapan kaedah PCR

Keluasan bahan klinikal yang dikaji

Bukan sahaja bahan biologi daripada pesakit boleh digunakan sebagai sampel dalam tindak balas rantai polimerase, tetapi juga banyak substrat lain di mana molekul DNA boleh dikenal pasti dengan kepekaan yang tinggi, contohnya, air, tanah, makanan, mikroorganisma, swab dan banyak lagi. .

Semua kelebihan di atas kaedah unik ini - kepekaan dan kekhususan yang tinggi, pengenalpastian agen berjangkit dan genotaip mana-mana gen manusia, kecekapan tinggi dan penjimatan masa, kepelbagaian asas instrumen - membolehkan kaedah PCR digunakan secara meluas hari ini dalam klinikal diagnostik, amalan perubatan, penyelidikan saintifik, kualiti kawalan dan banyak lagi bidang lain.

Pemakaian PCR

Bidang penggunaan tindak balas rantai polimerase sebagai kaedah moden biologi molekul adalah pelbagai. Ini sebahagian besarnya disebabkan oleh keluasan bahan yang boleh dianalisis (hampir segala-galanya dari mana lebih kurang DNA berkualiti tinggi boleh diasingkan boleh menjadi objek penyelidikan), serta primer yang dipilih. Bidang utama penggunaan PCR:

perubatan klinikal

diagnosis penyakit berjangkit
diagnosis penyakit keturunan
pengesanan mutasi
genotaip
teknologi sel
penciptaan pasport genetik

ekologi

pemantauan alam sekitar
analisis makanan
analisis organisma diubah suai secara genetik (GMO)

perubatan forensik dan kriminologi

pengenalan diri
penubuhan paterniti

farmakologi

perubatan veterinar

penyelidikan saintifik (biologi molekul, genetik)

Organisasi makmal PCR

Maklumat pesanan

Nama	Kelantangan	Pengeluaran	Kaedah	Kucing.No.

Kandungan

Mereka yang berminat dengan kaedah diagnostik baru harus mengetahui apakah kaedah PCR itu. Keupayaan teknikal moden dalam bidang penyelidikan makmal memberi peluang untuk mengesan banyak penyakit pada peringkat awal. Tindak balas rantai polimerase (PCR) pada masa ini dianggap sebagai kaedah yang paling tepat dan baru.

analisis PCR

Analisis PCR - apakah itu? Kaedah ini menggunakan prinsip biologi molekul. Untuk mengkaji bahan, enzim khas digunakan yang berulang kali dan cepat menyalin serpihan DNA dan RNA patogen. Terdapat pelbagai jenis analisis PCR bergantung kepada bahan yang diuji (darah, air kencing, najis, dll.). Selepas pemprosesan, kakitangan makmal membandingkan keputusan yang diperolehi dengan pangkalan data, mengenal pasti kepekatan dan jenis patogen.

Analisis PCR diletakkan di dalam cycler (peranti) khas, yang memanaskan dan menyejukkan tiub dengan biomaterial. Perubahan suhu diperlukan untuk replikasi serpihan. Ketepatan keputusan akan bergantung pada ketepatan rejim suhu. Kaedah tindak balas rantai polimerase membantu mengenal pasti:

Mononukleosis berjangkit;
jangkitan sitomegalovirus;
hepatitis virus G, C, B, A;
jangkitan/penyakit menular seksual (STI/STD): gardnerellosis, trikomoniasis, ureaplasmosis;
jangkitan herpetik;
virus onkogenik;
listeriosis;
jangkitan Helicobacter pylori;
ensefalitis bawaan kutu, borreliosis;
batuk kering;
kandidiasis.

darah

Pada masa ini, disebabkan kebaharuan teknologi, ujian darah PCR masih mempunyai harga yang tinggi. Untuk menyediakan biomaterial, anda tidak perlu memenuhi keperluan tertentu. Malah perubahan dalam komposisi yang disebabkan oleh aktiviti fizikal, tekanan, atau perubahan dalam diet tidak menjejaskan keputusan kajian. Ujian darah PCR hanya boleh rosak dengan mengambil agen antibakteria, jadi sebelum mengambil ujian anda mesti berhenti seketika antara rawatan dan ujian.

Ujian darah PCR adalah pilihan yang paling biasa untuk mendiagnosis patologi berjangkit kronik, akut dengan manifestasi virus atau atipikal. Kaedah penyelidikan serologi mempunyai kesukaran tertentu dalam pelaksanaannya - kehadiran patogen ditentukan oleh kehadiran antibodi dalam tubuh manusia. Hasilnya boleh menjadi negatif palsu jika keadaan pesakit tidak memberi masa untuk perkembangan mereka.

calitan

Dalam bidang ginekologi, analisis smear PCR digunakan untuk mengkaji kehadiran mikroorganisma berjangkit. Bekerja dengan bahan dijalankan mengikut prinsip yang sama seperti dengan darah: pembesaran berganda serpihan DNA patogen untuk mengenal pastinya dengan mudah. Ini juga membantu untuk mengesan jangkitan tersembunyi pada wanita. Pelbagai cecair biologi boleh diambil untuk analisis: air liur, kahak, air kencing, darah. Dalam ginekologi, untuk penentuan yang tepat, smear dari mukosa faraj dari saluran serviks lebih kerap digunakan.

Terdapat tanda-tanda tertentu untuk melakukan PCR. Selalunya ia perlu dilakukan untuk mengenal pasti patogen yang tahan terhadap antibiotik. Pada wanita, petunjuk utama untuk diagnosis menggunakan kaedah ini ialah:

kehamilan yang sukar;
fasa akut STI;
jika terdapat syak wasangka STI telah berkembang ke peringkat kronik;
mencari punca ketidaksuburan.

Kala

Untuk mengesan jangkitan, doktor mungkin menetapkan ujian najis PCR. Untuk mendapatkan keputusan yang paling boleh dipercayai selepas ujian, anda mesti mematuhi peraturan berikut sebelum mengumpul biomaterial:

berhenti mengambil julap beberapa hari sebelum: minyak, suppositori;
mengecualikan ubat-ubatan yang memberikan warna tertentu pada najis, contohnya, mengandungi besi.

Air kencing

Jika perlu, doktor anda mungkin mengambil air kencing untuk ujian. Ketepatan tinggi membuka kemungkinan bekerja dengan mana-mana cecair biologi yang mana DNA virus boleh diekstrak. Untuk mengambil ujian air kencing PCR, anda mesti mematuhi sekatan berikut sebelum mengumpul bahan:

hentikan hubungan seksual sekurang-kurangnya 1 hari sebelum prosedur;
3 minggu sebelum ujian, sebarang rawatan antibakteria harus diselesaikan, kerana ubat-ubatan akan mengaburkan gambar;
Anda perlu mengambil ujian semasa perut kosong (cecair juga dilarang);
Anda perlu mengambil bahagian pagi pertama bahan.

Keputusan ujian PCR

Daripada perkara di atas adalah jelas apakah analisis PCR dan kelebihan jelas kaedah penyelidikan ini dapat dilihat. Satu lagi kelebihan prosedur diagnostik ini ialah kemudahan mentafsir keputusan. Memandangkan berapa lama analisis PCR mengambil masa (proses itu sendiri mengambil masa kira-kira 5 jam, tetapi makmal menghasilkan data dalam 1-2 hari), kaedah diagnostik ini menjadi pilihan terbaik untuk mengenal pasti banyak jangkitan. Berdasarkan keputusan, doktor anda mungkin memberitahu anda bahawa ujian:

Negatif - bahan ujian tidak mengandungi patogen yang dikehendaki.
Positif - RNA dan DNA patogen ditemui.

Kadangkala penentuan kuantitatif mikroorganisma dijalankan. Ini adalah perlu untuk penyakit yang disebabkan oleh patogen oportunistik. Keistimewaan virus ini ialah ia hanya muncul dalam kuantiti yang berlebihan dan sangat bermasalah untuk mencarinya melalui penyelidikan konvensional. Faktor ini penting untuk memilih taktik terapeutik untuk merawat jangkitan virus dengan berkesan, contohnya, hepatitis, HIV.

Untuk 12 jangkitan

Untuk memahami sepenuhnya apa itu diagnostik PCR jangkitan dan sejauh mana keberkesanannya, anda perlu tahu bahawa ia boleh mengasingkan sehingga 12 patogen. Teks dijalankan hanya dalam keadaan makmal. Untuk penyelidikan, enzim khas digunakan yang meningkatkan jumlah serpihan RNA dan DNA virus berkali-kali ganda. Analisis PCR untuk 12 jangkitan boleh mengesan:

Mycobacterium tuberculosis;
sitomegalovirus;
hepatitis C, G, B, A;
herpes 1, 2 jenis;
Virus Epstein-Barr (mononukleosis berjangkit);
jangkitan yang disebarkan secara seksual, contohnya, klamidia;
listeriosis;
jangkitan candida;
Helicobacter pylori;
borreliosis, ensefalitis bawaan kutu.

Untuk hepatitis C

Kaedah diagnostik ini membantu menentukan kehadiran virus dalam darah. Ini memberi peluang kepada doktor untuk bercakap tentang kehadiran atau ketiadaannya. Terdapat dua jenis analisis PCR untuk hepatitis C: kualitatif dan kuantitatif. Pilihan pertama hanya menunjukkan kehadirannya dan mungkin mempunyai perkataan "dikesan"/"tidak dikesan". Ujian jenis ini mempunyai sensitiviti 10-500 IU/ml. Ini menunjukkan bahawa jika kandungan patogen dalam badan adalah rendah, analisis akan "tidak dikesan."

Analisis kuantitatif lebih tepat dan akan menunjukkan kepekatan jangkitan dalam darah. Penunjuk ini dirujuk sebagai "beban virus" dan diukur dalam jumlah RNA virus bagi setiap isipadu darah tertentu. Penyahkodan dalam makmal yang berbeza mungkin berbeza-beza. Sebagai tambahan kepada ukuran IU/ml, unit "salinan" digunakan. Anda boleh mengira salinan setiap IU menggunakan formula: 1 IU = 4 salinan. Jika nilai penyahkodan untuk kehadiran virus melebihi 800,000 IU/ml (atau 800*103), ini menunjukkan kandungan patogen yang tinggi.

Untuk batuk kering

Ujian perlu dilakukan pada waktu pagi. Ini penting untuk mengelakkan keseluruhan jisim kahak yang terbentuk semalaman daripada keluar dari perut. Analisis PCR untuk tuberkulosis adalah sama pentingnya dengan ELISA, Mantoux, dan tomografi. Ujian ini membantu mengenal pasti kehadiran mikobakteria, keadaan air kencing, jumlah imunoglobulin, ESR, dan menentukan keadaan paru-paru pada masa ini. Untuk memastikan keputusan yang tepat semasa menganalisis PCR, ia mesti dijalankan dengan mematuhi peraturan berikut:

Penyemaian dilakukan 3 kali, tetapi aspirasi lengkap kandungan perut harus dilakukan hanya dalam keadaan hospital.
Mikobakteria dikesan oleh kultur jisim sedia ada dalam perut dalam kurang daripada 50% diagnosis. Walaupun keadaan optimum diperolehi, ultrasound adalah disyorkan.
Walaupun hasilnya negatif, kemungkinan mengembangkan tuberkulosis dengan perubahan dalam ESR, imunoglobulin atau penunjuk lain tidak boleh dikecualikan sepenuhnya.
Kultur bahan PCR kurang terdedah kepada keadaan patologi jika ia diperoleh sebagai sebahagian daripada pemeriksaan bronkoskopik, yang tidak termasuk syak wasangka TB pada kanak-kanak.

Untuk HIV

Bagi kebanyakan orang, diagnosis ini dianggap sebagai hukuman mati. Atas sebab ini, selepas hubungan seksual yang kerap, seseorang menjadi lebih prihatin terhadap isyarat yang diberikan oleh tubuhnya (dan kadang-kadang menciptanya). Pilihan yang paling boleh dipercayai untuk mendapatkan pengesahan atau penolakan penyakit ini ialah ujian PCR untuk HIV. Ujian ini boleh digunakan untuk menentukan kemungkinan masalah kesihatan berikut:

Penolakan/pengesahan kehadiran HIV semasa tempoh seronegatif.
Penentuan genotip HIV-1, HIV-2.
Penjelasan perihalan proses patologi dalam kes keputusan imunoblot yang dipersoalkan.
Jangkitan selepas pemindahan darah.
Penentuan status HIV pada kanak-kanak yang dilahirkan oleh ibu yang menjadi pembawa penyakit.
Membantu mewujudkan pemantauan beban virus badan.

Untuk HPV

Virus papilloma boleh dikesan pada mana-mana orang; ia boleh kekal terpendam untuk masa yang lama. Perkembangan diprovokasi oleh imuniti yang lemah, tekanan atau ledakan emosi. Ujian PCR untuk HPV membantu menentukan kepekatan virus dalam darah. Atas sebab ini, adalah disyorkan bahawa penentuan dibuat secara kuantitatif dan bukannya kualitatif. Data ini akan membantu meramalkan kemungkinan jangkitan malignan.

Kaedah untuk mendiagnosis kehadiran HPV adalah berdasarkan sifat utama PCR untuk mengasingkan DNA virus daripada bahan. Oleh kerana sensitiviti tinggi ujian, walaupun sejumlah kecil bakteria akan dikesan. Penyelidikan kuantitatif memberi peluang kepada doktor untuk menentukan tahap bahaya penyakit dan membuat ramalan untuk masa depan. Diagnosis ini adalah wajib untuk semua lelaki dan wanita yang telah menemui kondiloma. Analisis PCR kuantitatif akan membantu menentukan punca perkembangan HPV: penurunan sementara dalam imuniti atau penyakit kronik.

Untuk herpes

Jenis diagnostik dalam mikrobiologi ini membantu menjalankan analisis PCR untuk herpes dengan ketepatan yang tinggi. Penyalinan serpihan DNA virus hanya akan berlaku jika gen yang dikehendaki terdapat dalam bahan. Dalam kes ini, keputusan ujian boleh menunjukkan kehadiran atau ketiadaan patogen. Ia boleh dikesan walaupun pada kepekatan rendah dalam darah.

Satu lagi kelebihan ujian PCR ialah ia boleh mengesan jangkitan virus herpes sejurus selepas jangkitan, sebelum munculnya gejala klinikal. Anda boleh menentukan jenis herpes (1 atau 2); tiada persediaan khusus diperlukan untuk mengambil ujian, tetapi doktor mengesyorkan bahawa sebelum mengambil darah anda menolak:

goreng;
akut;
alkohol;
gemuk.

Semasa mengandung

Apabila membawa anak, sangat penting untuk menjalankan penyelidikan ini untuk mendaftarkan keadaan wanita itu. Analisis PCR semasa kehamilan termasuk dalam senarai kaedah yang paling berkesan untuk menentukan kehadiran pelbagai penyakit. Ujian ini diperlukan bukan sahaja untuk mengenal pasti patologi, tetapi juga untuk menentukan kemungkinan jangkitan kanak-kanak dalam rahim. Hanya terima kasih kepada diagnostik PCR menjadi mungkin untuk mengenal pasti tahap perkembangan, perkembangan banyak jangkitan di dalam rahim.

Mengambil ujian PCR

Jika anda tertanya-tanya bagaimana analisis PCR diambil, maka setiap kes individu harus dipertimbangkan, dengan mengambil kira jenis biomaterial. Pengikisan, calitan atau pengambilan darah mempunyai ciri tersendiri, contohnya:

plasma didermakan pada waktu pagi;
air kencing diambil hanya pertama pada waktu pagi, dalam keadaan makmal dalam bekas steril;
calitan atau pengikisan akan menjadi petunjuk hanya selepas menahan diri daripada hubungan seksual sekurang-kurangnya 3 hari;
Anda tidak boleh mengambil calitan semasa haid dan 2 hari selepasnya.

Di mana untuk mendapatkan ujian PCR

Jenis penyelidikan ini merujuk kepada kaedah diagnostik moden dan berteknologi tinggi. Ujian menggunakan kaedah PCR perlu dilakukan di makmal yang mempunyai semua peralatan yang diperlukan untuk mendapatkan keputusan penuh. Kakitangan yang berkelayakan dan terlatih memainkan peranan yang sama pentingnya. Beri keutamaan kepada makmal yang besar, serius dan terkenal. Ini bukan sahaja akan membantu anda mendapatkan hasil dengan cepat, tetapi juga akan memastikan kebolehpercayaannya.

harga

Soalan lain yang sering menarik minat pesakit: berapakah kos ujian PCR? Disebabkan kebaharuan kaedah dan keperluan untuk membeli peralatan mahal, harga ujian agak tinggi. Kos PCR bergantung pada jenis jangkitan yang mana orang itu akan diuji. Anggaran harga dan masa ujian adalah seperti berikut:

STI akan diperiksa dalam 1 hari, harganya adalah 400-500 rubel.
Herpes, HPV, virus Epstein-Barr, sitomeglovirus dikesan dalam masa 24 jam, harga - 300-500 rubel.
Analisis hepatitis dijalankan dalam masa 5 hari, harga untuk pilihan kualitatif ialah 500 rubel, pilihan kuantitatif ialah 2000 rubel.
Helicobacter pylori dikesan dalam masa 24 jam, harganya ialah 400 rubel.
Antigen, antibodi HIV, harga - dari 380 rubel.
Analisis kualitatif RNA HIV, harga - dari 3,500 rubel.
Analisis kuantitatif RNA HIV, harga - dari 11,000 gosok.

Video

Perhatian! Maklumat yang dibentangkan dalam artikel adalah untuk tujuan maklumat sahaja. Bahan-bahan dalam artikel tidak menggalakkan rawatan diri. Hanya doktor yang berkelayakan boleh membuat diagnosis dan memberi cadangan rawatan berdasarkan ciri-ciri individu pesakit tertentu.

Menemui ralat dalam teks? Pilihnya, tekan Ctrl + Enter dan kami akan membetulkan semuanya!

Agensi Pendidikan Persekutuan

Institusi pendidikan negeri

Pendidikan profesional yang lebih tinggi

"Akademi Pedagogi Negeri Karelian"

Kerja kursus mengenai topik:

Tindak balas rantai polimerase (PCR) dan aplikasinya

Dilengkapkan oleh: pelajar Koryagina Valeria Aleksandrovna

Disemak oleh: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

pengenalan

Bab 1. Kajian literatur

1.5.4 Kesan dataran tinggi

1.5.6 Penguatan

Kesimpulan

pengenalan

Dua puluh tahun yang lalu telah ditandai dengan pengenalan meluas kaedah genetik molekul ke dalam sains biologi, perubatan dan pertanian.

Menjelang awal 1970-an, nampaknya biologi molekul telah mencapai tahap kematangan tertentu. Dalam tempoh ini, objek utama penyelidikan genetik molekul adalah mikroorganisma. Peralihan kepada eukariota membentangkan penyelidik dengan masalah baru yang tidak dapat diselesaikan menggunakan kaedah analisis genetik yang wujud pada masa itu. Satu kejayaan dalam pembangunan genetik molekul menjadi mungkin berkat kemunculan alat eksperimen baru - endonucleases sekatan. Pada tahun-tahun berikutnya, bilangan kaedah untuk analisis DNA langsung, berdasarkan pendekatan yang berbeza secara kualitatif, mula meningkat dengan cepat.

Teknologi moden dalam banyak kes telah memungkinkan untuk mula mengkaji organisasi struktur dan fungsional yang halus bagi genom nuklear dan ekstranuklear pelbagai organisma pada tahap yang lebih mendalam. Ini amat penting untuk pembangunan kaedah baru untuk mendiagnosis dan merawat pelbagai penyakit. Tidak kurang pentingnya ialah kemungkinan menggunakan pencapaian genetik molekul dalam biologi populasi dan pembiakan untuk mengenal pasti dan menganalisis kebolehubahan genetik populasi, varieti dan strain, mengenal pasti dan mengesahkan individu yang bernilai ekonomi, mencipta organisma yang diubah suai secara genetik dan untuk menyelesaikan isu-isu lain.

Setiap kaedah mempunyai kelebihan dan kekurangannya sendiri. Tidak ada kaedah universal yang dapat menyelesaikan semua masalah yang timbul. Oleh itu, pemilihan kaedah khusus untuk penyelidikan yang dijalankan adalah salah satu peringkat terpenting dalam mana-mana kerja saintifik.

Bab 1. Kajian literatur

1.1 Sejarah penemuan tindak balas rantai Polimerase (PCR)

Pada tahun 1983 K.B. Mullis et al menerbitkan dan mematenkan kaedah tindak balas rantai polimerase (PCR), yang ditakdirkan untuk memberi kesan yang mendalam terhadap semua bidang penyelidikan dan penggunaan asid nukleik. Kepentingan kaedah ini untuk biologi molekul dan genetik ternyata sangat hebat dan jelas sehingga tujuh tahun kemudian penulis dianugerahkan Hadiah Nobel dalam Kimia.

Pada permulaan penggunaan kaedah, selepas setiap kitaran penyejukan pemanasan, adalah perlu untuk menambah polimerase DNA kepada campuran tindak balas, kerana ia tidak diaktifkan pada suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan helai heliks DNA. Prosedur tindak balas adalah agak tidak cekap dan memerlukan banyak masa dan enzim. Pada tahun 1986, kaedah tindak balas rantai polimerase telah bertambah baik dengan ketara. Ia telah dicadangkan untuk menggunakan polimerase DNA daripada bakteria termofilik. Enzim-enzim ini ternyata termostable dan mampu menahan banyak kitaran tindak balas. Penggunaannya memungkinkan untuk memudahkan dan mengautomasikan PCR. Salah satu polimerase DNA termostabil pertama telah diasingkan daripada bakteria Thermus aquaticusdan dinamakan Taq-polimerase.

Keupayaan untuk menguatkan mana-mana segmen DNA yang jujukan nukleotidanya diketahui, dan untuk mendapatkannya dalam bentuk homogen dan kuantiti persediaan setelah selesai PCR, menjadikan PCR kaedah alternatif untuk pengklonan molekul serpihan DNA pendek. Dalam kes ini, tidak perlu menggunakan teknik metodologi kompleks yang digunakan dalam kejuruteraan genetik semasa pengklonan konvensional. Pembangunan kaedah PCR telah meluaskan keupayaan metodologi genetik molekul, dan, khususnya, kejuruteraan genetik, sehingga ia telah berubah secara radikal dan mengukuhkan potensi saintifik banyak bidangnya.

1.2 Jenis tindak balas rantai polimerase (PCR)

· PCR bersarang- digunakan untuk mengurangkan bilangan hasil sampingan tindak balas. Dua pasang primer digunakan dan dua tindak balas berurutan dijalankan. Pasangan primer kedua menguatkan kawasan DNA dalam produk tindak balas pertama.

· PCR terbalik- digunakan apabila hanya kawasan kecil dalam urutan yang dikehendaki diketahui. Kaedah ini amat berguna apabila ia datang untuk menentukan jujukan jiran selepas DNA telah dimasukkan ke dalam genom. Untuk menjalankan PCR terbalik, satu siri pemotongan DNA dilakukan menggunakan enzim sekatan<#"justify">primer tindak balas rantai polimerase

· PCR khusus kumpulan- PCR untuk saudara mara<#"center">1.3 Tindak balas rantai polimerase

Ditemui pada pertengahan 1980-an, tindak balas rantai polimerase (PCR) boleh melipatgandakan bilangan salinan sampel asal berjuta-juta kali dalam masa beberapa jam. Semasa setiap kitaran tindak balas, dua salinan terbentuk daripada molekul asal. Setiap salinan DNA yang disintesis boleh berfungsi sebagai templat untuk sintesis salinan DNA baharu dalam kitaran seterusnya. Oleh itu, pengulangan berulang kitaran membawa kepada peningkatan bilangan salinan dalam janjang geometri. Daripada pengiraan, ia mengikuti bahawa walaupun dengan 30 kitaran, bilangan salinan molekul asal akan menjadi lebih daripada 1 bilion. Walaupun kita mengambil kira bahawa tidak semua amplikon diduplikasi semasa setiap kitaran, jumlah salinan, walaupun ini, adalah angka yang agak besar.

Setiap kitaran tindak balas rantai polimerase (PCR) terdiri daripada langkah-langkah berikut:

· Denaturasi - Peningkatan suhu menyebabkan molekul DNA untai dua terlepas dan berpecah kepada dua untai tunggal;

· Penyepuhlindapan - Mengurangkan suhu membolehkan primer mengikat ke kawasan pelengkap molekul DNA;

· Pemanjangan - Enzim DNA polimerase melengkapkan untaian pelengkap.

Untuk menguatkan serpihan terpilih, dua primer oligonukleotida (primer) mengapit kawasan DNA tertentu digunakan. Berorientasikan primer 3 - berakhir ke arah satu sama lain dan ke arah urutan yang perlu dikuatkan. DNA polimerase menjalankan sintesis (penyelesaian) rantai DNA yang saling melengkapi, bermula dengan primer. Semasa sintesis DNA, primer disepadukan secara fizikal ke dalam rantaian molekul DNA yang baru disintesis. Setiap helai molekul DNA yang terbentuk menggunakan salah satu primer boleh berfungsi sebagai templat untuk sintesis untaian DNA pelengkap menggunakan primer lain.

1.4 Menjalankan tindak balas rantai polimerase (PCR)

Tindak balas rantai polimerase dijalankan dalam tiub polipropilena berdinding nipis khas, bersaiz serasi dengan kitar haba (penguat) yang digunakan - peranti yang mengawal suhu dan ciri masa peringkat tindak balas rantai polimerase (PCR).

1.5 Prinsip kaedah tindak balas rantai polimerase

Tindak balas rantai polimerase (PCR) ialah kaedah penguatan DNA in vitro yang boleh digunakan untuk mengasingkan dan mendarab jujukan DNA tertentu berbilion kali dalam beberapa jam. Keupayaan untuk mendapatkan sejumlah besar salinan satu kawasan genom yang ditentukan dengan ketat sangat memudahkan kajian sampel DNA sedia ada.

Untuk menjalankan tindak balas rantai polimerase, beberapa syarat mesti dipenuhi:

1.5.1 Kehadiran beberapa komponen dalam campuran tindak balas

Komponen utama campuran tindak balas (PCR) ialah: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, campuran nukleotida trifosfat (ATP, GTP, CTP, TTP), primer (oligonukleotida), penyediaan DNA sampel, polimerase DNA termostabil. Setiap komponen campuran tindak balas terlibat secara langsung dalam tindak balas rantai polimerase (PCR), dan kepekatan reagen secara langsung mempengaruhi perjalanan penguatan.

· Tris-HCl - menentukan pH campuran tindak balas, mencipta kapasiti penampan. Aktiviti polimerase DNA bergantung kepada pH persekitaran, jadi nilai pH secara langsung mempengaruhi perjalanan tindak balas rantai polimerase. Biasanya nilai pH adalah antara 8 dan 9.5. Nilai pH yang tinggi diambil kerana pH penimbal Tril-HCl menurun apabila suhu meningkat.

· KCl - kepekatan kalium klorida sehingga 50 mM menjejaskan perjalanan proses denaturasi dan penyepuhlindapan di atas 50 mM menghalang polimerase DNA.

· MgCl 2- kerana polimerase DNA ialah Mg 2+- bergantung kepada enzim, maka kepekatan ion magnesium mempengaruhi aktiviti enzim (Mg 2+membentuk kompleks dengan NTP - kompleks ini adalah substrat untuk polimerase). Kepekatan yang tinggi membawa kepada peningkatan dalam amplifikasi tidak spesifik, dan kepekatan yang rendah membawa kepada perencatan tindak balas yang optimum (untuk pelbagai polimerase) adalah dalam julat 0.5 - 5 mM. Di samping itu, kepekatan garam magnesium mempengaruhi perjalanan denaturasi dan proses penyepuhlindapan - peningkatan kepekatan Mg 2+menyebabkan peningkatan dalam suhu lebur DNA (iaitu, suhu di mana 50% untai DNA dua untai dipisahkan kepada untai tunggal).

· NTP - nukleotida trifosfat adalah monomer langsung asid nukleik. Untuk mengelakkan penamatan rantai, nisbah yang sama bagi keempat-empat nukleotida trifosfat adalah disyorkan. Kepekatan rendah komponen ini dalam campuran tindak balas meningkatkan kemungkinan ralat apabila membina rantai DNA pelengkap.

· Primer - Yang paling optimum ialah menggunakan primer dengan perbezaan suhu lebur tidak lebih daripada 2 - 4 o C. Kadangkala semasa penyimpanan jangka panjang pada suhu 4 o C, atau selepas sejumlah besar pembekuan dan pencairan, primer membentuk struktur sekunder - dimer, mengurangkan kecekapan PCR. Menghapuskan masalah ini datang kepada pengeraman dalam mandi air (T=95 o C) selama 3 minit dan penyejukan pantas seterusnya kepada 0o DENGAN.

· Persediaan DNA - kuantiti dan kualiti penyediaan DNA (matriks) secara langsung mempengaruhi perjalanan dan parameter tindak balas rantai polimerase. Jumlah sampel DNA yang berlebihan menghalang tindak balas rantai polimerase (PCR). Kekotoran pelbagai bahan yang terdapat dalam penyediaan DNA juga boleh mengurangkan keberkesanan tindak balas rantai polimerase (PCR): natrium asetat, natrium klorida, isopropanol, etanol, heparin, fenol, urea, hemoglobin, dll.

· Polimerase DNA - apabila menggunakan sejumlah kecil polimerase DNA, penurunan dalam sintesis produk akhir diperhatikan dalam perkadaran langsung dengan saiz serpihan. Lebihan polimerase sebanyak 2-4 kali membawa kepada penampilan spektrum meresap, dan sebanyak 4-16 kali - spektrum tidak spesifik molekul rendah. Julat kepekatan yang digunakan ialah 0.5 - 1.5 unit aktiviti setiap 25 μl campuran PCR.

Sebagai tambahan kepada komponen utama campuran PCR, beberapa bahan tambahan digunakan yang meningkatkan penunjuk kualitatif dan kuantitatif PCR: acetamide (5%) - meningkatkan keterlarutan komponen utama; betaine (garam natrium) - penstabilan polimerase DNA, menurunkan suhu lebur DNA, menyamakan suhu lebur; albumin lembu (10-100 μg / ml) - penstabilan polimerase DNA; dimetil sulfoksida (1-10%) - meningkatkan keterlarutan komponen utama; formamide (2-10%) - meningkatkan kekhususan penyepuhlindapan; gliserol (15-20%) - meningkatkan kestabilan haba enzim, menurunkan suhu denaturasi sampel DNA; ammonium sulfat - menurunkan suhu denaturasi dan penyepuhlindapan.

1.5.2 Mod kitaran dan suhu

Penampilan umum program tindak balas rantai polimerase (PCR) adalah seperti berikut:

pentas. Denaturasi primer jangka panjang bagi penyediaan DNA

pentas. Denaturasi pantas penyediaan DNA. Penyepuhlindapan primer. Pemanjangan.30 - 45 kitaran.

pentas. Pemanjangan panjang. Menyejukkan campuran tindak balas.

Setiap elemen peringkat - denaturasi, penyepuhlindapan, pemanjangan - mempunyai ciri suhu dan masa individu. Parameter suhu dan masa untuk setiap elemen dipilih secara empirik, mengikut penunjuk kualitatif dan kuantitatif produk penguatan.

Denaturasi. Semasa unsur tindak balas rantai polimerase ini, molekul DNA untai dua terbahagi kepada dua untai tunggal. Parameter suhu denaturasi berada dalam julat 90 - 95 o C, tetapi dalam kes sampel DNA dengan kandungan guanin dan sitosin yang tinggi, suhu perlu ditingkatkan kepada 98 o C. Suhu denaturasi mestilah mencukupi untuk menyahtukar sepenuhnya helai DNA dan mengelakkan "penyejukan kilat" atau penyepuhlindapan pantas, walau bagaimanapun, polimerase DNA termostabil kurang stabil pada suhu tinggi. Oleh itu, pemilihan parameter suhu denaturasi optimum untuk nisbah primer/sampel (penyediaan DNA) adalah syarat penting semasa menjalankan penguatan. Jika suhu denaturasi pada peringkat pertama melebihi 95 o C, adalah disyorkan untuk menambah polimerase DNA kepada campuran tindak balas selepas denaturasi awal. Tempoh unsur peringkat ini semasa tindak balas rantai polimerase (PCR) sepatutnya mencukupi untuk menyahtukar sepenuhnya DNA, tetapi pada masa yang sama tidak mempunyai kesan yang ketara ke atas aktiviti polimerase DNA pada suhu tertentu.

Penyepuhlindapan. Suhu penyepuhlindapan (T A ) ialah salah satu parameter terpenting bagi tindak balas rantai polimerase. Suhu penyepuhlindapan untuk setiap buku asas tertentu dipilih secara individu. Ia bergantung kepada panjang dan komposisi nukleotida primer. Biasanya ia lebih rendah sebanyak 2 - 4 o Daripada nilai takat lebur (T m ) primer. Jika suhu penyepuhlindapan sistem adalah lebih rendah daripada optimum, maka bilangan serpihan yang dikuatkan tidak spesifik meningkat dan, sebaliknya, suhu yang lebih tinggi mengurangkan bilangan produk yang dikuatkan. Dalam kes ini, kepekatan amplikon tertentu boleh menurun dengan mendadak, sehingga perencatan tindak balas rantai polimerase (PCR). Meningkatkan masa penyepuhlindapan juga membawa kepada peningkatan dalam bilangan amplikon tidak spesifik.

Pemanjangan. Biasanya, setiap jenis polimerase DNA termostabil mempunyai suhu optimum individu untuk aktiviti. Kadar sintesis untaian DNA pelengkap oleh enzim juga khusus untuk setiap polimerase (secara purata ia adalah 30 - 60 nukleotida sesaat, atau 1 - 2 ribu bes seminit), oleh itu masa pemanjangan dipilih bergantung pada jenis DNA polimerase dan panjang kawasan yang diperkuatkan.

1.5.3 Prinsip asas untuk memilih primer

Apabila mencipta sistem ujian PCR, salah satu tugas utama ialah pemilihan primer yang betul, yang mesti memenuhi beberapa kriteria:

Primer mestilah khusus. Perhatian khusus diberikan kepada 3 - hujung primer, kerana dari mereka Taq polimerase mula melengkapkan untaian DNA pelengkap. Sekiranya kekhususan mereka tidak mencukupi, maka kemungkinan proses yang tidak diingini akan berlaku dalam tabung uji dengan campuran tindak balas, iaitu, sintesis DNA tidak spesifik (serpihan pendek atau panjang). Ia boleh dilihat pada elektroforesis dalam bentuk jalur tambahan berat atau ringan. Ini mengganggu penilaian hasil tindak balas, kerana mudah untuk mengelirukan produk amplifikasi tertentu dengan DNA asing yang disintesis. Sesetengah primer dan dNTP digunakan untuk sintesis DNA tidak spesifik, yang membawa kepada kehilangan sensitiviti yang ketara.

Primer tidak boleh membentuk dimer dan gelung, i.e. helai berganda yang stabil tidak boleh terbentuk akibat daripada primer yang menyelinap pada diri mereka sendiri atau antara satu sama lain.

1.5.4 Kesan dataran tinggi

Perlu diingatkan bahawa proses pengumpulan produk penguatan tertentu dalam janjang geometri hanya berlangsung untuk masa yang terhad, dan kemudian keberkesanannya menurun secara kritikal. Ini disebabkan oleh apa yang dipanggil kesan dataran tinggi.

Kesan jangka masa dataran tinggi digunakan untuk menerangkan proses pengumpulan produk PCR dalam kitaran amplifikasi terakhir.

Bergantung pada keadaan dan bilangan kitaran tindak balas penguatan, pada masa kesannya dicapai dataran tinggi dipengaruhi oleh penggunaan substrat (dNTP dan primer), kestabilan bahan tindak balas (dNTP dan enzim), jumlah perencat, termasuk pirofosfat dan dupleks DNA, persaingan untuk bahan tindak balas oleh produk tidak spesifik atau dimer primer, kepekatan produk tertentu dan denaturasi tidak lengkap pada kepekatan tinggi produk amplifikasi.

Semakin rendah kepekatan awal DNA sasaran, semakin tinggi risiko tindak balas akan gagal. dataran tinggi." Titik ini mungkin berlaku sebelum produk amplifikasi khusus mencukupi untuk dianalisis. Hanya sistem ujian yang dioptimumkan dengan baik boleh mengelakkan perkara ini.

1.5.5 Penyediaan sampel biologi

Untuk mengasingkan DNA, pelbagai teknik digunakan bergantung kepada tugasan yang ada. Intipatinya terletak pada pengekstrakan (ekstraksi) DNA daripada penyediaan biologi dan penyingkiran atau peneutralan kekotoran asing untuk mendapatkan penyediaan DNA dengan ketulenan yang sesuai untuk PCR.

Kaedah untuk mendapatkan penyediaan DNA tulen yang diterangkan oleh Marmur dianggap standard dan telah menjadi klasik. Ia termasuk proteolisis enzimatik diikuti dengan penyahproteinan dan represipitasi DNA dengan alkohol. Kaedah ini membolehkan anda mendapatkan penyediaan DNA tulen. Walau bagaimanapun, ia agak intensif buruh dan melibatkan kerja dengan bahan yang agresif dan berbau kuat seperti fenol dan kloroform.

Salah satu kaedah yang popular pada masa ini ialah kaedah pengekstrakan DNA yang dicadangkan oleh Boom et al. Kaedah ini adalah berdasarkan penggunaan agen chaotropic yang kuat, guanidine thiocyanate (GuSCN), untuk lisis sel dan penyerapan DNA seterusnya pada pembawa (manik kaca, tanah diatom, susu kaca, dll.). Selepas mencuci, DNA kekal dalam sampel, diserap pada pembawa, dari mana ia mudah dikeluarkan menggunakan penimbal elusi. Kaedah ini mudah, berteknologi maju dan sesuai untuk menyediakan sampel untuk amplifikasi. Walau bagaimanapun, kehilangan DNA mungkin disebabkan oleh penyerapan tidak dapat dipulihkan pada pembawa, dan juga semasa banyak pencucian. Ini amat penting apabila bekerja dengan sejumlah kecil DNA dalam sampel. Di samping itu, walaupun jumlah surih GuSCN boleh menghalang PCR. Oleh itu, apabila menggunakan kaedah ini, pilihan sorben yang betul dan pematuhan yang teliti terhadap nuansa teknologi adalah sangat penting.

Satu lagi kumpulan kaedah penyediaan sampel adalah berdasarkan penggunaan penukar ion jenis Chilex, yang, tidak seperti kaca, tidak menyerap DNA, sebaliknya, kekotoran yang mengganggu tindak balas. Sebagai peraturan, teknologi ini termasuk dua peringkat: mendidih sampel dan penyerapan kekotoran pada penukar ion. Kaedah ini sangat menarik kerana kesederhanaan pelaksanaannya. Dalam kebanyakan kes ia sesuai untuk bekerja dengan bahan klinikal. Malangnya, kadangkala terdapat sampel dengan kekotoran yang tidak boleh dibuang menggunakan penukar ion. Di samping itu, sesetengah mikroorganisma tidak boleh dimusnahkan dengan mendidih mudah. Dalam kes ini, adalah perlu untuk memperkenalkan peringkat tambahan pemprosesan sampel.

Justeru, pemilihan kaedah penyediaan sampel perlu diambil kira dengan pemahaman tentang tujuan analisis yang dimaksudkan.

1.5.6 Penguatan

Untuk menjalankan tindak balas penguatan, perlu menyediakan campuran tindak balas dan menambah sampel DNA yang dianalisis kepadanya. Adalah penting untuk mengambil kira beberapa ciri penyepuhlindapan primer. Hakikatnya, sebagai peraturan, sampel biologi yang dianalisis mengandungi pelbagai molekul DNA, yang mana primer yang digunakan dalam tindak balas mempunyai separa, dan dalam beberapa kes, homologi penting. Di samping itu, primer boleh menyelinap antara satu sama lain, membentuk dimer primer. Kedua-duanya membawa kepada penggunaan primer yang ketara untuk sintesis produk tindak balas sampingan (bukan khusus) dan, akibatnya, mengurangkan sensitiviti sistem dengan ketara. Ini menjadikannya sukar atau mustahil untuk membaca hasil tindak balas semasa elektroforesis.

1.6 Komposisi campuran tindak balas PCR standard

x Penampan PCR (larutan Tris-HCl 100 mM, pH 9.0, larutan KCl 500 mM, larutan MgCl2 25 mM ) …….2.5 µl

Air (MilliQ)……………………………………………………….18.8 µl

Campuran nukleotida trifosfat (dNTPs)

mM larutan setiap satu……………………………………………….0.5 µl

Primer 1 (larutan 10 mM) ………………………………………………………………….1 µl

Primer 2 (larutan 10 mM) ………………………………………………………………….1 µl

DNA polimerase (5 unit/µl) …………………………………………0.2 µl

Sampel DNA (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Penilaian keputusan tindak balas

Untuk menilai keputusan PCR dengan betul, adalah penting untuk memahami bahawa kaedah ini bukan kuantitatif. Secara teorinya, produk penguatan molekul DNA sasaran tunggal boleh dikesan menggunakan elektroforesis selepas 30-35 kitaran. Walau bagaimanapun, dalam amalan, ini hanya dilakukan dalam kes di mana tindak balas berlaku dalam keadaan yang hampir dengan ideal, yang tidak selalunya berlaku dalam kehidupan. Tahap ketulenan penyediaan DNA mempunyai pengaruh yang sangat besar terhadap kecekapan amplifikasi, i.e. kehadiran dalam campuran tindak balas perencat tertentu, yang dalam beberapa kes boleh menjadi sangat sukar untuk disingkirkan. Kadang-kadang, disebabkan kehadirannya, bahkan puluhan ribu molekul DNA sasaran tidak dapat dikuatkan. Oleh itu, selalunya tiada hubungan langsung antara jumlah awal DNA sasaran dan jumlah akhir produk amplifikasi.

Bab 2: Aplikasi Tindakbalas Rantaian Polimerase

PCR digunakan dalam banyak bidang untuk ujian dan eksperimen saintifik.

Forensik

PCR digunakan untuk membandingkan apa yang dipanggil "cap jari genetik." Sampel bahan genetik dari tempat kejadian diperlukan - darah, air liur, air mani, rambut, dll. Ia dibandingkan dengan bahan genetik suspek. Jumlah DNA yang sangat kecil sudah memadai, secara teorinya satu salinan. DNA dipecahkan kepada serpihan dan kemudian dikuatkan menggunakan PCR. Serpihan dipisahkan menggunakan elektroforesis DNA. Corak susunan jalur DNA yang terhasil dipanggil cap jari genetik.

Mewujudkan paterniti

Keputusan elektroforesis serpihan DNA yang dikuatkan oleh PCR. Bapa. anak. ibu. Kanak-kanak itu mewarisi beberapa ciri jejak genetik kedua-dua ibu bapa, menghasilkan jejak baharu yang unik.

Walaupun cap jari genetik adalah unik, hubungan kekeluargaan masih boleh diwujudkan dengan membuat beberapa cap jari. Kaedah yang sama boleh digunakan, diubah suai sedikit, untuk mewujudkan perkaitan evolusi antara organisma.

Diagnostik perubatan

PCR memungkinkan untuk mempercepat dan memudahkan diagnosis penyakit keturunan dan virus. Gen yang diminati dikuatkan oleh PCR menggunakan primer yang sesuai dan kemudian disusun untuk mengenal pasti mutasi. Jangkitan virus boleh dikesan serta-merta selepas jangkitan, minggu atau bulan sebelum gejala muncul.

Ubat peribadi

Kadang-kadang ubat menjadi toksik atau alergen bagi sesetengah pesakit. Sebab-sebab ini adalah sebahagiannya disebabkan oleh perbezaan individu dalam kerentanan dan metabolisme ubat-ubatan dan derivatifnya. Perbezaan ini ditentukan pada peringkat genetik. Sebagai contoh, dalam satu pesakit sitokrom tertentu mungkin lebih aktif, dalam yang lain - kurang. Untuk menentukan jenis cytochrome yang ada pada pesakit tertentu, adalah dicadangkan untuk menjalankan analisis PCR sebelum menggunakan ubat tersebut. Analisis ini dipanggil genotaip awal.

Pengklonan gen

Pengklonan gen ialah proses mengasingkan gen dan, sebagai hasil daripada manipulasi kejuruteraan genetik, memperoleh sejumlah besar produk gen tertentu. PCR digunakan untuk menguatkan gen, yang kemudiannya dimasukkan ke dalam vektor - sekeping DNA yang memindahkan gen asing ke dalam organisma yang sama atau lain yang sesuai untuk berkembang. Sebagai contoh, plasmid atau DNA virus digunakan sebagai vektor. Penyisipan gen ke dalam organisma asing biasanya digunakan untuk menghasilkan produk gen tersebut - RNA atau, selalunya, protein. Dengan cara ini, banyak protein diperolehi dalam kuantiti perindustrian untuk digunakan dalam pertanian, perubatan, dll.

Penjujukan DNA

Dalam kaedah penjujukan menggunakan dideoxynucleotides yang dilabelkan dengan label pendarfluor atau isotop radioaktif, PCR adalah bahagian penting, kerana semasa pempolimeran, terbitan nukleotida yang dilabel dengan label pendarfluor atau radioaktif dimasukkan ke dalam rantai DNA. Ini menghentikan tindak balas, membolehkan kedudukan nukleotida tertentu ditentukan selepas rantai yang disintesis dipisahkan dalam gel.

Mutagenesis

Pada masa ini, PCR telah menjadi kaedah utama untuk menjalankan mutagenesis. Penggunaan PCR telah memungkinkan untuk memudahkan dan mempercepatkan prosedur mutagenesis, serta menjadikannya lebih dipercayai dan boleh dihasilkan semula.

Kaedah PCR memungkinkan untuk menganalisis kehadiran jujukan papillomavirus manusia dalam bahagian biopsi tertanam parafin tumor serviks manusia 40 tahun sebelum kajian ini. Selain itu, menggunakan PCR, adalah mungkin untuk menguatkan dan mengklon serpihan DNA mitokondria daripada sisa fosil otak manusia berusia 7 ribu tahun!

Menggunakan lisat spermatozoa manusia individu, keupayaan untuk menganalisis dua lokus secara serentak yang terletak pada kromosom bukan homolog berbeza telah ditunjukkan. Pendekatan ini memberikan peluang unik untuk analisis genetik yang baik dan kajian penggabungan semula kromosom, polimorfisme DNA, dan lain-lain. Kaedah menganalisis sperma individu serta-merta menemui aplikasi praktikal dalam perubatan forensik, kerana penaipan HLA sel haploid memungkinkan untuk menentukan paterniti atau mengenal pasti. seorang penjenayah (kompleks HLA ialah satu set gen kompleks histokompatibiliti utama manusia; lokus kompleks HLA adalah yang paling polimorfik daripada semua yang diketahui dalam vertebrata yang lebih tinggi: dalam spesies, pada setiap lokus terdapat sejumlah besar alel berbeza yang luar biasa. - bentuk alternatif gen yang sama).

Menggunakan PCR, adalah mungkin untuk menentukan integrasi yang betul bagi struktur genetik asing ke dalam kawasan genom sel yang dikaji yang telah ditetapkan. Jumlah DNA selular disepuhlindapkan kepada dua primer oligonukleotida, satu daripadanya adalah pelengkap kepada sebahagian daripada DNA perumah berhampiran titik sisipan, dan satu lagi kepada urutan serpihan bersepadu dalam helai DNA antiselari. Tindak balas rantai polimerase, dalam kes struktur DNA kromosom yang tidak berubah di tapak sisipan yang dimaksudkan, membawa kepada pembentukan serpihan DNA untai tunggal yang tidak diketahui saiznya, dan dalam kes sisipan yang dirancang, serpihan DNA untai dua bagi suatu saiz yang diketahui, ditentukan oleh jarak antara tapak penyepuhlindapan dua primer. Selain itu, tahap penguatan rantau genom yang dianalisis dalam kes pertama akan bergantung secara linear pada bilangan kitaran, dan dalam kes kedua ia akan menjadi eksponen. Pengumpulan eksponen serpihan yang dikuatkan dengan saiz yang telah ditetapkan semasa PCR membolehkan kita memerhatikannya secara visual selepas pecahan elektroforesis penyediaan DNA dan membuat kesimpulan yang tidak jelas tentang penyisipan urutan asing ke dalam kawasan DNA kromosom tertentu.

Kesimpulan

Kaedah PCR kini paling meluas digunakan sebagai kaedah untuk mendiagnosis pelbagai penyakit berjangkit. PCR membolehkan anda mengenal pasti etiologi jangkitan walaupun sampel yang diambil untuk analisis mengandungi hanya beberapa molekul DNA patogen. PCR digunakan secara meluas dalam diagnosis awal jangkitan HIV, hepatitis virus, dll. Hari ini hampir tiada agen berjangkit yang tidak dapat dikesan menggunakan PCR.

Senarai sastera terpakai

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Kaedah analisis genetik molekul. - Mn.: Unipol, 2007. - 176 p.

2.PCR "masa nyata" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. dan lain-lain; diedit oleh d.b. n. D.V. Rebrikova; mukadimah L.A. Osterman dan ahli akademik RAS dan RAAS E.D. Sverdlov; ed. ke-2, rev. dan tambahan - M.: BINOM. Makmal Pengetahuan, 2009. - 223 p.

.Patrushev L.I. Sistem genetik buatan. - M.: Nauka, 2005. - Dalam 2 jilid.

.B. Glick, J. Pasternak Molekul bioteknologi. Prinsip dan Aplikasi 589 hlm., 2002

5.Shchelkunov S.N. Kejuruteraan genetik. - Novosibirsk: Sib. Univ. rumah penerbitan, 2004. - 496 p.

Disunting oleh A.A. Vorbyeva "Tindak balas rantai polimerase dan aplikasinya untuk diagnostik dalam dermatovenerologi"; Agensi berita perubatan - 72 muka surat

http://ru. wikipedia.org

http://ulama. google.ru

Http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - jurnal perubatan

Bimbingan

Perlukan bantuan mempelajari topik?

Pakar kami akan menasihati atau menyediakan perkhidmatan tunjuk ajar mengenai topik yang menarik minat anda.
Hantar permohonan anda menunjukkan topik sekarang untuk mengetahui tentang kemungkinan mendapatkan perundingan.