Reticulocitele sunt globule roșii tinere formate după ce normoblastele își pierd nucleul. O trăsătură caracteristică a reticulocitelor este prezența în citoplasma lor a unei substanțe granular-filamentoase (reticul), care reprezintă ribozomi și mitocondrii agregate.
1.) Numărarea numărului de reticulocite dintr-un frotiu după colorarea lor cu coloranți speciali.
Această metodă este în practică cea mai utilizată metodă datorită faptului că este simplă, destul de ieftină și nu necesită echipamente costisitoare speciale și, în consecință, poate fi utilizată în orice laborator de diagnostic clinic.
Principiul metodei se bazează pe identificarea substanței granular-reticulare a reticulocitelor în timpul colorării supravitale cu vopsele alcaline (soluție saturată de albastru de cresil strălucitor în alcool absolut / soluție Azur I / soluție Azur II) cu numărarea în continuare a acestora într-un frotiu de sânge. Colorarea reticulocitelor se efectuează fie pe sticlă, fie într-o eprubetă. Numărarea se efectuează cu ajutorul unui microscop: frotiurile preparate folosind una dintre metodele de mai sus sunt examinate microscopic cu o lentilă de imersie; în frotiu, reticulocitele și eritrocitele sunt colorate gălbui-verzui, substanța granular-filamentoasă din reticulocite este albastră (când este colorată cu azur II și albastru cresil strălucitor) sau albăstrui-violet (când este colorată cu azur I).
2.) Numărarea numărului de reticulocite folosind microscopia cu fluorescență.
Această metodă este simplă și necesită puțin timp, este mai precisă decât metoda convențională, deoarece microscopia fluorescentă dezvăluie cele mai mici granule ale unei substanțe filamentoase, dar este posibilă numai cu un microscop fluorescent și coloranți speciali și, prin urmare, este disponibilă numai la câteva laboratoare .
Principiul numărării numărului de reticulocite folosind microscopia fluorescentă se bazează pe capacitatea substanței reticulocite de a fluoresce după tratarea sângelui cu portocală de acridină. Sângele este amestecat cu portocaliu de acridină într-o eprubetă sau mixer într-un raport de 1 parte sânge și 10 părți vopsea (amestecul poate fi păstrat cel mult 5 ore). Amestecul se agită timp de 2 minute, o picătură din amestec se aplică pe o lamă de sticlă și se acoperă cu o lamă. În acest caz, lichidul nu trebuie să treacă dincolo de lamelă.
Microscopie folosind un filtru de lumină ZhS-17. În preparat, celulele roșii din sânge au contururi de culoare verde închis și nu au fluorescență, iar în reticulocite, substanța cu plasă granulară strălucește roșu aprins, făcând reticulocitele ușor de numărat. În sângele stabilizat cu heparină sau citrat de sodiu nu se observă fluorescența reticulocitelor.
3.) Numărarea automată a reticulocitelor folosind un analizor hematologic.
În analizoarele hematologice moderne, tehnologia de numărare a celulelor sanguine se bazează pe metoda conductometrică propusă de H. Wallace și Joseph R. Culter în 1947. Principiul metodei este de a număra numărul și de a determina natura impulsurilor care apar atunci când un celula trece printr-un orificiu de diametru mic (deschidere), pe ambele părți ale căruia există doi electrozi izolați unul de celălalt. Fiecare trecere a unei celule prin deschidere este însoțită de apariția unui impuls electric, care este înregistrat de un senzor electronic. Împărțirea celulelor în categorii (eritrocite, leucocite, trombocite, sedimente) este efectuată de dispozitiv pe baza unei analize a amplitudinii impulsurilor primite. Pentru a determina concentrația de celule, este suficient să treceți un anumit volum de probă prin canal și numărați numărul de impulsuri care sunt generate.
Trebuie remarcat faptul că, pe lângă parametrul clasic al reticulocitelor - conținutul relativ (%) al reticulocitelor (RET%, procent din reticulocite), determinat folosind metodele 1 și 2 de diagnosticare de laborator, în legătură cu apariția high-tech. analizoare hematologice (metoda 3) a devenit posibil să se obțină (de exemplu, folosind un colorant fluorescent patentat pentru analizorul Sysmex-XT-2000i) parametri informativi suplimentari reticulocitelor:
reticulocite cu conținut scăzut de ARN, cele mai mature (LFR%, fracțiuni de reticulocite cu fluorescență scăzută);
reticulocite cu conținut mediu de ARN (MFR%, fracțiuni de reticulocite cu fluorescență medie) - fracțiune de reticulocite cu fluorescență medie);
reticulocite cu conținut ridicat de ARN (HFR%, fracții de reticulocite cu fluorescență ridicată) - o fracțiune de reticulocite cu fluorescență ridicată);
fracțiunea de reticulocite imature (IRF%, Fracția de reticulocite imature).
Diferențierea reticulocitelor, pe baza gradului de maturitate și, în consecință, a conținutului de acizi nucleici, este o reflectare a activității hematopoietice a măduvei osoase.
Metodologie (analizor Sysmex -XT- 2000i). Într-o celulă cu flux, celulele traversează un fascicul laser semiconductor, provocând împrăștierea fasciculului la unghi înalt și la unghi scăzut și excitarea unui colorant fluorescent. Acest lucru face posibilă determinarea diferitelor stadii de maturitate a reticulocitelor pe baza conținutului de ARN din celule și a intensității luminiscenței acestora. Numărarea automată a reticulocitelor este foarte precisă (se numără mai mult de 30.000 de globule roșii) și reproductibilă (coeficientul de variație este de aproximativ 6%). Această tehnologie asigură numărarea precisă a reticulocitelor chiar și la concentrații extrem de scăzute.
Deținătorii brevetului RU 2612018:
Invenția se referă la medicină, și anume la diagnosticarea de laborator, și poate fi utilizată pentru a număra automat numărul de reticulocite pe analizoarele de frotiuri de sânge. Esența invenției: după colorarea supravitală inițială a reticulocitelor cu albastru cresil strălucitor, frotiurile sunt fixate suplimentar și colorate cu fixativ May-Grunwald timp de 1 minut, spălate cu apă curentă, reticulocite uscate și numărate pe un analizor automat de frotiuri de sânge. Rezultat tehnic: precizie crescută și accelerare a numărării reticulocitelor. 2 ill., 3 av.
Invenția se referă la medicină, și anume la diagnosticarea de laborator, și poate fi utilizată pentru a număra automat numărul de reticulocite pe analizoarele de frotiuri de sânge.
Cantitatea și compoziția calitativă a reticulocitelor sunt unul dintre indicatorii importanți care caracterizează eficiența hematopoiezei, iar numărarea lor este utilizată pe scară largă în timpul examinărilor preventive în masă și este reglementată de o serie de ordine. Utilizarea analizoarelor automate de frotiu de sânge vă permite să automatizați evaluarea compoziției celulare a unui frotiu de sânge colorat conform Romanovsky-Giemsa. Cu toate acestea, numărarea reticulocitelor în astfel de frotiuri este imposibilă, datorită faptului că substanța reticulofilamentoasă nu este detectată atunci când este colorată conform Romanovsky-Giemsa.
Există o metodă cunoscută pentru numărarea numărului de reticulocite după colorarea supravitală într-un frotiu de sânge special pregătit [Metode de cercetare de laborator în clinică: Manual / Menshikov V.V., Delktorskaya L.N., Zolotnitskaya R.P. si etc.; Ed. V.V. Menșikov. - M.: Medicină, 1987, - 368 p.: ill., p. 118-119]. Pentru a face acest lucru, sângele colectat cu un anticoagulant (etilendiamidă tetraacetat, heparină sau citrat de sodiu) este amestecat cu o soluție de colorant strălucitor de cresyl blue (diamond cresyl blue), amestecul este incubat timp de 30 de minute și se prepară un frotiu subțire. Cu toate acestea, atunci când se utilizează analizoare automate de frotiu de sânge, această metodă de colorare a reticulocitelor dă rezultate inexacte ale numărului de reticulocite. Acest lucru se datorează faptului că, prin această metodă de colorare, celulele roșii din sânge sunt colorate palide, în diverse nuanțe de galben-albastru, ceea ce face dificilă recunoașterea automată a celulelor și identificarea substanței reticulofilamentoase, care se colorează și în albastru-verde (Fig. 1).
Rezultat tehnic: precizie crescută și accelerare a numărării reticulocitelor.
Acest rezultat se obține prin schimbarea protocolului de colorare și prin utilizarea analizoarelor automate de frotiuri de sânge.
Metoda este explicată în fotografii, unde prima fotografie (Fig. 1) arată rezultatul colorării tradiționale a reticulocitelor (prototip); eritrocitele sunt vopsite în diferite nuanțe de albastru-verzui, în două dintre ele se remarcă substanța reticulo-filimentară albastră a reticulocitelor. O altă fotografie arată rezultatul utilizării metodei propuse pentru prepararea unui frotiu de sânge: celulele roșii din sânge sunt vopsite în roșu aprins pe fundalul cărora substanța reticulo-filamentoasă a reticulocitelor este vopsită în albastru strălucitor (Fig. 2).
Metoda se realizează după cum urmează.
Sângele subiectului este luat cu un anticoagulant, de exemplu, sarea de potasiu a acidului etilendiaminotetraacetic. Colorația supravitală a reticulocitelor se realizează folosind albastru de cresil strălucitor (albastru de cresil diamant). Se adaugă 0,4 ml de soluție de colorant la 0,1 ml de sânge integral și se incubează timp de 30 de minute. Apoi se prepară un frotiu subțire din amestecul rezultat. După ce frotiul s-a uscat, acesta este fixat suplimentar și vopsit cu vopsea fixativă May-Grunwald. Pentru a face acest lucru, puneți frotiul uscat într-un recipient cu o vopsea fixatoare timp de 1 minut, apoi scoateți-l din recipient și spălați-l cu apă curentă. După uscare, medicamentul este examinat pe analizoare de frotiu de sânge, de exemplu, Vision Hema ® (PRODUS FIRM MEDICA, Rusia). Eritrocitele sunt colorate în roșu, față de care substanța reticulofilamentoasă albastră este clar vizibilă în reticulocite (Fig. 2). Se recoltează și se analizează globulele roșii, cel puțin 1000 de bucăți. Numărul de globule roșii care conțin substanță reticulofilamentoasă este numărat în raport cu toate globulele roșii colectate. Rezultatul este exprimat ca procent.
Următoarele soluții sunt utilizate pentru a colora frotiurile de sânge:
1) o soluție de albastru de cresyl strălucitor în alcool absolut. Pentru a prepara alcool absolut, este necesar să se înmoaie etanol 96% în mai multe schimbări de sulfat de cupru calcinat (până când pulberea de sulfat de cupru anhidru nu mai devine albastră). Pentru 100 ml de alcool absolut, luați 1,2 g de vopsea (Tehnologii și diagnostice de laborator medical: Director. Tehnologii de laborator medical / Editat de Prof. A.I. Karpishchenko. - Sankt Petersburg; Intermedica, 2002. - 408 p. P.284 ).
2) Vopsea fixatoare May-Grunwald - 1 g de vopsea uscata trebuie dizolvat in 1 litru de alcool metilic. (Tehnologii și diagnostice de laborator medical: Director. Tehnologii de laborator medical / Editat de Prof. A.I. Karpishchenko. - Sankt Petersburg; Intermedica, 2002. - 408 p. p. 277).
Exemple de implementare specifică:
Exemplul 1. Pacientul I., 48 ani. A fost supus controalelor periodice, ca un angajat al unei rafinării de petrol. De la pacient s-a recoltat sânge cu un anticoagulant (sare de potasiu a acidului etilendiaminoacetic) și s-au preparat 2 frotiuri. Reticulocitele dintr-un frotiu au fost colorate prin metoda tradițională, folosind doar albastru cresyl strălucitor. Reticulocitele din al doilea frotiu au fost colorate conform metodei propuse. Pentru a face acest lucru, 0,1 ml de sânge a fost amestecat cu o soluție de albastru de cresyl strălucitor și incubat timp de 30 de minute. Apoi a fost luat un frotiu de sânge subțire. După uscare, frotiul de sânge a fost în continuare fixat și colorat prin scufundarea lui în vopsea fixativă May-Grunwald. Numărul de reticulocite din frotiuri a fost determinat folosind un analizor de frotiuri de sânge Vision Hema ® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Rusia) și manual la microscop cu lumină (Meiji, Japonia).
Numărul de reticulocite numărate pe un analizor de frotiu de sânge cu colorare tradițională a fost de 1,5%, ceea ce a depășit intervalul normal de referință, iar într-un frotiu colorat cu metoda propusă, a fost de 0,9%, ceea ce corespunde valorilor normale pentru un adult. La numărarea manuală a reticulocitelor, numărul lor în aceleași frotiuri a fost de 0,8%, respectiv 0,9%. Acest lucru indică o creștere a preciziei numărării pe analizoarele de frotiuri de sânge atunci când se utilizează metoda propusă de preparare a frotiurilor. În același timp, viteza de studiu a reticulocitelor pe un analizor de frotiuri de sânge a fost de 48 și 54 de secunde, în timp ce numărarea manuală a reticulocitelor a durat 270 și 238 de secunde.
Astfel, acest exemplu demonstrează că colorarea reticulocitelor propusă atunci când se utilizează analizoare de frotiu de sânge duce la o acuratețe crescută a rezultatelor și la o numărare mai rapidă a reticulocitelor.
Exemplul 2. Pacientul Z. A fost internat în secția de hematologie a KMSCH 1 din Perm cu un diagnostic de anemie aplastică. Ca parte a protocolului de examinare, a fost efectuată un număr de reticulocite. Pacientului i s-a extras sânge cu un anticoagulant (sare de potasiu a acidului etilendiaminoacetic) și s-au pregătit 2 frotiuri. Reticulocitele dintr-un frotiu au fost colorate prin metoda tradițională, folosind doar albastru cresyl strălucitor. Reticulocitele din al doilea frotiu au fost colorate conform metodei propuse. Pentru a face acest lucru, 0,1 ml de sânge a fost amestecat cu o soluție de albastru de cresyl strălucitor și incubat timp de 30 de minute. Apoi a fost luat un frotiu de sânge subțire. După uscare, frotiul de sânge a fost în continuare fixat și colorat prin scufundarea lui în vopsea fixativă May-Grunwald. Numărul de reticulocite din frotiuri a fost determinat folosind un analizor de frotiuri de sânge Vision Hema ® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Rusia) și manual la microscop cu lumină (Meiji, Japonia).
Numărul de reticulocite numărate pe un analizor de frotiu de sânge într-un frotiu colorat în mod tradițional a fost de 0,3%, într-un frotiu colorat folosind o metodă modificată - 0,2%. Când se numără manual, rezultatul este 0,2% și 0,2%. În același timp, viteza de numărare a reticulocitelor pe un analizor de frotiu de sânge a fost de 58 și 52 de secunde, în timp ce numărarea manuală a reticulocitelor a durat 302 și 338 de secunde.
În acest caz, din cauza conținutului scăzut de reticulocite, nu s-au constatat diferențe semnificative în ceea ce privește rezultatele, totuși, este de remarcat rezultatul oarecum umflat obținut pe un analizor de frotiu de sânge la examinarea unui frotiu colorat în mod obișnuit. La fel ca în exemplul precedent, a fost demonstrată o accelerare semnificativă (de aproape 5 ori accelerare a numărării reticulocitelor).
Exemplul 3. Pacienta K. Internată în secția de patologie neonatală a Spitalului Clinic Orășenesc de Copii Nr. 13 din Perm cu diagnostic de boală hemolitică a nou-născuților. Ca parte a protocolului de examinare, s-a efectuat un număr de OAK cu un număr de reticulocite. Pacientului i s-a extras sânge cu un anticoagulant (sare de potasiu a acidului etilendiaminoacetic) și s-au pregătit 2 frotiuri. Reticulocitele dintr-un frotiu au fost colorate prin metoda tradițională, folosind doar albastru cresyl strălucitor. Reticulocitele din al doilea frotiu au fost colorate folosind metoda propusă. Pentru a face acest lucru, 0,1 ml de sânge a fost amestecat cu o soluție strălucitoare de albastru cresil și incubat timp de 30 de minute. Apoi a fost luat un frotiu de sânge subțire. După uscare, frotiul de sânge a fost în continuare fixat și colorat prin scufundarea lui în vopsea fixativă May-Grunwald. Numărul de reticulocite din frotiuri a fost determinat folosind un analizor de frotiuri de sânge Vision Hema ® Pro (FIRM MEDICA PRODUCT, Rusia) și manual la microscop cu lumină (Meiji, Japonia).
Numărul de reticulocite numărate pe un analizor de frotiu de sânge într-un frotiu colorat în mod tradițional a fost de 30,3%, într-un frotiu colorat folosind o metodă modificată - 21,2%. Când se numără manual, rezultatul este de 20,6% și 22,4%. În același timp, viteza de numărare a reticulocitelor pe un analizor de frotiuri de sânge a fost de 52 și 51 de secunde, în timp ce numărarea manuală a reticulocitelor a durat 298 și 304 de secunde.
Acest exemplu demonstrează o scădere a preciziei numărării reticulocitelor pe analizoarele de frotiu de sânge în lamele de sticlă colorate cu metoda tradițională, în special cu un conținut ridicat de reticulocite. Utilizarea unei noi metode de colorare a frotiurilor a condus la o coincidență aproape completă a rezultatelor numărării reticulocitelor pe un analizor automat și manual, în timp ce viteza de numărare a reticulocitelor a crescut de peste 5 ori.
O metodă de preparare a frotiurilor de sânge pentru numărarea reticulocitelor prin colorarea supravitală a reticulocitelor cu albastru de cresil strălucitor, caracterizată prin aceea că, după colorarea cu albastru de cresil strălucitor, frotiurile sunt fixate suplimentar și colorate cu fixativ May-Grunwald timp de 1 minut, spălate cu apă curentă, uscate iar reticulocitele sunt numărate pe analizor automat de frotiuri de sânge.
Brevete similare:
Invenția se referă la diagnosticare, și anume la o metodă pentru prezicerea dezvoltării complicațiilor purulente ale necrozei pancreatice. O metodă pentru prezicerea dezvoltării complicațiilor purulente ale necrozei pancreatice este aceea că la un pacient cu necroză pancreatică sterilă, începând cu a cincea zi de la debutul bolii, activitatea alfa-amilazei în sânge, conținutul de proteine totale, Se determină limfocitele, monocitele din sânge, raportul albumină și globulinele din serul sanguin, severitatea stării pacientului conform următoarelor scale SAPS, SOFA, SIRS, prezența infiltratului parapancreatic, pareza tractului gastrointestinal, acută. acumularea de lichid în bursa epiploană sau țesutul retroperitoneal și calculați indicele de infecție cu necroză pancreatică (IPNI) folosind formula.
Un grup de invenții se referă la determinarea concentrației unui analit într-un fluid biologic pe baza dependențelor obținute ale valorii curente în timp. O metodă pentru determinarea concentrației unui analit într-un fluid fiziologic include plasarea unui reactiv pentru interacțiunea cu analitul într-un fluid fiziologic între primul electrod și al doilea electrod, aplicarea fluidului fiziologic la reactiv, transformarea analitului în fluid fiziologic și excitarea unui curent nestaționar de la fiecare dintre primul și al doilea electrod, determinarea vârfului curentului nestaționar pentru fiecare dintre primul și al doilea electrod, măsurarea unei valori a curentului tranzitoriu la un moment dat decalat față de vârful fiecărui curent tranzitoriu de la fiecare dintre primul și al doilea electrod, în care decalajul de timp pentru primul electrod cuprinde un prim decalaj de timp față de vârful curentului tranzitoriu al primului electrod, iar decalajul de timp de la vârful de curent tranzitoriu al celui de-al doilea electrod cuprinde un al doilea decalaj de timp diferit de primul offset de timp și calcularea unei concentrații de analit pe baza valorilor curente măsurate ale primului și celui de-al doilea electrod în etapa de măsurare.
Invenția se referă la medicină și este o metodă de determinare a sindromului de durere din cauza polineuropatiei la pacienții cu boală de vibrație, inclusiv recoltarea sângelui venos, obținerea serului sanguin și determinarea conținutului cantitativ de serotonina din acesta.
Invenţia se referă la medicină, şi anume la pneumologie, şi se referă la o metodă de alegere a duratei terapiei cu ceruloplasmină la pacienţii cu astm bronşic. Esența metodei este că la pacienții cu astm bronșic, superoxid dismutază (SOD) și malonaldehidă (MA) și raportul lor MDA/SOD sunt determinate în sânge după tratamentul cu Ceruloplasmină în doză de 100 mg intravenos o dată pe zi timp de 7 zile.
Invenția se referă la ihtiologie și piscicultură și este o metodă de testare a stării fiziologice a peștilor sturion, inclusiv studiul serului sanguin de pește, caracterizată prin aceea că serul sanguin este examinat prin metoda deshidratării marginilor în celulele analitice și o analiză morfologică. a structurilor rezultate se efectuează în modul de microscopie convențional la diferite măriri, la În acest caz, formele dendritice și de tranziție sunt indicatori ai normei de homeostazie, iar prezența structurilor lamelare indică modificări care apar în corpul peștelui.
Invenţia se referă la medicină, şi anume la transplantul de organe şi diagnosticul clinic de laborator. La 3-4 săptămâni după transplantul de ficat, concentrația factorului de creștere transformant beta 1 (TGF-β1) în ng/ml este măsurată în plasma sanguină a copiilor.
Invenţia se referă la domeniul medicinei şi se referă la o metodă de diagnosticare a severităţii unui atac la pacienţii cu boala Crohn. Esența metodei este că se determină viteza de sedimentare a eritrocitelor (VSH), concentrația de proteină C reactivă (CRP), nivelul factorului vasculoendotelial (VEF) în ser, numărul de celule endoteliale descuamate (DEC) în se calculează plasma sanguină și se evaluează concentrația de microalbumină (MAU).
Invenţia se referă la supape de închidere utilizate pentru medii gazoase şi pot fi utilizate, în special, în recipiente de prelevare de probe. Supapa etanșă la gaz conține o bază 1, un corp 2, cel puțin patru inele de etanșare 5, 6, 7 și 8 realizate dintr-un material polimeric elastic și un ax 3 cu o bobină 3a.
Numărarea reticulocitelor într-un frotiu după colorarea lor cu coloranți speciali
Principiul metodei: Detectarea substanței granulo-reticulare a reticulocitelor în timpul colorării supravitale cu vopsele alcaline cu numărarea în continuare a acestora într-un frotiu de sânge.
Puteți utiliza unul dintre următorii coloranți: Azur soluție I;
Procedura de determinare: Colorarea se efectuează fie pe sticlă, fie într-o eprubetă.
Colorarea reticulocitelor într-o eprubetă cu Azure II
Într-o eprubetă se pun 0,05 ml de soluție de vopsea azure II și 0,2 ml de sânge. Amestecul se amestecă bine și se lasă timp de 20 - 30 de minute. Se amestecă din nou și se prepară frotiuri subțiri.
Colorarea reticulocitelor într-o eprubetă cu Azure I
Puneți 0,3–0,5 ml de soluție de colorant azur I și 5–6 picături de sânge într-o eprubetă folosind o pipetă dintr-un aparat Panchenkov. Eprubeta se inchide cu dop de cauciuc, amestecul se amesteca bine dar cu grija si se lasa 1 - 1,5 ore (reticulocitele se pateaza mai bine la o expunere de 1,5 - 3 ore). Se amestecă și se prepară frotiuri subțiri.
Frotiurile preparate sunt examinate microscopic cu o lentilă de imersie. În frotiu, reticulocitele și eritrocitele sunt colorate gălbui-verzui, substanța granular-filamentoasă din reticulocite este albastră (când sunt colorate cu azur II) sau albăstrui-violet (când sunt colorate cu azur I).
Reticulocitele sunt un indicator important al capacitatii de regenerare a maduvei osoase. O creștere a acestora în sângele periferic (reticulocitoză) se observă în anemie hemolitică, în crize hemolitice, în pierderi acute de sânge, malarie, în tratamentul anemiei feriprive cu fier, în deficiența acută de oxigen. Prezența unui număr crescut de reticulocite permite suspectarea sângerării ascunse (de exemplu, la pacienții cu febră tifoidă, ulcer peptic).
O scădere a numărului sau absența reticulocitelor (reticulocitopenie) se observă în anemia aplastică și hipoplazică generativă; anemie cauzată de insuficiență de fier, vitamina B12, acid folic; cu metastaze canceroase la os; boala de radiații; terapie cu radiatii; tratament cu citostatice.
Tehnica de realizare a testului Rivalta.
Testul Rivalta este un test biochimic pentru diferențierea transudatului și exsudatului.
Tehnica este următoarea: Exudatele conțin seromucină (un compus de natură globulină), care dă un test pozitiv (denaturare) cu o soluție slabă de acid acetic. În cilindru se toarnă 100-150 ml apă distilată, se acidulează cu 2-3 picături de acid acetic glacial și se adaugă picătură cu picătură lichidul de testat. O picătură de exsudat care cade formează un nor sub forma unui nor alb care coboară la fundul vasului. O picătură de transudat nu formează turbiditate sau este nesemnificativă și se dizolvă rapid. În ciuda acestor diferențe între exsudate și transudate, nu este întotdeauna ușor să le distingeți în practică, deoarece uneori trebuie să aveți de-a face cu o serie de fluide de tranziție, precum și cu exsudate, care sunt aproape de transudate în conținutul de proteine și densitatea relativă.
Reticulocitele sunt globule roșii tinere formate după ce normoblastele își pierd nucleul.
O trăsătură caracteristică a reticulocitelor este prezența unei substanțe cu ochiuri granulare, care apare cu colorare supravitală, adică fără fixarea prealabilă a celulelor.
Prezentat la microscop electronic că structurile granulo-reticulare reprezintă rămășițe ale reticulului endoplasmatic, ribozomi și mitocondrii care conțin ARN. În reticulocite, proteinele (globina), hemul, purinele, nucleotidele pirimidinice, fosfatidele și lipidele sunt sintetizate într-o mică măsură, dar ARN-ul nu este sintetizat în ele. Timp de 2 zile, reticulocitul rămâne în sânge, după care, pe măsură ce ARN-ul scade, devine un eritrocit matur.
În frotiurile colorate prin metode hematologice convenționale, reticulocitele sunt de culoare gri-roz - policromatofile, adică. vopsite cu diferite vopsele.
Metode de numărare a reticulocitelor
În prezent, se utilizează o metodă unificată pentru a număra numărul de reticulocite după colorarea acestora
- albastru cresyl strălucitor,
- Azure I sau
- Azure II direct pe sticlă sau într-o eprubetă.
1. Principiul metodei
Detectarea substanței granulare-reticulare a eritrocitelor atunci când sunt colorate cu vopsele alcaline cu numărarea lor în continuare într-un frotiu de sânge.
2. Reactivi:
a) o soluție saturată de albastru de cresil strălucitor în alcool absolut(pentru a prepara alcool absolut, trebuie să înmuiați 96% etanol în mai multe schimbări de pulbere de sulfat de cupru calcinat): 1,2 g de vopsea la 100 ml de alcool;
b) soluţie azurie I: azur I - 1 g, oxalat de amoniu - 0,4 g, clorură de sodiu - 0,8 g, alcool etilic 96% - 10 ml, apă distilată - 90 ml. Soluția de vopsea într-o sticlă închisă se pune într-un termostat la 37 °C timp de 2-3 zile și se agită energic periodic. Apoi se răcește la temperatura camerei și se filtrează printr-un filtru de hârtie. Soluția se păstrează într-un recipient de sticlă de culoare închisă. Dacă apar sedimente, vopseaua trebuie filtrată din nou;
c) Soluția Azur II: azur II - 1 g, citrat de sodiu - 5 g, clorură de sodiu - 0,4 g, apă distilată - 45 ml. Soluția se lasă într-un termostat la 37 °C timp de 2 zile, amestecând ocazional. Pentru a accelera dizolvarea, vopseaua poate fi încălzită la foc mic timp de 15-20 de minute, fără a o aduce la fierbere. Se răcește la temperatura camerei și se filtrează. A se păstra în recipiente de sticlă închisă la culoare.
3. Colorare
Colorare pe sticla:
- o lamă de sticlă bine spălată și degresată se încălzește peste flacăra unui arzător. Folosind o baghetă de sticlă, aplicați o picătură dintr-unul dintre coloranți pe sticlă și pregătiți un frotiu de vopsea folosind sticlă șlefuită. Marcați partea sticlei pe care este aplicată vopsea cu un steklograf. În această formă, sticla poate fi pregătită pentru utilizare ulterioară și depozitată într-un loc uscat și întunecat;
- Pe paharul astfel preparat se aplică o picătură de sânge, se face un frotiu subțire, iar paharul se pune imediat într-o cameră umedă. Pentru a face acest lucru, utilizați un vas Petri cu capac, în care sunt plasate rulouri de tifon sau bumbac ușor umezite în jurul marginilor;
- Frotiurile sunt păstrate într-o cameră umedă timp de 3-5 minute și apoi uscate la aer. Substanța granulară a reticulocitelor este vopsită în albastru-violet, iese în evidență pe fundalul verzui-albăstrui al eritrocitelor.
Colorare in vitro:
- metoda 1:Înainte de utilizare, pregătiți o soluție de lucru de albastru cresyl strălucitor într-o eprubetă pe bază de o picătură de soluție de oxalat de potasiu 1%, 4 picături de soluție de vopsea 1. Adăugați 40 μl de sânge în vopsea (două pipete până la marcajul 0,02). Amestecul se amestecă bine, dar ușor și se lasă timp de 30 de minute. Se amestecă și se prepară frotiuri subțiri;
- metoda 2:Într-o eprubetă se pun 0,05 ml soluție de colorant 3 și 0,2 ml sânge. Amestecul este bine amestecat și lăsat timp de 20-30 de minute. Se amestecă și se prepară frotiuri subțiri;
- metoda 3: 0,3–0,5 ml de soluție de vopsea 2 și 5–6 picături de sânge sunt plasate într-o eprubetă folosind o pipetă de la un aparat Panchenkov. Eprubeta este închisă cu un dop de cauciuc, amestecul este bine, dar cu grijă, amestecat și lăsat timp de 1-1½ ore (reticulocitele sunt mai bine colorate la o expunere de 1½-3 ore). Se amestecă și se prepară frotiuri subțiri.
4. Numărul de reticulocite
În frotiuri, celulele roșii din sânge sunt colorate gălbui-verzui, substanța granulară-filamentoasă este albastră sau albăstruie-violet.
- Frotiurile preparate folosind una dintre metodele de mai sus sunt examinate microscopic cu o lentilă de imersie;
- este necesar să se numără cel puțin 1000 de globule roșii și să se noteze printre acestea numărul de globule roșii care conțin o substanță granular-filamentoasă. Pentru frotiuri subțiri uniforme în care globulele roșii sunt situate pe un rând, selectați un câmp vizual în care există, de exemplu, 50 de globule roșii, apoi calculați 20 de astfel de câmpuri vizuale;
- În practică, pentru o mai mare acuratețe, se utilizează un ocular special, în care câmpul vizual poate fi redus la dimensiunea necesară. Dacă nu aveți un ocular gata făcut, îl puteți pregăti cu ușurință deșuruband ocularul ×7, punând o bucată de hârtie cu un pătrat mic decupat și înșurubând-o. Numărul de reticulocite numărate este exprimat la 1000 sau la 100 de globule roșii.
Conținutul cantitativ al reticulocitelor
NORMAL: 0,5–1,2% (30–70 × 10 9 /l)
Se observă o creștere a numărului de reticulocite cu:
- pierderi de sânge (în special acute);
- anemie hemolitică, în special în timpul unei crize (până la 20–30%);
- pe fondul tratamentului anemiei megaloblastice cu vitamina B12 (criza reticulocitelor - o creștere a numărului de reticulocite în a 4-a-8-a zi de tratament).
O scădere a numărului de reticulocite este caracteristică pentru:
- anemie aplastică și hipoplazică;
- anemie megaloblastică netratată;
- boala de radiații;
- luând medicamente citostatice.
Reticulocitele sunt un indicator al numărului de celule, precursori ai globulelor roșii, formate în măduva osoasă. Reticulocite - globulele roșii tinere reflectă capacitatea de regenerare a măduvei osoase. Numărarea reticulocitelor este utilizată pentru a evalua intensitatea hematopoiezei. Studiul se efectuează atunci când: o scădere a numărului de celule roșii din sânge, suspiciune de hemoliză, evaluarea eritropoiezei, în tratamentul anemiei cu suplimente de fier și vitamina B 12, eritropoietina.
Reticulocitele sunt globule roșii anucleate, imature, a căror maturare are loc în 24-48 de ore după eliberarea în sângele periferic din măduva osoasă. Numărul de reticulocite formate reflectă activitatea eritropoetică a măduvei osoase. Cu alte cuvinte, conținutul de reticulocite reflectă rata de formare a globulelor roșii și servește ca un indicator al răspunsului măduvei osoase la anemie.
Pe lângă parametrii general acceptați ai reticulocitelor - conținutul absolut și relativ (%) al reticulocitelor, apariția de noi analizoare hematologice (colorarea cu coloranți speciali pentru acizi nucleici) a făcut posibilă obținerea de parametri suplimentari ai reticulocitelor:
Reticulocite cu conținut scăzut de ARN, cele mai mature (LFR%, fracțiune de reticulocite cu fluorescență scăzută);
reticulocite cu conținut mediu de ARN (MFR%, fracțiune de reticulocite cu fluorescență medie);
reticulocite cu ARN ridicat (HFR%, fracțiune de reticulocite foarte fluorescentă);
fracțiunea de reticulocite imature (IRF%, Fracția de reticulocite imature).
Diferențierea reticulocitelor, pe baza gradului de maturitate și, în consecință, a conținutului de acizi nucleici, este o reflectare a activității hematopoietice a măduvei osoase.