Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса) является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. РИФ основана на использовании флюоресцеинизотиоцианата ¾ ФИТЦ или других флюорохромов, химически связанных, конъюгированных с АТ. При этом меченые АТ сохраняют иммунологическую специфичность и вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными АГ.
Различают две основные разновидности метода: прямой и непрямой.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные специфичными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого или желтого цвета.
Непрямой метод РНИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из исследуемых микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ИФА), ингредиенты
Твердофазный ИФА является наиболее распространенным вариантом ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропланшетов из полистирола (рис. 27). При определении антител в лунки микропланшетов с сорбированными антигенами последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, субстрат для фермента (Н 2 О 2 или фосфатид) и хромоген (индикатор, окрашивающий продукт ферментации). Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрат для фермента и хромоген.
Рис. 27. Принцип постановки ИФА для обнаружения антимикробных антител
Механизм, ингредиенты радиоиммунного анализа (РИА)
Радиоиммунологический анализ (РИА) ¾высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радиоизотопами (l25 J, 14 С, 3 Н, 51 Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. При твердофазном варианте РИАодин из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. При другом варианте метода ¾ конкурентном РИА ¾искомый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для определения количества антигена в исследуемом материале. РИАприменяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в низких концентрациях ¾ 10 -10 -10 -12 г/л.
Лабораторная диагностика использует сразу несколько тестов на сифилис для получения максимально точного результата. Это занимает больше времени, но зато даёт наиболее точный ответ.
Чаще всего результат анализа РИФ представляют цифрами. Расшифровка имеет следующие обозначения:
- резко положительный результат обозначается 4 плюсами (++++);
- положительный результат обозначается 3 плюсами (+++);
- слабоположительный результат 2 плюсами (++);
- сомнительный результат 1 плюс (+);
- отрицательный результат обозначается 1 минусом (-).
Результат РИФ на сифилис также представляется в процентном варианте, который зависит от количественного показателя связанных бактерий:
- при отрицательном результате иммобилизация до 20%;
- при слабоположительном результате иммобилизация варьирует от 20 до 50%;
- при положительном результате иммобилизация выше 50%.
Если результат выдал положительный ответ, то это констатирует наличие заболевания.
Если результат слабоположительный , то это указывает на единичное количество остаточных антител в крови.
Отрицательный результат говорит об отсутствии бледной трепонемы, а это означает, что пациент здоров.
Опытные врачи нашей клиники проведут диагностику сифилиса быстро и с высокой точностью показаний. Мы социально ориентированы на все слои населения, поэтому стоимость анализа РИФ недорогая . Цена представлена в таблице на нашем сайте.
Реакция иммунофлюоресценции - РИФ (метод Кунса).Различают три разновидности метода прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью
антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной
флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном
микроскопе, как и при прямом методе.
23. Иммуноферментный анализ Ингредиенты, постановка, учёт, оценка. Области применения.
I Радиоиммунный анализ.
Радиоиммунный метод, или анализ (РИА), - высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, ЗН, 51Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом и субстрат/хромоген для фермента.
II. При определении антигена в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.
24. Реакции иммунного лизиса, применение. Реакция связывания комплемента. Ингредиенты, постановка, учёт, оценка. Применение.
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. РСК проводят в две фазы 1 -я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).
25. Динамика формирования клеточного иммунного ответа, его проявления. Иммунологическая
память.
Ответ иммунный клеточный (КИО) - сложная, многокомпонентная кооперативная реакция иммунной системмы, индуцированная чужеродным антигеном (Т-клеточными эпитопами). Реализуется Т-системой иммунитета. Этапы КИО
1. захват антигена АПК
2. Процессир. АГ в протеосомах.
3. Образование комплекса пептид+ ГКГ I и II класса.
4. Транспортировка комплемента на мембрану АПК.
5. Распознавание комплемента АГ-специфическими Т-хелперами 1
6. активация АПК и Т-хелперов 1, выделение Е-хелперами1 ИЛ-2 и гамма – интерферона. Пролиферация и дифференцировка в области АГ-зависимых Т-лимфоцитов.
7. Образование зрелых Т-лимфоцитов разных популяций и Т-лимфоцитов памяти.
8. Взаимодействие зрелых Т-лимфоцитов с АГ и реализация конечного эффектора.
Проявления КИО:
противоинфекционный ИО:
противовирусный,
противобактериальный (внутриклеточно расположенные бактерии);,
аллергии IV и I типов;
противоопухолевый ИО;
трансплантационный ИО;
иммунологическая толерантность;
иммунологическая память;
аутоиммунные процессы.
26. Характеристика регуляторных и эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов. Основные
маркёры. Т-клеточный рецептор (ТКР). Генетический контроль разнообразия ТКР
Т-лимфоциты представляют вторую важную популяцию лимфоцитов, предшественники которых образуются в костном мозге и затем мигрируют для дальнейшего созревания и
дифференцировки в тимус (название "Т-лимфоцит" отражает тимусзависимость, как основное место раннего этапа созревания).
По спектру биологической активности Т-лимфоциты являются регуляторными и эффекторными клетками, обеспечивающими адаптационную функцию Т-системы иммунитета. Они не продуцируют молекул антител. ТКР является мембранной молекулой, отличающейся от ВКР, но структурно и функционально близкой к антителам.
TCR – АГ-специф. рецептор. Это главная молекула, относящаяся к суперсемейству Ig. Она имеет 3 части: надмембранную, мембранную и цитоплазматическую. Хвост TCR формируют 2-е глобулярные молекулы альфа и бета, которые имеют вариабульные и константные домены (Vα и Vβ, Сα и Сβ).
Vα и Vβ формируют активный комплекс TCR. Там есть 3 гипервариабельных участка – константнодетерминированные области (КДО). Функция КДО - распознавание и связывание Т-клеточных пептидов, т.е. детерминантных групп АГ. TCR плотно сидит на клетке и его цитоплазматический хвост, его цитоплазматическая часть, учавствует в проведении инф. В ядро при его взаимодействии с АГ. Примерно 90 % TCR. Несут цепи альфа и бета, а примерно 10% несут цепи гамма и дельта.
TCR кодируется генетически. α и γ цепи по аналогии с легкими цепями ИГ кодируются V,G и C – генами, а β и δ по аналогии с тяжелыми цепями ИГ - V,G,E. α и γ в 7-й хромосоме, а β и δ в 14.
CD-3 рецептор – это комплементарная структура, Ig молекула. Она образована 3-мя трансмембранными белками: εδ, εγ и димер-дзета., надмембранный, vембранный и цитозолный хвост. Они с TCR представляют единый комплекс, Который обеспечивает проведение АГ –специфических сигналов в ядро клетки
СD4 и СD8. Они экспрессируют или одновременно с TCR или отдельно от него. Играют функцию ко-рецепторов. Они усиливают адгезию с АГ-презентирующей клеткой. Обеспечивают проведение АГ-специфического сигнала в ядро клетки.
Т-лимфоциты разделены по типу разпозн, МОЛЕКУЛ:
СD4 распозн. Пептид ГКГ 2-го класса
СD8 пептид + ГКГ 1-го класса
Характеристика основных субпопуляций Т-лимфоцитов: популяцию Т-лимфоцитов можно классифицировать на три класса:
A. Хелперы, эффекторы ГЗТ (CD 4+) и Супрессоры-цитотоксические (CD 8+);
B. Нестимулированные (CD 45 RA+) и клетки памяти (CD 45 RO+);
C. Тип 1 - (ИЛ-2, ИНФ-гамма, ТНФ-бэта продуцирующие);
Тип 2 - (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ9, ИЛ 10 продуцирующие).
61. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение. Прямой и непрямой методы постановки.
Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.тБактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).
Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.
Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.
Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому
антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в
том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию -
свечение.
Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал;
2) специфическая антисыворотка;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая
флюорихромом;
4) Изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем - меченой антиглобулиновой сывороткой.
Светящиеся комплексы АГ-АТ -
меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости
приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а
применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.
Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ - меченые - АТ-комплемент.
Оглавление темы "Реакции преципитации (РП). Иммуноэлектрофорез. Сложные реакции иммунодиагностики.":Иммуноблотинг [от англ. blot, пятно] - метод идентификации Аг (или AT) с помощью соответствующих известных сывороток (или Аг). На практике применяют для идентификации Аг ВИЧ. Первоначально электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике эту процедуру не проводят, а используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (нитроцеллюлозную плёнку или активированную бумагу) и продолжают электрофорез. После чего на плёнку наносят сыворотку пациента и инкубируют.
После отмывания несвязавшихся AT (при их наличии) проводят ИФА - на плёнку наносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов Аг-АТ-антисыворотка к lg на носителе появляются окрашенные пятна (рис. 10-20).
Рис. 10-20. ИммуноблотингРеакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ ) разработана А. Кунсом (1941) и основана на применении AT, меченных флюорохромными красителями. Такие AT, связывая различные Аг, вызывают свечение иммунных комплексов в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. На практике применяют несколько вариантов РИФ .