Які компоненти беруть участь у реакції аглютинації. Варіанти прискорених реакцій аглютинації. Реакція пасивної гемаглютинації та її варіанти. Реакції прямої гемаглютинації

Реакція аглютинації (Від лат. agglutinatio- склеювання) - склеювання корпускул (бактерій, еритроцитів та ін) антитілами в присутності електролітів.

Реакція аглютинаціїпроявляється у вигляді пластівців або осаду, що складаються з корпускул (наприклад, бактерій), «склеєних» антитілами (рис. 7.37). Реакцію аглютинації використовують для: визначення збудника, виділеного від хворого; визначення антитіл у сироватці крові хворого; визначення груп крові

Мал. 7.37 а,б. Реакція аглютинації зIgM-антитілами (а) таIgG-антитілами (б)

1. Визначення збудника, виділеного від хворого Орієнтовна реакція аглютинації на склі (рис. 7.38). До краплі аглютинуючої сироватки (розведення 1:20) додають завись бактерій, виділених від хворого. Утворюється пластовий осад.

Мал. 7.38.

Розгорнута реакція аглютинації із збудником, виділеним від хворого (рис. 7.39). До розведень аглютинуючої сироватки додають завись бактерій, виділених від хворого.

Мал. 52

2. Визначення антитіл у сироватці крові хворого
Розгорнута реакція аглютинації із сироваткою крові хворого (рис. 7.39). До розведення сироватки хворого додають діагностикум.
- Аглютинація з О-діагностикумом (бактерії, вбиті нагріванням, що зберегли 0-антиген) відбувається у вигляді дрібнозернистої аглютинації.
- Аглютинація з Н-діагностикумом (бактерії, вбиті формаліном, що зберегли джгутиковий Н-антиген) - великобавовняна і протікає швидше.
3. Реакція аглютинації для визначення груп кровіРеакцію аглютинації для визначення груп крові застосовують для встановлення системи АВО (табл. б) за допомогою аглютинації еритроцитів антитілами імунної сироватки проти антигенів груп крові А(І), В(ІІІ). Контролем служать: сироватка, яка містить антитіл, тобто. сироватка АВ(IV) групи крові; антигени, що містяться в еритроцитах груп А (ІІ), В (ІІІ). Негативний контроль не містить антигенів, тобто використовують еритроцити групи (I).

Таблиця 7.6. Визначення груп крові АВО

Результати реакції		Групова
		приналежність
		досліджуваної крові
еритроцитів зі	сироватки (плазми)
стандартними	зі стандартними
сироватками

Реакція аглютинації (РА) - це склеювання та випадання в осад мікробів або інших клітин під дією антитіл у присутності електроліту. Осад, що утворився, називають аглютинатом.

РА використовують:

1. Для виявлення антитіл у сироватці крові хворого (серодіагностика).

2. Для визначення виду та серовару виділеної від хворого чистої культури патогенних мікроорганізмів (серотипування).

Реакцію аглютинації використовують для визначення антитіл у сироватці крові хворих, наприклад, при черевному тифі та паратифах (реакція Відаля), бруцельозі (реакції Райта, Хеддлсона), туляремії, лептоспірозах та інших інфекційних хворобах, а також для визначення виділеного від інфекції. , кашлюк та ін). РА застосовується визначення груп крові, резус - чинника та інших.

Для реакції необхідні такі компоненти:

1. Антиген (аглютиноген) повинен бути корпускулярним, тобто це завись живих або вбитих мікроорганізмів (діагностику м), еритроцитів або інших клітин. Зазвичай використовують добову культуру мікроорганізмів, вирощену на скошеному агарі. Культуру змивають 3 - 4 мл ізотонічного розчину, переносять у стерильну пробірку, визначають густину. Завис має бути гомогенною і містити до 3 млрд. мікробних клітин в 1 мл. Застосування суспензії вбитих мікробів - діагностикумів - полегшує роботу (готуються з виробництва).

2. Антитіла (аглютиніни) знаходяться у сироватці хворого (при серодіагностиці) або в аглютинуючій сироватці (при серотипуванні). Аглютинуючі сироватки отримують шляхом імунізації кроликів убитими бактеріями.

Титром аглютинуючоюсироватки називається найбільше її розведення, в якому не реагує з відповідним антигеном в певних умовах досвіду.

Аглютинуючі сироватки можуть бути нативними (неадсорбованими) та адсорбованими. Нативні сироватки в невеликих розведеннях взаємодіють не тільки з тим видом мікроорганізмів, яким імунізували тварину для отримання сироватки, але і з спорідненими видами мікроорганізмів, тому що в них є групові антитіла (антитіла до мікроорганізмів, що мають загальні антигени). Нативні сироватки використовуються для розгорнутої реакції аглютинації (при серодіагностиці), де враховується як наявність реакції, а й динаміка наростання титру антитіл.

Якщо з нативної сироватки витягти (адсорбувати) групові антитіла шляхом взаємодії з родинними бактеріями, що мають групові антигени, виходять адсорбовані сироватки. Адсорбовані сироватки можуть бути монорецепторними (або типоспецифічними), що містять антитіла тільки до одного антигенного рецептора. Полівалентні сироватки складаються із суміші декількох адсорбованих або неадсорбованих сироваток. Адсорбовані сироватки використовують для реакції аглютинації на склі.

При імунізації тварин рухомими бактеріями з Н-антигеном отримують Н-аглютинуючі сироватки, що містять Н-антитіла (наприклад, сальмонельозна монорецепторна Н-аглютинуюча сироватка). Імунізацією О-антигеном отримують О-аглютинуючі сироватки, що містять О-антитіла, (наприклад, сальмонельозна групова адсорбована О-аглютинуюча сироватка, протихолерна О-аглютинуюча сироватка). Імунізацією Н- та О-антигенами отримують сироватки з Н- та О-антитілами.

Причому О-аглютинини дають дрібнозернистий аглютинат, а Н-аглютиніни - бавовняний осад.

3. Електроліт – ізотонічний розчин NaCl (0,9 % розчин хлориду натрію, приготовлений на дистильованій воді).

Існує два основних методи постановки реакції аглютинації: реакція на склі (іноді її називають орієнтовною або пластинчастою) та розгорнута реакція (у пробірках)

Постановка реакції аглютинації на склі. На знежирене предметне скло наносять дві краплі сироватки та краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. Діагностична аглютинуюча сироватка береться в одному розведенні, яке в залежності від її титру становить 1:10, 1:25, 1:50 або 1:100. В одну з крапель сироватки і краплю ізотонічного розчину петлею вносять культуру мікроорганізму, що досліджується, і ретельно перемішують. Крапля хлориду натрію з мікроорганізмами – контроль антигену, крапля сироватки без мікроорганізмів – контроль сироватки. Не можна переносити культуру з краплі із сироваткою в краплю з NaCl. Реакція протікає за кімнатної температури протягом 1-3 хв. Якщо контроль сироватки залишається прозорим, у контролі антигену спостерігається рівномірне помутніння, а краплі, де культура змішана з сироваткою, з'являються пластівці аглютинату, то результат вважають позитивним. Якщо краплі з сироваткою і антигеном рівномірне помутніння, це негативний результат. Реакція виразніше видно на темному тлі.

Сироватка

1. контроль антигену

2. контроль сироватки

Аглютинація крові - це склеювання та осідання у вигляді осаду еритроцитів, бактерій та інших клітин, які несуть антигени.

Процес відбувається під впливом аглютинінів, які є специфічними речовинами. У ролі цих речовин виступають лектини чи антитіла.

Можливі види аглютинації щодо групи крові

Аглютинація буває специфічною та неспецифічною. У першому випадку реакція відбувається за участю трьох компонентів:

антигенів;
антитіл;
електролітів (застосовується ізотонічний розчин).

Використовуються всі можливі види аглютинації щодо групи крові, проте це єдиний випадок.

З якою метою використовується?

Реакція аглютинації крові застосовується у тому, щоб виявити збудника інфекційного захворювання. При цьому він осідає і його легко виявити в осаді. Цей процес використовується, як вже згадувалося вище, і при цьому саме про це й йтиметься далі.

Які особливості?

Еритроцити містять антигени типу А і В. Вони зв'язуються з антитілами і β відповідно. Групи крові та реакції аглютинації:

1, 0 (ά, β) - відсутні антигени на поверхні еритроцитів;
2, А (β) - присутній антиген А та антитіло β;
3, В (ά) - міститься антиген В і антитіло ά;
4, АВ (00) - присутні два антигени, антитіла відсутні.

Варто зазначити, що антигени вже спостерігаються у ембріона. Щодо антитіл, вони з'являються після народження, на першому місяці життя.

Від групи крові залежить сумісність людей. У цьому полягає причина відторгнення плоду організмом матері. Іншими словами, у неї є антитіла до антигенів крові майбутньої дитини. І тут виникає несумісність. Крім того, група крові обов'язково враховується під час переливання.

Підготовка

Групи крові та реакції аглютинації - сумісні поняття, які найчастіше використовуються в медицині.

Перед тестом важливо дотримуватись певних інструкцій. Слід на якийсь час виключити вживання деяких продуктів і лікарських препаратів. Це допоможе зробити результати точнішими. Рекомендації, яких слід дотримуватися, призначає лікар. Справа в тому, що у різних лабораторій можуть не збігатися діапазони отриманих значень, тобто вони дещо відрізняються.

Умови проведення тесту

Щоб групу крові було визначено точно, важливо підібрати правильне оснащення. До такого належать:

та піпетка;
скляні палички;
стандартні ізогемагглютинуючі сироватки;
сухі фаянсові тарілки, які поділені на 4 сектори.

Існують вимоги та до умов проведення тесту:

денне висвітлення;
температура в приміщенні вище +16?
використання об'ємів крові та сироватки у співвідношенні 1:10;
достовірні результати виходять упродовж 5 хвилин.

Вище представлені основні умови та інструменти. Аглютинація крові може проводитися декількома способами, і кожен із них висуває індивідуальні вимоги.

Методи

Можливі методи визначення групи крові за допомогою аглютинації:

стандартний метод;
перехресна реакція;
використання цоліклонів;
експрес-методика із застосуванням набору «Ерітротест-группокарт».

Стандартний метод

Аглютинація крові проявляється з використанням еритроцитів пацієнта. Також застосовуються стандартні сироватки, що містять відомі антигени.

На плоску тарілку розміщується по 1 краплі чотирьох сироваток. Потім за допомогою скляних паличок на неї вноситься кров пацієнта, що підлягає дослідженню. В даному випадку зручно використовувати піпетки очей. Слід дотримуватись співвідношення 1:10. Сироватка та кров обережно перемішується. Протягом п'яти хвилин можна проводити оцінку.

Розшифровка результатів тесту простим методом

Після закінчення зазначеного часу у краплях сироватки спостерігається просвітлення. У деяких можна побачити, що аглютинація еритроцитів відбулася (дрібні пластівці), в інших вона відсутня.

Існують такі варіанти:

реакції немає у всіх пробах сироваток – 1 група;
згортання відбулося скрізь, крім 2 проби – 2 група;
відсутність реакції лише у 3 пробі - 3 група;
аглютинація відбулася скрізь – 4 група.

Таким чином, головне – правильно розподілити сироватки. Тоді розшифрувати результат не складе труднощів. Якщо аглютинація крові проявляється слабо, рекомендується провести аналіз повторно. У випадку з дрібними пластівцями їх розглядають під мікроскопом.

Перехресна реакція

Іноді у простий спосіб неможливе точне визначення групи крові. Аглютинація у такому разі проводиться за допомогою методу перехресної реакції. На відміну від першого варіанта тесту, важливе значення мають тут стандартні еритроцити. Кров пацієнта набирається у пробірку, центрифугується, а потім піпеткою відкачується сироватка для подальших досліджень.

Вона в кількості 2 крапель поміщається на тарілку, потім до неї додаються стандартні еритроцити груп А і В. Вміст розмішується шляхом похитування ємності.

Результати методу перехресної реакції

За п'ять хвилин проби готові до розгляду. Варіанти такі:

склеювання відбулося в обох краплях – 1 група;
пластівці не спостерігаються в жодній із проб - 4 група;
процес видно в одному зразку – 2 або 3 група (залежно від того, де саме згорнулася кров).

Метод із використанням цоліклонів

Для визначення групи крові аглютинація у такий спосіб проводиться із застосуванням синтетичних замінників сироваток. Вони називаються цоліклонами. Вони містяться штучні замінники ά і β-аглютинів, відомих як еритротести (рожевого і синього кольору відповідно). Реакція відбувається між ними та еритроцитами крові пацієнта.

Такий метод є найточнішим і найнадійнішим. Здебільшого не вимагає повторного проведення дослідження. Оцінка результатів здійснюється аналогічно, як у випадку стандартного методу. Особливість полягає в тому, що має бути обов'язково підтверджена реакцією зі специфічним синтетичним замінником (анти-АВ). Крім того, у ній не спостерігається склеювання при додаванні розчину натрію хлориду.

Експрес-методика з набором «Ерітротест-группокарт»

Розглядаючи можливі методи аналізу щодо групи крові, слід зазначити, що цей спосіб має свої особливості. Вони полягають у тому, що результат можна оцінити у лабораторії, а й у польових умовах. Для проведення дослідження використовують спеціальний набір. Він включає картку з лунками, на дні яких вже присутні висушені реагенти. Крім анти-АВ, анти-А та анти-В, застосовується анти-D, що дозволяє визначити резус-фактор.

Цей метод не вимагає особливої підготовки, можна використовувати кров, яка взята з пальця, допускається наявність в ній консервантів. Спочатку необхідно внести в кожну лунку краплі води, щоб розчинити інгредієнти. Після цього додається кров, трохи розмішується. Через три хвилини буде отримано результат.

Хибна аглютинація

Іноді дані, отримані після тесту, не відповідають дійсності. Таке явище залежить від певних чинників.

Виділяють три види помилкової реакції:

Псевдоаглютинація. Справжнє склеювання не відбувається, еритроцити складаються у вигляді монетних стовпчиків. Якщо додати кілька крапель фізіологічного розчину, вони розпадаються. Подібне явище розпізнається під мікроскопом.

Холодна аглютинація крові. Така реакція спостерігається у разі, якщо умови щодо дослідження були несприятливими. Коли температура нижче +16 ˚С, може виявлятись склеювання.

Панаглютинація. За наявності інфекції у крові результати тестів може бути хибними. Таке явище також можливе у разі онкологічних захворювань, при сепсисі.

Аглютинація дуже важлива в медицині. Вона дозволяє не лише визначати групу крові, а й виявляти збудника захворювань, а також наявність інфекцій. Головне, дотримуватися рекомендацій лікаря під час підготовки до цієї процедури. Що стосується медичного персоналу, його завдання полягає у створенні сприятливих умов та дотриманні всіх правил. Тільки таким чином можна досягти точних результатів при виконанні аглютинації крові.

Реакція аглютинації заснована на специфічній взаємодії антитіл (аглютинінів) з цілими мікробними або іншими клітинами. Внаслідок такої взаємодії утворюються частинки-агломерати, що випадають в осад (аглютинат). У реакції аглютинації можуть брати участь бактерії, найпростіші, гриби, дріжджі, рикетсії, еритроцити та інші клітини як живі, так і вбиті. Протікає реакція дві фази: перша — специфічне з'єднання антигену і антитіла, друга — кеспецифічна, т. е. утворення видимого аглютинату. Випадання аглютинату відбувається у присутності електролітів, наприклад хлориду натрію. Мікроорганізми, що знаходяться в аглютинаті, залишаються живими, але втрачають рухливість.

Реакцію аглютинації широко застосовують для серо-логічної діагностики інфекційних захворювань та визначення антигенної структури виділених мікробів. Для встановлення антигенної структури збудника, виділеного з організму хворого або носія, використовують специфічну імунну сироватку, одержану імунізацією тварин (кролика, віслюка, барана) певними мікроорганізмами. Ідентифікацію мікроба проводять у реакції аглютинації на склі з адсорбованими або монорецепторними сироватками або в пробірках з видовими аглютинуючими сироватками. Адсорбовані сироватки містять антитіла тільки до специфічних для даного мікроба антигенів, а монорецепторні - тільки до одного специфічного антигену збудника.

Видові сироватки містять антитіла всім антигенам певного мікроба.

Приналежність виділеної культури мікроорганізму до цього виду визначається при аглютинації його відомою сироваткою до титру антитіл, вказаного на етикетці ампули із сироваткою. Титром антитіл сироватки вважають останнє її розведення, в якому ще спостерігається аглютинація культури мікробів, використаних для імунізації тварини. Адсорбовані та монорецепторні сироватки використовують зазвичай у реакції аглютинації на склі нерозведеними.

При визначенні наявності антитіл у сироватці крові хворого її розводять ізотонічним розчином хлориду натрію починаючи з розведення 1: 50 до 1: 800 або більше. У кожне розведення додають завись живих або вбитих мікробів. Препарати, що містять мікроби, убиті нагріванням або формаліном, називають діагностикумами. Діагностикуми, одержані шляхом прогрівання культур мікроорганізмів, містять лише соматичні антигени. При використанні тільки формаліну у мікробів зберігаються і джгутикові антигени.

За наявності антитіл у крові хворого відбувається склеювання взятого в реакцію діагностикуму та утворення осаду (аглютинату) на дві пробірки. В цьому випадку результати реакції аглютинації розцінюють як позитивні. У контрольній пробірці, куди вносять ізотонічний розчин хлориду натрію та діагностикум, завись мікробів повинна бути гомогенною (негативна реакція аглютинації).

Облік результатів реакції аглютинації при деяких захворюваннях, наприклад, лептоспірозі, проводять тільки мікроскопічно в темному полі зору мікроскопа (мікроаглютинація). Для постановки серологічного діагнозу захворювання враховують діагностичне захворювання. Зазвичай він відповідає розведенню сироватки 1:100 або 1:200.

Антитіла в сироватці крові хворого за допомогою реакції аглютинації можна виявити при захворюванні на черевний тиф і паратифи (реакція Відаля), бруцельоз (реакція Райта), туляремії та ін.
Реакція Кастеллані. При деяких інфекційних захворюваннях або імунізації мікроорганізмами, що мають у своєму складі групові антигени, у сироватці крові, крім специфічних для цього виду антитіл, з'являються ще й групові. У цьому випадку родинні види бактерій аглютинуватимуться отриманими сироватками.

Кастелані запропонував метод адсорбції групових антитіл з імунних сироваток, заснований на видаленні їх за допомогою мікроорганізмів споріднених видів, які мають групові антигени, але позбавлені специфічних. Культура таких мікроорганізмів, додана в сироватку, адсорбує неспецифічні групові антитіла, і після видалення комплексу антиген антитіло за допомогою центрифугування в сироватці залишаються тільки специфічні імуноглобуліни. Сироватки, оброблені за методом Кастелані, можуть бути використані в реакції аглютинації як високоспецифічні.