Кардинальний вплив протягом ряду патологічних процесів у організмі може як прискорення, і уповільнення апоптоза . Речовини, що у регуляції апоптозу, зазвичай, є білками, які синтез контролюється відповідними генами . Однакові гени, що регулюють рівень апоптозу, можна виявити у живих істот, що стоять на різних щаблях еволюційних сходів. До генів, стимулюючих апоптоз відносяться гени p53, Bax, bcl-xS. З іншого боку, були описані гени, що синтезують білки, що інгібують апоптоз (Bcl-2, Ced-9, BHRF1, MCL-1). Про- та антиапоптозні білки здатні поєднуватися один з одним, формуючи гомо- та гетеродимери. Наприклад, при об'єднанні інгібітора апоптозу білка Bcl-2 з білком активатором апоптозу Bax підсумок (гальмування або активація апоптозу) визначатиметься тим, який білок переважатиме в цьому об'єднанні.
Найбільш яскравими та інформативними білками, що відображають протікають синтетичні процеси в клітинах та тканинах, є білки сімейства Bcl-2, які займають центральне місце у вивченні регуляції процесу апоптозу. Механізм регуляції цього процесу доцільно розглядати з позиції структурно – функціональних взаємин між білками цього сімейства, які дозволяють об'єднати в одне сімейство – білків Bcl-2 . Білки цього сімейства Bcl-2 знаходяться в постійній динамічній рівновазі, утворюючи гомо-і гетеродимери, що в кінцевому рахунку впливає на розвиток апоптозу клітин. Тому вважається, що співвідношення активних форм цих білків визначає рівновагу між життям та смертю клітини.
На сьогодні відомо, що білки сімейства Bcl-2 відносяться або до індукторів апоптозу (Bad, Bax, J3ik, Bid, Bak), або до інгібіторів (Bcl-2, Bcl-X). Білок сімейства Bcl-2 відноситься до класу G - білків. Білок з молекулярною масою 26 кДж, що кодується геном Bcl-2, містить трансмембранний домен і локалізується в мітохондріальній мембрані, перинуклеарному ендоплазматичному ретикулумі, ядерній мембрані та в мітотичних хромосомах.
Bcl-2 є фактором виживання клітини, захищаючи її від програмованої загибелі, і виявляє онкогенну властивість, оскільки перешкоджає апоптозу. Ген BCL-2 виконує функцію негативного регулятора апоптозу. Встановлено, що зменшення концентрації Bcl-2 призводить до апоптотичної загибелі клітин, тоді як експресія його захищає клітини від смерті.
Найбільш добре вивчена послідовність подій, що призводять клітину апоптозу в результаті взаємодії білків з сімейства TNF зі специфічними рецепторами. Яскравим представником цієї групи білків є система Apo-1/Fas/FasL. Слід зазначити, що цієї системи не відомі інші функції, крім індукції апоптозу клітини.
Apo-1/Fas/CD-95 – рецептор за структурою, що відноситься до рецепторів сімейства TNF. Взаємодія Apo-1/Fas (рецептор) з FasL (ліганд) або моноклональними антитілами призводить до апоптозу клітини. Apo-1/Fas конститутивно експресується на поверхні клітин багатьох типів: на тимоцитах, лімфобластоїдних клітинних лініях, активованих Т- та В-лімфоцитах, а також на фібробластах, гепатоцитах, кератиноцитах, мієлоїдних клітинах. Людський Apo-1/Fas складається з 325 амінокислотних залишків та відноситься до мембранних білків I типу. Тобто. у його структурі можна виділити позаклітинний, трансмембранний та цитоплазматичний домени. Гомологія амінокислотної послідовності серед рецепторів сімейства TNF є високою. Приблизно 80 амінокислотних залишків утворюють домен смерті (DD), який залучається до білок-білкової взаємодії з цитоплазматичними білками, генеруючи сигнал смерті. Ген Apo-1/Fas у людини локалізований у довгому плечі хромосоми 10 і складається з 9 екзонів.
FasL є цитокіном і відноситься до сімейства цитокінів TNF. FasL експресується на активованих Т-лімфоцитах та натуральних кілерах, а також на клітинах Сертолі та паренхімних клітинах передньої камери ока, що дозволяє цим клітинам вбивати будь-яку Fas-експресуючу клітину, у тому числі й активований Т-лімфоцит. Цей механізм визначає появу захищених від імунної системи місць. FasL існує у двох формах – нерозчинної або мембранозв'язаної та розчинної, що відщеплюється від клітини за допомогою металопротеїнази. Розчинна форма людського sFasL зберігає свою активність. Подібно до інших лігандів рецепторів сімейства TNF, sFasL – гомотример зв'язується з 3 молекулами Apo-1/Fas.
При зв'язуванні ліганду з рецептором відбувається олігомеризація цитоплазматичних білків, таких як DD (домен смерті), що відноситься до рецептора, адапторного білка – FADD (Fas-асоційований домен смерті), що містить DED – ефекторний домен смерті та прокаспази-8. Внаслідок цього процесу відбувається активація апоптоз-специфічної протеази – каспази-8 та розвиваються характерні для апоптозу процеси. Мутації у гені fas чи гені FasL призводять до розвитку аутоімунних захворювань.
Apo-1/Fas – це білок, який містить 1 трансмембранну ділянку, яка зв'язуючись з FasL, індукує апоптоз у клітинах-мішенях. Існує також не має трансмембранної ділянки, розчинна форма Apo-1 (sApo-1/Fas), яка присутня в сироватці крові та інших біологічних рідинах. Згідно з даними літератури, ця секреторна форма (sApo-1/Fas) може захищати клітини від Apo-1/ліганду індукованого апоптозу і утворюється шляхом відщеплення амінокислотного залишку від трансмембранного домену .
В останні роки ідентифікацію апоптозу часто проводять, визначаючи активність каспаз як ініціаторних, так і ефекторних. У більшості робіт, які проводяться з вивченням активності каспаз, розглядається каспаза-3, т.к. різні шляхи апоптотичної загибелі сходяться у ній, та її активація свідчить про наявність апоптоза. Однак, якщо в дослідження вводиться визначення активності каспази-8, то, крім виявлення програмованої клітинної загибелі як такої, можна визначити шлях її запуску, т.к. активація каспази-8 свідчить про рецепторний (зовнішній) механізм ініціації процесу. Саме це є серйозною перевагою даного методу.
На сьогоднішній день розроблено понад 60 різних методів виявлення та вивчення апоптотичних клітин in vitro. У літературі описано кілька методичних підходів до виявлення апоптотичних клітин in vivo. Ці методи базуються на якісній чи кількісній оцінці подій, викликаних змінами зовнішньої мембрани клітин, вибірковою фрагментацією ядерної ДНК, змінами структури внутрішньоклітинних компонентів або їх перерозподілом, а також зменшенням pH цитоплазми. Крім того, зустрічаються атипові форми апоптозу, при яких відсутні маркерні апоптотичні зміни.
З зрозумілих причин вивчення механізмів апоптозу кортикостероїдів при ПОУГ у людини in vivo неможливе. Як непрямий показник щодо ролі апоптозу в патогенезі ПОУГ проводилася оцінка апоптотичних маркерів в лімфоцитах периферичної крові, що характеризують готовність останніх до апоптозу . Для визначення апоптотичних клітин використовуються: лазерна сканувальна та проточна цитометрія, однофотонна емісійна комп'ютерна томографія, магнітно – резонансна томографія (МРТ), магнітно – резонансна спектроскопія, позитронно – емісійна томографія. Також, для ідентифікації апоптотичної загибелі клітин застосовуються світлова і флуоресцентна мікроскопія із застосуванням звичайних методів фіксації та фарбування, електронно – мікроскопічні методи, виявлення олігонуклеосомної деградації ДНК in situ, імуногістохімічне виявлення білків – маркерів, що беруть участь у програмованій каспаз.
Вивчення апоптозу на забарвлених стандартними способами препаратах застосовується дуже широко через відносну простоту цих методів. Отримані при підрахунку апоптотично змінених клітин результати виражають у вигляді так званого апоптотичного індексу. Критеріями програмованої загибелі клітин можуть бути маргінація і пікноз хроматину, зміна контурів ядра, зміна контурів і фрагментація клітин, поява ядер, що вільно лежать.
Для виявлення програмованої клітинної загибелі як суб'єктивний метод часто використовується флуоресцентна мікроскопія. Досліджують як вітально забарвлені клітини у суспензії, так і фіксовані препарати. При роботі з живими клітинами широко застосовується міченіе анексином V, що дозволяє виявити на зовнішній стороні плазматичної мембрани фосфатидилсерин, що з'являється в процесі апоптозу.
При аналізі клітин за умов флуоресцентної мікроскопії враховують такі ознаки: розміри ядра (зменшення), характер розподілу хроматину (конденсація в глибки неправильної форми, ущільнення), хроматинові тіла (безпека мембранної ізольованості), характер світіння ДНК. Апоптотична ДНК виглядає конденсованою яскраво-жовто-зеленою. У життєздатних клітинах акридин оранж викликає дифузну зелену флуоресценцію.
За допомогою імуногістохімічних досліджень визначають наявність білків, які формують каскад біохімічних процесів, що призводять до апоптозу. Часто до цієї групи методів відносять TUNEL та ІФА.
Багато дослідників відводять апоптозу провідну роль структурних змінах диска зорового нерва (ДЗН), зумовлених втратою кортикостероїдів. Роль апоптозу при розвитку дегенеративних захворювань не викликає сумнівів. Існує переконливий експериментальний матеріал, що свідчить про участь апоптотичного процесу в механізмі ГОН при ПОУГ. Однак, загалом, клінічні дослідження факторів апоптозу у пацієнтів з різними стадіями глаукоми дуже обмежені, що ускладнює вивчення їхньої ролі в патогенезі ГОН.
Сторінка джерела: 265
1Обстежено 45 дітей віком від 3–15 років. Метою дослідження було визначення готовності до апоптозу лімфоцитів та нейтрофілів периферичної крові за допомогою визначення маркерів апоптозу – CD95, CD95L, BSL2. При оцінці апоптозу імунокомпетентних клітин встановлено зниження готовності до програмованої клітинної загибелі лімфоцитів та збільшення нейтрофільних гранулоцитів. Найбільш виражені зміни реєструються у віковій групі 7–15 років із стажем захворювання понад 3 роки. Отримані дані можуть бути ознакою придушення програмованої загибелі аутореактивних лімфоцитів у тканині підшлункової залози, що сприяє пролонгації імунної відповіді. Збільшення частки лейкоцитарних клітин, що експресують CD95L, може сприяти посиленню процесів запрограмованої клітинної загибелі в острівцевих β-клітинах підшлункової залози, інфільтрованих імунокомпетентними клітинами.
апоптоз нейтрофілів
апоптоз лімфоцитів
цукровий діабет 1 типу
1. Пекарьова Є. В. Маркери апоптозу у хворих на цукровий діабет 1 типу в дебюті захворювання / Є. В. Пекарьова та ін. // Цукровий діабет. - 2009. - № 4. - С. 86-89.
2. Пекарьова Є. В. Роль апоптозу в патогенезі цукрового діабету 1 типу / Є. В. Пекарьова, Т. В. Ніконова, О. М. Смирнова // Цукровий діабет. - 2010. - № 1. - С.45-48.
3. Adeghate E. An update on etiology and epidemiology of diabetes mellitus / E. Adeghate, P. Schattner, E. Dunn // Ann NY. Acad Sci, 2006. - Vol. 1084. - P. 1-29.
4. Clinical significance neutrophil apoptosis in peripheral blood patients with type 2 diabetes mellitus / З. Sudo et al. //Lab Hematol. 2007; 13 (3): 108-12 (знижена).
5. Filep J. G. Neutrophil apoptosis: target for enhancing resolution of inflammation / J. G. Filep, E. l. Kebir// J. Cell Biochem. - 2009. - Vol. 108. - P. 1039-1046.
6. Human polymorphonuclear neutrophil responses to Burkholderia pseudomallei in ealthy and diabetic subjects / S. Chanchamroen et al. // Infect Immun. - 2009. - Vol. 77. - P. 456-463 (знижений апоптоз).
7. Impact of Lymphocyte Apoptosis in Diabetes mellitus/K. А. Awadhesh et al. // Asian Journal of Medical Sciences. - 2011. - № 2. - P. 1-6.
8. Inflammation is more persistent in type 1 diabetic mice / D. T. Graves et al. // J. Dent. Res., 2005. - Vol. 84. - P. 324-328.
9. Juliana C. Alves Infections у пацієнтів з diabetes mellitus: Review of pathogenesis / C. Juliana, C. Janine, C. Alves // Indian J. Endocrinol. Metab. - 2012 March. - Supp l1. - № 16. - P. 27-36.
10. Luo H. R. Constitutive neutrophil apoptosis: mechanisms and regulation / H. R Luo, F. Loison // Am. J. Hematol. - 2008. - Vol. 83. - P. 288-295.
Вступ
Цукровий діабет 1 типу (СД1) є полігенним, мультифакторним захворюванням, пов'язаним з утворенням аутоантитіл та аутореактивних Т-лімфоцитів до β-клітин підшлункової залози.
Провідними ланками в патогенезі аутоімунних уражень є дисрегуляція імунітету та програмованої загибелі клітин.
Контрольований апоптоз розглядається сьогодні як головний механізм підтримки оптимального балансу клітин у вогнищі запалення, що обмежує експансію активованих клонів та перешкоджає розвитку аутоімунних реакцій. При виникненні дефекту його реалізації активовані імунні клітини можуть акумулюватися, що веде до виникнення аутоімунних захворювань.
Мета дослідження: вивчення активаційних маркерів апоптозу CD95, CD95L, Bsl2 на лімфоцитах та нейтрофілах периферичної крові при цукровому діабеті 1 типу у дітей.
Матеріал та методи дослідження
Виконано обстеження 45 дітей із цукровим діабетом 1 типу у віці 3-15 років. До групи I увійшли 20 дітей віком 3-6 років (дошкільнята), до групи II – 12 дітей віком 7-15 років (школярі) з тривалістю захворювання менше 3-х років, до групи III – 13 дітей 7-15 років (школярі) зі стажем захворювання понад 3 роки. Контрольну групу склали 30 здорових дітей 3-6 (15) та 7-15 (15) років. Дослідження здійснено на базі ендокринологічного відділення ДДКБ ім. Г. К. Пилипського м. Ставрополя.
Для оцінки програмованої клітинної загибелі виявляли кількість лімфоцитів та нейтрофілів, що експресують маркери апоптозу. Лімфоцити виділяли на градієнті густини Ficoll-Paque, нейтрофіли - на подвійному градієнті густини Ficoll-Paque та фіколл-урографін (GE Healthcare, Швеція). Суспензію клітин тричі відмивали серед RPMI-1640 (Вектор-Бест, Росія). У культурах лімфоцитів та нейтрофілів оцінювали кількість клітин, що експресують CD95, CD95L, Bsl2 методом проточної цитометрії з використанням моноклональних антитіл (Invitrogen, США).
Для статистичного аналізу даних використовували пакет програм "Primer of Biostat 4,0", Attestat 10.5.1. Для оцінки міжгрупових відмінностей застосовували дисперсійний аналіз повторних вимірів із обчисленням критеріїв Ньюмена – Кейлса, Данна.
Кількісні значення характеризувалися ненормальним розподілом і були представлені у вигляді медіани та інтерквантильного (25 і 75%) розмаху (Me (Q1-Q)). Достовірними вважали відмінності при р<0,05.
Результати та їх обговорення
У роботі було встановлено зменшення кількості лімфоцитів, які експресують Fas-рецептори (CD95) у пацієнтів усіх груп порівняно зі здоровими дітьми (табл. 1). Мінімальні показники відзначені у дітей 7-15 років зі стажем захворювання понад 3 роки (табл. 1).
Таблиця 1
Показники апоптозу лімфоцитів у дітей із цукровим діабетом 1 типу
|
Клінічні групи |
||||
|
3-6 років |
ЦД1 (I) (n=20) |
17,7(15,9-19,43) * ** |
7,4(5,81- 8,94) * ** |
70,2(68,56-71,76) * ** |
|
Контрольна група |
28,0(26,08-30,0) |
9,2(8,04- 10,25) |
65,9(62,82-69,05) |
|
|
7-15 років |
20,5(17,94-23,02) * ** |
11,6(10,12-13,14) * ** |
70,3(65,72-74,9) * ** |
|
|
13,9(10,04-17,73) * ** |
15,6(14,26-16,87) * ** |
79,5(75,47-83,59) * ** |
||
|
Контрольна група |
26,5 (24,20-28,84) |
8,14 (6,49-9,78) |
60,3(56,97-63,66) |
*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой
При оцінці рівня експресії антиапоптотичних маркерів (Bsl2) виявлено його збільшення на лімфоцитах дітей усіх груп, більш виражене у школярів із тривалістю захворювання понад 3 роки, що також свідчить про порушення Fas-залежного апоптозу у дітей з цукровим діабетом 1 типу, що призводить до уповільнення процесів клітинної смерті аутореактивних форм лімфоцитів.
Отримані нами результати можуть бути непрямою ознакою придушення програмованої загибелі активованих лімфоцитів у тканині підшлункової залози, що сприяє пролонгації імунної відповіді.
Рівень апоптотичної готовності лімфоїдних клітин залежить від тривалості захворювання та зменшується у дітей зі стажем ЦД1 понад 3 роки.
Раніше було показано, що при цукровому діабеті виявляється резистентність лімфоцитів до апоптозу, що, можливо, пояснює характер та тривалість аутоімунної відповіді.
У культурі лімфоцитів дітей, хворих на цукровий діабет, встановлено збільшення відсоткової частки лімфоцитів, що експресують CD95L (табл. 1), порівняно з групою здорових дітей. Найбільш високі показники визначалися у дітей 7-15 років зі стажем захворювання понад 3 роки (табл. 1).
Відомо, що при СД1 острівці підшлункової залози інфільтровані імунними клітинами, що продукують широкий спектр цитокінів, що супроводжується експресією аберантної мембранних рецепторів. Під впливом підвищеної концентрації глюкози та цитокінів β-клітини починають експресувати CD95 на своїй поверхні, практично відсутній у нормі.
Підвищення експресії CD95L на лімфоїдних клітинах можливо обумовлює більш виражений апоптотичний процес у β-клітинах підшлункової залози та їх подальше видалення.
В останні роки показано, що нейтрофільні гранулоцити беруть активну участь у формуванні аутоімунного запалення. Реакція нейтрофілів, спрямована на локалізацію та елімінацію аутоантигенів багато в чому залежить від сили та тривалості антигенного впливу на імунну систему, а також вихідного рівня функціональної активності клітин.
Нами встановлено, що перебіг цукрового діабету у дітей супроводжується збільшенням відсотка нейтрофілів, що експресують маркери апоптозу (CD95), та зменшенням частки клітин, що мають на своїй поверхні антиапоптотичні білки Bsl2 (табл. 2).
Таблиця 2
Показники апоптозу нейтрофілів у дітей із цукровим діабетом 1 типу
|
клінічні групи |
||||
|
3-6 років |
ЦД1 (I) (n=20) |
75,1(71,49-78,72) * ** |
9,5 (8,63- 10,32) * ** |
3,68 (3,46-3,90 * ** |
|
контрольна група |
59,2 (56,31- 62,01) |
7,35 (6,58- 8,12) |
||
|
7-15 років |
СД1, стаж захворювання менше 3-х років (II) (n=12) |
77,6(71,15-83,99) * ** |
9,5(8,14-10,92) * ** |
3,99(2,9- 5,08) * ** |
|
СД1, стаж захворювання понад 3 роки (III) (n=13) |
87,9(84,24-91,63) * ** |
12,1(10,22-13,96) * ** |
2,78(2,36-3,19) * ** |
|
|
контрольна група |
58,43(54,95- 1,90) |
*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой III (критерій Ньюмена – Кейлса, критерій Данна).
При порівняльній міжгруповій характеристиці максимальні показники CD95 (p<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.
Виявлено збільшення відсотка поліморфноядерних лейкоцитів, що мають на поверхні CD95L. Найбільш високі показники відзначені у дітей школярів зі стажем захворювання понад 3 роки.
Результати дослідження апоптозу ПМЯЛ при цукровому діабеті, представлені у літературних джерелах, мають суперечливий характер. Існують дані про збільшення швидкості апоптозу нейтрофілів периферичної крові при ЦД1 та ЦД2.
Однак у низці досліджень встановлено зниження апоптозу нейтрофільних гранулоцитів у хворих на ЦД1, особливо в умовах гіперглікемії, що ймовірно ініціює процеси хронічного запалення з пошкодженням тканин, а також привертає до затяжних бактеріальних інфекцій у хворих на цукровий діабет 1 типу.
Отримані нами результати дозволяють вважати, що у хворих на ЦД1 відзначається підвищена схильність ПМЯЛ до апоптозу, що може бути проявом захисної реакції, спрямованої на усунення «надлишку» активних нейтрофілів, формування якого посилює пошкодження тканин.
Збільшення апоптотичного потенціалу нейтрофільних гранулоцитів є відображенням активного залучення ПМЯЛ до імунопатогенезу захворювання.
Підвищення експресії CD95L на нейтрофільних гранулоцитах у хворих на цукровий діабет, ймовірно, може сприяти елімінації не тільки клітин підшлункової залози, а й власних лейкоцитарних клітин.
Таким чином, при оцінці апоптозу імунокомпетентних клітин у дітей, хворих на цукровий діабет 1 типу, встановлено зниження готовності до програмованої клітинної загибелі лімфоцитів та збільшення – поліморфноядерних лейкоцитів.
Найбільш виражені зміни реєструються у віковій групі 7-15 років зі стажем захворювання понад 3 роки. У дітей всіх груп виявлено збільшення частки лейкоцитарних клітин, що експресують на поверхні CD95L.
Відомо, що ПМЯЛ є сполучною ланкою між вродженим та адаптивним імунітетом і виконують чільну роль в антибактеріальному захисті.
Підвищення їх апоптотичної активності може стати причиною низької вікової стійкості дитини, її схильності до інфекційних захворювань.
Зниження кількості лімфоїдних клітин, чутливих до індукції апоптозу, є непрямою ознакою придушення програмованої клітинної загибелі та порушення елімінації активованих форм лімфоцитів.
Висновки
1. У дітей, які страждають на цукровий діабет 1 типу, відзначається зниження готовності до апоптозу лімфоцитів периферичної крові, підвищення - нейтрофілів, що супроводжується зміною експресії CD95 і Bsl2 і залежить від стажу захворювання.
2. Збільшення експресії CD95L на лімфоцитах та нейтрофільних гранулоцитах при ЦД1 може сприяти посиленню процесів запрограмованої клітинної загибелі в острівцевих β-клітинах підшлункової залози, інфільтрованих імунокомпетентними клітинами.
Рецензенти:
Щетинін Є.В., д.м.н., професор, проректор з наукової та інноваційної роботи СтДМУ, завідувач кафедри ДБО ВПО "Ставропольський державний медичний університет" Міністерства охорони здоров'я РФ, м.Ставрополь.
Голубєва М.В., д.м.н., професор, завідувач кафедри дитячих інфекційних хвороб ГБО ВПО "Ставропольський державний медичний університет" Міністерства охорони здоров'я РФ, м.Ставрополь.
Бібліографічне посилання
Баричова Л.Ю., Ердні-Горяєва Н.Е. МАРКЕРИ АПОПТОЗ ІМУНОКОМПЕТЕНТНИХ КЛІТИН ПРИ ЦУКРОВОМУ ДІАБЕТІ 1 ТИПУ У ДІТЕЙ // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2013. - № 4.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=9953 (дата звернення: 18.07.2019). Пропонуємо до вашої уваги журнали, що видаються у видавництві «Академія Природознавства» Розподіл клітин загалом є досить одноманітний процес, званий клітинним циклом. У ньому існує велика кількість «контрольних точок», у яких здійснюється керування переходом клітини від однієї фази циклу до іншої. Руйнування однієї чи кількох «контрольних точок» може призвести як до некерованої проліферації, і до загибелі клітин, зокрема апоптозу. Морфологічна картина апоптозу з усіма характерними ознаками (хроматолізом, відсутністю запальної реакції, клітинним канібалізмом тощо) була описана L. Graper і названа «фізіологічною елімінацією клітин». У 1971 р. J. Kerr запропонував термін «апоптоз» (від лат. аро - с, ptosis - падати) за аналогією з опадає з дерева то тут, то там листям. Протягом апоптозу виділяють три фази - ранню (зменшення розмірів клітини, фрагментація DNA на великі фрагменти), проміжну (подальша фрагментація DNA) та пізню (апоптозні тільця). Апоптоз відіграє у розвитку плаценти людини. З плином вагітності відзначається наростання апоптозних змін у нормально функціонуючій плаценті.
Tertemiz та ін.
у своїй роботі показали, що апоптоз залучений до механізмів фізіологічного регулювання васкулогенезу плаценти. Вас-кулогенез плаценти починається з 21-го дня вагітності і включає появу гемангіобластів і ангіогенних клітинних острівців. Був вивчений васкулогенез плаценти з використанням гістологічного (препарати, пофарбовані гематоксиліном та еозином), імуногістохімічного (виявлення CD31), молекулярно-генетичного (CD31-TUNEL - TdT-mediated X-dUTP nick end labeling) методів та трансмісійної електронної мікроелектроніки. У дослідженні показано, що в ангіогенних клітинних острівцях відсутні CD31-позитивні клітини. Однак, у клітинах примітивних капілярів та у ряді стромальних клітин, розташованих між васкулогенними областями, була виявлена експресія CD31. При морфологічному дослідженні препаратів, пофарбованих гематоксиліном та еозином, у цих клітинах були виявлені ознаки апоптозу – каріопікноз та апоптозні тільця. Ступінь вираженості апоптозу та васкулогенезу в плаценті була прямо пропорційна.
Рівень апоптозу підвищений при порушеннях вагітності, таких як переривання вагітності на ранніх термінах, ектопічна вагітність, прееклампсія.
Проліферація та диференціювання цитотрофобласту та розвиток судин у стромі ворсин вимагають адекватного забезпечення киснем та поживними речовинами, що отримуються з міжворсинчастого простору. Серед ускладнень вагітності затримка внутрішньоутробного розвитку є однією із провідних причин перинатальної смертності. Порушення регуляції апоптозу призводить до зниження числа клітин синцитіотрофобласта, що тягне за собою зменшення надходження поживних речовин до плода та затримки внутрішньоутробного розвитку плода. Levy та ін. пов'язують затримку внутрішньоутробного розвитку з прееклампсією та тютюнопалінням - станами, що призводять до кисневого голодування тканини плаценти. У роботі S. Y. Dai et al. були досліджені плаценти жінок без шкідливих звичок та гестозу, але у яких відзначалася затримка внутрішньоутробного розвитку плодів. Автори припустили, що апоптозні зміни клітин плаценти, що знаходяться в умовах кисневого голодування, можуть регулюватися факторами, що активуються в умовах гіпоксії (hypoxia-inducible factor) - HIF-la, HIF-2a, HIF-1 p.
HIF-1 є основним фактором, який забезпечує адаптацію клітин до гіпоксії.
Він може змінювати експресію низки генів, відповідальних за еритропоез, гліколіз та ангіогенез. У той час як гетеродимер HIF-lp виявляється у всіх клітинах плаценти за будь-яких умов, HIF-la виявляється лише при гіпоксії. Рідше в умовах кисневого голодування у клітинах виявляється HIF-2a, також відомий як EPAS-1. HIF-la та -2a mRNA виявляються у плаценті протягом усієї вагітності, але рівень їх значно варіює залежно від терміну вагітності. Якщо рівень HIF-la mRNA залишається постійним, рівень HIF-2a mRNA наростає з перебігом вагітності. На противагу HIF-la HIF-2a в основному експресується в клітинах ендотелію, граючи важливу роль в ангіогенезі та гемопоезі. У плаценті людини експресія HIF-la та HIF-2a максимально виражена на ранніх термінах, що забезпечує стійкість клітин до фізіологічної гіпоксії, що має місце у цьому періоді вагітності. Крім того, підвищена експресія цих факторів відзначена при прееклампсії.
Наслідком стимулюючого впливу цих факторів на апоптоз є затримка внутрішньоутробного розвитку плода.
Так було в дослідженні S. Y. Dai et al. апоптозний індекс у синцитіотрофобласті ворсин становив 1,45+1,26% у групі із затримкою внутрішньоутробного розвитку та 0,18±0,16 - у контрольній групі, де затримки внутрішньоутробного розвитку плодів не відзначалося (р
У той же час макроскопічно інфаркти, що виявляються, достовірно частіше відзначалися в плацентах групи із затримкою внутрішньоутробного розвитку (50%), ніж у контрольній групі (22%). Ступінь відкладення фібриноїду в міжворсинчастому просторі також був незначно вищим у групі із затримкою внутрішньоутробного розвитку. Мітотична активність елементів трофобласту та клітин крові та судин на термінах вагітності 6 та 12-14 тижнів були вивчені Challier et al. Автори відзначили при терміні вагітності 6 тижнів наявність фігур мітозу та присутність Кд67-позитивних ядер у клітинах цитотрофобласту та еритробластах. У цитотрофобласті ворсин число Ki67-позитивних ядер зменшувалося до 12-14 тижнів вагітності, зберігаючись лише у клітинних острівцях екстравілізного цитотрофобласту. В еритробластах до цього періоду Ki67 не виявляється. В ендотеліальних клітинах у 6 тижнів вагітності мітотичні фігури та експресія Ki67 були відсутні, у 12-14 тижнів вагітності виявлявся лектин UEA1. Відсутність на терміні вагітності 6 тижнів мітотичних фігур та експресії Ki67 у клітинах ендотелію та периваскулярних клітинах вказує на пряму залежність васкулогенезу від стромальних клітин, причому більшою мірою, ніж від трофобласту.
Контроль за клітинним циклом еукаріотичних клітин здійснюється сімейством кіназ, зокрема циклін-залежними кіназами. З першого триместру вагітності в ядрах цитотрофобласта та ендотелії прилеглих до нього судин виявляється циклін D1, експресія якого прогресивно наростає до третього триместру вагітності. CDK4 виявляється в ядрах цитотрофобласта як у першому, так і третьому триместрі вагітності, в той час як СОК4-позитивні клітини ендотелію відзначаються тільки в кінці третього триместру. Це дозволяє припустити, що D1/CDK4 комплекс бере участь у регуляції проліферації клітин цитотрофобласта протягом всієї вагітності, а контролю над ангіогенезом - у третьому триместрі вагітності. Порушення ендокринного, імунологічного балансу, накопичення вільних радикалів призводять до посилення апоптозу у тканинах плаценти. Так, при прееклампсії порушується диференціювання цитотрофобласта та процес його інвазії в матку, що багато в чому зумовлено апоптозом. Відомо, що апоптоз значно частіше зустрічається у зрілій плаценті при вагітності, ускладненій затримкою росту плода, причому в регуляції цього процесу головну роль грає білок р53, протеїн Вс1-2 в ньому не бере участі. Численні дослідження вказують на гіперекспресію р53, а отже, і на збільшення апоптозних клітин у цитотрофобласті при хоріонкарциномі та заносі міхура.
CAD (caspase activated DNase) на фрагменти розміром, кратним 180-200 нуклеотидів. В результаті апоптозу відбувається утворення апоптичних телець-мембранних везикул, що містять цілісні органели та фрагменти ядерного хроматину. Ці тільця поглинаються сусідніми клітинами або макрофагами внаслідок фагоцитозу. Так як позаклітинний матрикс не уражається клітинними ферментами навіть при великій кількості апоптозних клітин, запалення не спостерігається.
Процес апоптозу є необхідним для фізіологічного регулювання кількості клітин організму, для знищення старих клітин, для формування лімфоцитів, які не є реактивними до своїх антигенів (аутоантигенів), для осіннього опадіння листя рослин, для цитотоксичної дії Т-лімфоцитів кілерів, для ембрі зникнення шкірних перетинок між пальцями у ембріонів птахів) та інших.
Порушення нормального апоптозу клітин призводить до неконтрольованого розмноження клітини та появи пухлини.
1. Значення апоптозу
Апоптоз – невід'ємна частина життєдіяльності більшості багатоклітинних організмів. Особливо важливу роль він відіграє у процесах розвитку. Наприклад кінцівки чотирилапих закладаються як лопатоподібні вирости, а формування пальців відбувається завдяки загибелі клітин між ними. Також підлягають апоптозу більше не потрібні клітини, таким чином, зокрема, руйнується хвіст у пуголовків при метаморфозі. У нервовій тканині хребетних під час ембріонального розвитку більше половини нейронів гинуть шляхом апоптозу відразу після утворення.
Також апоптоз є частиною системи контролю за якістю клітин, він дозволяє руйнувати ті з них, які неправильно розташовані, пошкоджені, нефункціональні або потенційно небезпечні для організму. Прикладом можуть бути і B-лімфоцити, які гинуть, якщо не несуть корисних антиген-специфічних рецепторів або несуть автореактивні. Шляхом апоптозу також вмирає більшість лімфоцитів атківованих при інфекції після його подолання.
У дорослих організмів одночасне регулювання проліферації клітин та апоптозу дозволяє підтримувати стали розміри цілої особини та її окремих органів. Наприклад, після застосування препарату фенобарбітал, що стимулює проліферацію гепатоцитів, у щурів збільшується печінка. Однак відразу після припинення дії цієї речовини всі зайві клітини підлягають апоптозу, в результаті чого розмір печінки повертається до нормального.
Також апоптоз відбувається, коли клітина "відчуває" велику кількість внутрішніх ушкоджень, які вона не може репарувати. Наприклад, у разі пошкодження ДНК клітина може трансформуватися в ракову, щоб цього не сталося вона, за нормальних умов, "кінчає життя самогубством". Також гине шляхом апоптозу велика кількість клітин, інфікованих вірусами.
2. Маркери апоптичних клітин
Маркери апоптозу
Виявлення фрагментації ДНК в апоптичних клітинах методом TUNEL Препарат тканини печінки миші, ядро апоптичної клітини має коричневе забарвлення, оптичну мікроскопію.
Виявлення фрагментації ДНК у апоптичних клітинах за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Зліва: ДНК виділеної з апоптичних клітин - видно "драбинку ДНК"; посередині: маркери; справа: контрольний зразок ДНК із необроблених клітин. Клітинна лінія H4IIE (гепатома щурів), індуктор апоптозу - паракват, візуалізація за допомогою етидій броміду.
Зверху: виявлення конденсації та фрагментації хроматину шляхом зафарбовування флуоресцентним барвником (Hoechst 34580). Посередині: виявлення транслокації фосфадиділсерину у зовнішній листок плазмалемми шляхом зафарбовування анексіном V. Знизу: Мікрофотографія апоптичних клітин у світлому полі. Клітинна лінія - Jurkat, індуктор апоптозу - TRAIL, конфокальноїі світопильна оптична мікроскопія.
Клітини, що гинуть шляхом апоптозу, можна розпізнати за низкою морфологічних ознак. Вони стають меншими і більш щільними (пікноз), округляються і втрачають псевдоподію, в них руйнується цитоскелет, розпадається ядерна мембрана, хроматин конденсується і фрагментується. На поверхні клітин з'являється велика кількість бульбашок, якщо клітини досить великі, то вони розпадаються на оточені мембранами фрагменти – апоптичні тільця.
В апоптичних клітинах окрім морфологічних відбувається також велика кількість біохімічних змін. Зокрема ДНК розрізається спеціальними нуклеазами в лінкерних ділянках між нуклеосомами на фрагменти рівної довжини. Тому при поділі всієї ДНК апоптичної клітини за допомогою електрофорезу можна спостерігати характерну "драбинку". Інший метод виявлення фрагментації ДНК - мітки її вільних кінців за допомогою методу TUNEL ( T erminal deoxynucleotidyl transferase d U TP n ick e nd l abeling ) .
Зміни зазнає також плазматична мембрана апоптичних клітин. За нормальних умов негативно заряджений фосфоліпід фосфатидилсерин міститься тільки в її внутрішньому (поверненому до цитозолю) шарі, проте під час апоптозу він "перескакує" у зовнішній листок. Ця молекула служить сигналом "з'їж мене" для ближніх фагоцитів. Фосфатидилсерін-індуковане поглинання апоптичних клітин, на відміну від інших типів фагоцитозу, не призводить до виділення медіаторів запалення. Описана зміна плазмалемме лежить в основі ще одного методу виявлення клітин, що гинуть шляхом апоптозу - забарвлення анексином V, специфічно зв'язується з фосфатидилсерином.
3. Каспаз – медіатори апоптозу
Клітинні системи, що забезпечують проходження апоптозу, аналогічні у всіх тварин, центральне місце в них посідає сім'я білків каспаз. Каспаз - це протеази, що мають в активному центрі залишок цистеїну, і розрізають свої субстрати за специфічним залишком аспарагінової кислоти (звідси назва: cвід cysteineі aspвід aspartic acid). Каспази синтезуються в клітині у вигляді неактивних прокаспаз, які можуть ставати субстратами для інших, вже активованих каспаз, що ріжуть їх в одному або двох місцях залишку аспартату. Два утворені фрагменти – більший та менший – з'єднуються між собою, формуючи димер, що асоціює з таким самим диммером. Сформований таким чином тетрамер є активною протеазою, що може розрізати білки-субстрати. Крім ділянок, що відповідають більшій та меншій субодиницях, прокаспази іноді також містять інгібіторні продомени, які деградують після відщеплення.
Внаслідок розщеплення та активації одних каспаз іншими формується протеалітичний каскад, який суттєво посилює сигнал та робить апоптоз з певного моменту незворотним процесом. Ті прокаспази, які починають цей каскад, називаються ініціаторним, а їхні субстрати - ефекторними. Після атківації ефекторні каспази можуть розщеплювати інші ефекторні прокаспази або білки-мішені. До мішеней ефекторних каспаз, що руйнуються під час апоптозу, належать зокрема білки ядерної ламіни, розщелення яких призводить до розпаду цієї структури. Також деградує білок, при нормальних умовах пригнічує CAD ендонуклеази, внаслідок цього починається фрагментація ДНК. Розщеплюються каспаз і білки цитоскелета та міжклітинної адгезії, внаслідок чого апоптичні клітини округляються та від'єднуються від сусідніх клітин, і таким чином стають легше мішенню для фагоцитів.
Набір каспаз, необхідний для проходження апоптозу, залежить від типу тканини та шляху, яким активується клітинна смерть. Наприклад, у мишей при "виключенні" гена, що кодують ефекторні каспази-3, апоптоз не відбувається в мозку, проте нормально протікає в інших тканинах.
Гени прокаспаз активні у здорових клітинах, а отже білки необхідні для протікання апоптозу, що постійно присутні, потрібна лише їх активація для запуску клітинного суїциду. До складу ініціаторних прокаспаз входить довгий продомен, що містить CARD ( caspase recruitment domain , Домен залучення каспаз). CARD дозволяє ініціаторним прокаспазам приєднуватися до адаптерних білків утворюючи активаційні комплекси, коли клітина отримує сигнал, що стимулює апоптоз. В активаційних комплексах кілька молекул прокаспаз виявляються безпосередньо поблизу один одного, чого достатньо для переходу в активний стан, після чого вони розрізають один одного.
Два краще вивчені сигнальні шляхи активації каскаду каспаз в клітинах ссавців називаються зовнішнім і внутрішнім (мітохондріальним), кожен з них використовує власні ініціаторні прокаспази.
4. Шляхи активації апоптозу
4.1. Зовнішній шлях
Клітина може отримувати сигнал, що індукує апоптоз, ззовні, наприклад, цитотоксичних лімфоцитів. У такому разі активується так званий зовнішній шлях ( extrinsic pathway), що починається з рецепторів смерті. Рецептори смерті - це трансмембранні білки, що належать до сімейства рецепторів фактора некрозу пухлин (ФНП), наприклад, сам рецептор ФНП і рецептор смерті Fas. Вони формують гомотримери, в яких кожен мономер має позаклітинний ліганд-зв'язковий домен, трансмембранний домен і цитоплазматичний домен смерті, через адаптерні білки залучає та активує прокаспази.
Ліганди рецепторів смерті також гомотримерами. Вони споріднені між собою і належать до сімейства сигнальних молекул фактора некрозу пухлин. Наприклад, цитотоксичні лімфоцити несуть на своїй поверхні ліганди Fas, які можуть приєднуватися до рецепторів смерті Fas на плазмалемі клітин-мішеней. У такому разі внутрішньоклітинні домени цих рецепторів з'єднуються з адаптерним білком ( FADD, Fas-associated death domain ), а ті у свою чергу залучають ініціаторні прокаспази 8 та/або 10. Внаслідок цієї серії подій формується сигнальний комплекс, що індукує смерть, - DISC ( death inducing signaling complex ). Після активації в цьому комплексі ініціаторні каспази розрізають ефекторні прокаспази і запускають апоптичний каскад.
Багато клітин синтезують молекули, певною мірою захищають їхню відмінність від активації зовнішнього шляху апоптозу. Прикладом такого захисту може бути експресія так званих рецепторів-приманок ( decoy receptors), що мають позаклітинні домени зв'язування лігандів, проте не цитоплазматичних доменів сметри, а отже не можуть запускати апоптозу і конкурують із звичайними рецепторами смерті за ліганди. Клітини також можуть продукувати білки, що блокують зовнішній шлях апоптозу, наприклад FLIP, схожий структурою прокаспаз 8 і 10, проте не протеалітичної активності. Він пригнічує зв'язування ініціаторних прокаспаз із комплексом DISC.
4.2. Внутрішній шлях
Апоптосома
Апоптоз також може запускатися зсередини клітини, наприклад, у разі її травмування, пошкодження ДНК, нестачі кисню, поживних речовин або позаклітинних сигналів виживання. У хребетних цей сигнальний шлях називається внутрішнім ( intrinsic pathway) Або мітохондріальною, ключовою подією в ньому є вивільнення певних молекул з міжмембранного простору мітохондрій. До таких молекул зокрема належить цитхром c, що за звичайних умів входити до електронно-транспортної цепочки мітохондрій, проте у цитоплазмі виконує іншу функцію - приєднується до адаптерного білка Apaf ( apoptotic protease activating factor-l ), викликаючи його олігомеризації в колесоподібну семичленну структуру, яка називається апоптосома. Апоптосома приваблює та активує ініціаторну прокаспазу-9, яка потім може активувати ініціаторну прокаспазу.
У деяких клітинах зовнішній шлях апоптозу повинен активувати внутрішній для того, щоб ефективно знищити клітину. Внутрішній шлях суворо регулюється білками сім'ї Bcl-2.
4.2.1. Регуляція внутрішньої дороги білками сім'ї Bcl-2
До сімейства Bcl-2 відносяться еволюційно-консервативні білки, головною функцією яких є регуляція вивільнення цитохрому c та інших молекул з міжмебранного простору мітохондрій. Серед них є про-апоптичні та анти-апоптичні молекули, які можуть взаємодіяти між собою в різних комбінаціях, пригнічуючи один одного, баланс між їхньою активністю та визначати долю клітини.
Зараз відомо близько 20 білків із цієї сім'ї, всі вони містять хоча б один із чотирьох альфа-спіральних доменів гомології Bcl2, званих BH1-4 ( bcl2 homology). Антиапоптичні білки сім'ї Bcl2 містять усі чотири домени, до них відносяться сам Bcl-2, а також Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 та A1. Проапоптичні білки поділяються на дві групи, члени першої з яких містять три BH-домени (BH1-3), зокрема Bak, Bax і Bok (останній експресується тільки в тканинах репродуктивних органів). Найбільш численною серед родини Bcl-2 є друга група проапоптичних білків, які містять лише домен BH3 (BH3-only), до неї відносяться Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.
За нормальних умов (тобто коли клітина не проходить апоптозу) антиапоптичні білки, такі як Bcl-2 та Bcl-X L, зв'язуються з проапоптичними білками BH123 (Bax та Bak) та не дозволяють їм полімеризуватися у зовнішній мембрані мітохондрій утворюючи пори. В результаті дії певного апоптичного стимулу в клітині активуються або починають синтезуватися проапоптичні білки, що містять лише домен BH3. Вони у свою чергу пригнічують антиапоптичні білки, знімаючи пригнічуючу дію на Bak і Bax, або безпосередньо взаємодіють з останніми та сприяють їх олігомеризації та утворенню пір. Внаслідок пермеабілізації зовнішньої мембрани в цитозоль потрапляє цитохром c, а також інші медіатори апоптозу, такі як AIF (англ. apoptosis inducing factor ).
Наприклад, при нестачі сигналів виживання в клітині за посередництвом MAP-кінази JNK активується експресія BH3 білка Bim, що запускає внутрішній шлях апоптозу. У разі пошкодження ДНК відбувається накопичення супресора пухлин p53, який стимулює транскрипцію генів, що кодують BH3 білки Puma та Noxa, які також забезпечують проходження апоптозу. Ще один BH3 білок - Bid забезпечує зв'язок між зовнішнім та внутрішнім шляхами апоптозу. Після активації рецепторів смерті і, як наслідок, каспази-8, остання розрізає Bid з утворенням усіченої форми tBid (truncated Bid), яка переміщається до мітохонрію, де пригнічує Bcl-2.