☰

Основи пцр. Полімеразна ланцюгова реакція. застосування ПЛР у практиці служби крові

Сайт надає довідкову інформацію виключно для ознайомлення. Діагностику та лікування захворювань потрібно проходити під наглядом фахівця. Усі препарати мають протипоказання. Консультація фахівця є обов'язковою!

Метод полімеразної ланцюгової реакціїбув відкритий майже тридцять років тому американським вченим на ім'я Керрі Мюлліс. Методика широко поширена в медицині як діагностичний інструмент, і суть її полягає в копіюванні ділянки ДНК за допомогою спеціального ферменту ( полімерази) штучним шляхом у пробірці.

У яких сферах медицини застосовується цей метод?

Для чого виконується копіювання ДНК і як це може стати медициною?
Ця методика дозволяє:
  • Виділяти та клонувати гени.
  • Діагностувати генетичні та інфекційні захворювання.
  • Визначати батьківство. Дитина частково успадковує від своїх біологічних батьків генетичні особливості, проте має у своїй свою власну унікальну генетичну ідентифікацію. Наявність у нього деяких генів, ідентичних батьківським генам – дозволяє говорити про встановлення спорідненості.
Полімеразна ланцюгова реакція застосовується також у криміналістичній практиці.

На місці злочину судмедексперти збирають зразки генетичних матеріалів. До них відносяться: волосся, слина, кров. Згодом, завдяки методиці полімеразної реакції, можна ампліфікувати ДНК та порівняти ідентичність взятої проби з генетичним матеріалом підозрюваної людини.

У медицині ефективно використовується полімеразна ланцюгова реакція:

  • У пульмонологічній практиці – для диференціації бактеріальних та вірусних видів пневмонії, туберкульозу.
  • У гінекологічній та урологічній практиці – для визначення уреаплазмозу, хламідіозу, мікоплазмової інфекції, гарднереллезу, герпесу, гонореї.
  • У гастроентерологічній практиці.
  • У гематології – для визначення онковірусів та цитомегаловірусної інфекції.
  • В експрес-діагностиці таких інфекційних захворювань як вірусні гепатити, дифтерія, сальмонельоз.


В даний час найбільш поширений даний метод у діагностиці інфекційних хвороб ( гепатитів вірусної етіології, ВІЛ, венеричних захворювань, туберкульозу, кліщового енцефаліту.).

Що відбувається під час перебігу реакції?


Сама реакція є хімічно нескладною. Джерелом ДНК для реакції може бути крапля крові, волосся, шматочок шкіри, і т.д. Теоретично, щодо реакції потрібні необхідні реагенти, пробірка, проба з біологічного матеріалу і джерело тепла.

Полімеразна реакція дозволяє виявити інфекцію, навіть якщо в пробі з біологічним матеріалом знаходиться лише одна або кілька ДНК-молекул збудника.

Під час протікання реакції завдяки ферменту ДНК-полімерази відбувається подвоєння ( реплікація) ділянки ДНК. Сама ж дезоксирибонуклеїнова кислота ( скорочено ДНК) важлива для нас тим, що забезпечує зберігання та передачу дочірнім клітинам генетичної інформації. ДНК має вигляд спіралі, яка складається з блоків, що повторюються. Ці блоки становлять нуклеотиди, які є найменшою часткою ДНК. Нуклеотиди утворюються із амінокислот.

Процес реплікації ділянок ДНК відбувається під час циклів, що повторюються. Кожен такий цикл копіюється і подвоюється як вихідний фрагмент ДНК, а й ті фрагменти, які вже подвоїлися у минулий цикл ампліфікації. Усе це нагадує процес геометричної прогресії.

Існує:

  • Природна ампліфікація ( тобто процес копіювання та розмноження ДНК), що відбувається у нашому організмі і є детермінованим, зумовленим процесом.
  • Штучна ампліфікація, що відбувається завдяки полімеразній ланцюговій реакції. У цьому випадку процес копіювання є керованим і дає змогу подвоїти навіть короткі ділянки нуклеїнової кислоти.
Після завершення кожного циклу копіювання кількість фрагментів нуклеїнової кислоти зростає в геометричній прогресії. Саме тому процес називають «ланцюговою реакцією».

Через тридцять - сорок циклів кількість фрагментів сягає кількох мільярдів.

Для ампліфікації in vitro (у пробірці) необхідно, щоб у біосередовищі, взятому для діагностики, був присутній специфічний чужорідний фрагмент ДНК ( тобто ДНК не пацієнта, а збудника). Якщо в створеному розчині не буде специфічний фрагмент - ланцюгова реакція під дією полімерази не піде. Цим і пояснюється факт високої специфічності ПЛР.

Етапи ПЛР-діагностики

1. З досліджуваного матеріалу виділяють ДНК.
2. Додають ДНК у спеціальний розчин із нуклеотидів.
3. Нагрівають розчин до температури 90 - 95 градусів Цельсія, щоб білок ДНК згорнувся.
4. Знижують температуру до 60 градусів.
5. При повторенні циклів підвищення-зниження температури кількість ділянок нуклеїнової кислоти зростає.

6. Шляхом проведення електрофорезу підбивається підсумок, і підраховуються результати подвоєння.

Які переваги має ця діагностика?


  • Універсальність: для цього підходять будь-які зразки нуклеїнової кислоти.
  • Висока специфічність: збудник має унікальні послідовності ланцюжків ДНК, властиві саме йому. Тому результати проведеної ПЛР будуть достовірними, у них неможливо сплутати ген одного збудника з геном іншого збудника.
  • Чутливість до наявності навіть одиничної молекули збудника.

  • Невеликий обсяг матеріалу, який буде необхідний дослідження. Підійде навіть крапля крові. Можливість отримати результат, використавши мінімальний обсяг проби, є дуже важливою для педіатричних, неонатологічних, неврологічних досліджень, а також у практиці судової медицини.
  • Можливість визначення млявої, хронічної інфекції, а не тільки гострої.
  • Багато хвороботворних культур дуже складно культивувати в пробірці іншими методиками, а полімеразна реакція дозволяє розмножити культуру в потрібній кількості.

Які недоліки має ця діагностика?

  • Якщо у матеріалі, призначеному щодо ПЛР, перебуває ДНК як живого збудника, а й загиблого – відбуватиметься ампліфікація обох ДНК. Відповідно лікування після діагностики може бути призначене не зовсім правильне. За деякий час краще пройти контроль ефективності проведеного лікування.
  • Підвищена чутливість до наявності мікроорганізмів теж може вважатися, певною мірою, недоліком. Адже в нормі в людському організмі є умовно-патогенна мікрофлора, тобто це мікроорганізми, які живуть в кишечнику, шлунку, інших внутрішніх органах. Ці мікроорганізми можуть завдати шкоди людині лише за певних несприятливих умов – недотримання гігієнічних вимог, забруднена питна вода тощо. ПЛР-методика ампліфікує ДНК навіть цих мікроорганізмів, хоча вони не призводять до патології.
  • ПЛР різних тест-систем може показувати результати, які відрізнятимуться між собою. Існує багато модифікацій цієї методики: « вкладена», « асиметрична», « інвертована», « кількісна» ПЛР та інші.

Наприкінці статті див.
Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР, PCR)винайшов у 1983 році Кері Мюлліс (американський вчений). Згодом він отримав за цей винахід Нобелівську премію. В даний час ПЛР-діагностика є одним з найточніших і чутливих методів діагностики інфекційних захворювань.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)- експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій певних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) у біологічному матеріалі (пробі).
В основі методу ПЛР лежить багаторазове подвоєння певної ділянки ДНК за допомогою ферментів у штучних умовах (in vitro). Через війну напрацьовуються кількості ДНК, достатні візуальної детекції. При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо вона присутня у досліджуваному зразку.
Крім простого збільшення кількості копій ДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній та медичній практиці, наприклад, для діагностики захворювань (спадкових, інфекційних) для встановлення батьківства, для клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів.

Специфічність та застосування

Проведення ПЛР

Для проведення ПЛР у найпростішому випадку потрібні такі компоненти:

  • ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, яку потрібно ампліфікувати;
  • два праймери, комплементарні кінцям необхідного фрагмента;
  • термостабільна ДНК-полімераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфати (A, G, C, T);
  • іони Mg2+, необхідні для роботи полімерази;
  • буферний розчин.

ПЛР проводять в ампліфікаторі - приладі, що забезпечує періодичне охолодження та нагрівання пробірок, зазвичай з точністю не менше ніж 0,1°C. Щоб уникнути випаровування реакційної суміші, в пробірку додають висококипляче масло, наприклад, вазелінове. Додавання специфічних ферментів може збільшити вихід ПЛР-реакції.
Хід реакції

Зазвичай під час проведення ПЛР виконується 20 - 35 циклів, кожен із яких складається з трьох стадій. Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94 - 96°C (або до 98°C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5 - 2 хвилини, щоб ланцюга ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією – руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами. Іноді перед першим циклом проводять попередній прогрівання реакційної суміші протягом 2 - 5 хвилин для повної денатурації матриці та праймерів.
Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з матрицею одноланцюгової. Ця стадія називається відпалом. Температура відпалу залежить від праймерів і зазвичай вибирається на 4 - 5 ° С нижче за їх температуру плавлення. Час стадії – 0,5 – 2 хвилин.

ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюг, використовуючи праймер як затравку. Це – стадія елонгації. Температура елонгації залежить від полімерази. Полімерази, що часто використовуються, найбільш активні при 72°C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагмента, що ампліфікується. Зазвичай час елонгації приймають рівним одній хвилині на тисячу пар підстав. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюгові фрагменти. Ця стадія триває 10 – 15 хв.
Підготовка матеріалу до дослідження та транспорт його до лабораторії

Для успішного проведення аналізу важливо правильно зібрати матеріал у пацієнта та правильно провести його підготовку. Відомо, що у лабораторній діагностиці більшість помилок (до 70%) відбувається саме на етапі пробопідготовки. Для взяття крові в лабораторії ІНВІТРО в даний час застосовуються вакуумні системи, які з одного боку мінімально травмують пацієнта, а з іншого - дозволяють взяти матеріал таким чином, що він не контактує ні з персоналом, ні з навколишнім середовищем. Це дозволяє уникнути контамінації (забруднення) матеріалу та забезпечує об'єктивність аналізу ПЛР.

ДНК – дезоксирибонуклеїнова кислота - біологічний полімер, один із двох типів нуклеїнових кислот, що забезпечують зберігання, передачу з покоління в покоління та реалізацію генетичної програми розвитку та функціонування живих організмів. Основна роль ДНК у клітинах – довготривале зберігання інформації про структуру РНК та білків.


РНК-рібонуклеїнова кислота - біологічний полімер, близький за своєю хімічною будовою до ДНК. Молекула РНК побудована з тієї ж мономерних ланок - нуклеотидів, як і ДНК. У природі РНК, зазвичай, існує як одиночної ланцюжка. В деяких вірусів РНК є носієм генетичної інформації. У клітині відіграє важливу роль передачі інформації від ДНК до білка. РНК синтезується на ДНК-матриці. Цей процес називається транскрипцією. У ДНК є ділянки, де міститься інформація, відповідальна за синтез трьох видів РНК, що розрізняються за функціями, що виконуються: інформаційної або матричної РНК (мРНК), рибосомальної (рРНК) і транспортної (тРНК). Усі три виду РНК у той чи інший спосіб беруть участь у синтезі білка. Однак інформація щодо синтезу білка міститься тільки в мРНК.


Нуклеотиди - основна одиниця, що повторюється, в молекулах нуклеїнових кислот, продукт хімічної сполуки азотистої основи, п'ятивуглецевого цукру (пентози) і однієї або декількох фосфатних груп. Нуклеотиди, представлені у нуклеїнових кислотах, містять одну фосфатну групу. Вони називаються по азотистому підставі, що міститься в них - аденіновий (A), що містить аденін, гуаніновий (G) - гуанін, цитозиновий (C) - цитозин, тіміновий (Т) - тимін, урациловий (U) - урацил. До складу ДНК входять 4 типи нуклеотидів – A, T, G, C, до складу РНК також 4 типи – A, U, G, C. Цукром у складі всіх нуклеотидів ДНК є дезоксирибоза, РНК – рибоза. При утворенні нуклеїнових кислот нуклеотиди, зв'язуючись, утворюють сахаро-фосфатний кістяк молекули, по один бік якого знаходяться основи.


Праймер - коротка ДНК, яка використовується для реплікації матричного ланцюга. Кожен із праймерів комплементарний одному з ланцюгів дволанцюжкової матриці, обрамляючи початок і кінець ділянки, що ампліфікується.


Література

  1. Глік Би., Пастернак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування. Пров. з англ. - М: Мир, 2002. - 589 с., Ілл. ISBN 5-03-003328-9
  2. Щелкунов С.М. Генетична інженерія – Новосибірськ: Сиб. унів. вид-во, 2004. – 496 с.; ілл. ISBN 5-94087-098-8
  3. Патрушев Л.І. Штучні генетичні системи - М.: Наука, 2005 - 2 т. - ISBN 5-02-033278-X

ВАЖЛИВО!

Інформацію з цього розділу не можна використовувати для самодіагностики та самолікування. У разі болю чи іншого загострення захворювання діагностичні дослідження повинен призначати лише лікар. Для встановлення діагнозу і правильного призначення лікування слід звертатися до Вашого лікаря.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, PCR – polymerase chain reaction) – метод отримання безлічі копій певних фрагментів ДНК (генів) у біологічному зразку.

Сутність ПЛР як методу молекулярної біології полягає у багаторазовому вибірковому копіюванні певного гена (дільниці ДНК) за допомогою спеціальних ферментів в умовах in vitro. Важливою особливістю ПЛР є отримання копій конкретної ділянки ДНК (гену), що відповідає заданим умовам. Синонімом процесу копіювання ДНК є "ампліфікація". Реплікація ДНК in vivoтакож може вважатися ампліфікацією. Однак, на відміну від реплікації, у процесі полімеразної ланцюгової реакції ампліфікуються короткі ділянки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидів).

Основні засади

Отже, ПЛР - це багаторазове копіювання певних фрагментів ДНК in vitro в процесі температурних циклів, що повторюються. Як же відбувається процес реакції в межах одного температурного циклу?

Утворення нуклеотидного ланцюга здійснюється ферментом ДНК-полімеразою. Однак для початку роботи ферменту необхідний стартовий майданчик. Як майданчики виступають "праймери" (затравки) - синтетичні олігонуклеотиди довжиною 15-20 нуклеотидів. Праймерів має бути два (прямий і зворотний), вони комплементарні ділянкам ДНК-матриці і саме фрагмент ДНК, обмежений праймерами, багаторазово копіюватиметься ДНК-полімеразою. Робота полімерази полягає в послідовному додаванні нуклеотидів, комплементарних послідовності ДНК-матриці. Тим самим в одному температурному циклі знову синтезується два нових фрагменти ДНК (т.к. молекула ДНК - дволанцюжкова, то і матриць спочатку дві). Таким чином, за 25-35 циклів у пробірці накопичуються мільярди копій ділянки ДНК, визначеної праймерами. Структуру окремого циклу можна представити так:

  1. денатурація ДНК (плавлення, розбіжність ланцюгів ДНК) – 95°С – 1 або 2 хвилини;
  2. відпал праймерів (затравки зв'язуються з ДНК-матрицею, температура цієї стадії визначається нуклеотидним складом праймера) - 60 ° С (наприклад) - 1 хвилина;
  3. елонгація ДНК (полімераза синтезує ланцюг ДНК) - 72°С - 1 хвилина (час залежить від довжини фрагмента, що синтезується).

Приладова база для застосування методу полімеразної ланцюгової реакції в лабораторії повинна складатися з:

  1. (або, як його ще називають термоциклера);
  2. системи для с (для візуалізації результатів ПЛР);
  3. системи (для аналізу результатів ПЛР);
  4. (Для пробопідготовки);
  5. набору (механічних чи електронних).

Крім основного та допоміжного обладнання для повноцінного функціонування ПЛР-лабораторії необхідні деякі витратні матеріали: стерильні наконечники, пробірки, штативи для пробірок і дозаторів.

Реагентна база в звичайній ПЛР-лабораторії для проведення повноцінної полімеразної ланцюгової реакції включає фермент ДНК-полімеразу з буфером, праймери (невеликі синтетичні фрагменти ДНК, комплементарні початку і кінці аналізованої ділянки ДНК-матриці), суміш нуклеотидів (А, Т, Г, Ц). Також абсолютно потрібна очищена вода.

Переваги методу ПЛР

Висока чутливість дослідження

Чутливість методу така, що ампліфікувати ПЛР і виявити цільову послідовність можна навіть у тому випадку, якщо вона зустрічається одного разу в зразку з 5 клітин.

Специфіка аналізу

ПЛР дозволяє виявляти ДНК конкретного інфекційного агента у присутності ДНК інших мікроорганізмів та ДНК організму-господаря, а також проводити генотипування. Специфічно підбираючи компоненти реакції (праймери), Ви можете одночасно виявляти ДНК близьких мікроорганізмів.

Універсальність методу ПЛР

Справа в тому, що для ПЛР-діагностики інфекційних захворювань, або спадкових захворювань людини можна використовувати те саме обладнання, слідувати універсальним процедурам підготовки зразків (проб) і постановки аналізу, а також однотипні набори реактивів.

Економія часу

Важлива перевага ПЛР – відсутність стадій культуральної мікробіологічної роботи. Підготовка зразків, проведення реакції та аналіз результатів максимально полегшений та багато в чому автоматизований. Завдяки цьому час отримання результату може скорочуватися до 4-5 годин.

Ефективність методу ПЛР

Широта досліджуваного клінічного матеріалу

Як зразок при полімеразній ланцюговій реакції може бути використаний не тільки біологічний матеріал від хворого, але також і багато інших субстратів, в яких можуть бути ідентифіковані молекули ДНК з високою чутливістю, наприклад, вода, грунт, продукти харчування, мікроорганізми, змив та багато іншого .

Всі перелічені вище переваги цього унікального методу - висока чутливість і специфічність, ідентифікація інфекційного агента та проведення генотипування будь-якого гена людини, висока ефективність та економія часу, універсальність приладової бази - дозволяють широко застосовувати сьогодні метод ПЛР у клінічній діагностиці, медичній практиці, наукових дослідженнях якості та багатьох інших областях.

Застосування ПЛР

Області застосування полімеразної ланцюгової реакції як сучасного методу молекулярної біології різноманітні. Багато в чому це обумовлено широтою матеріалу, який можна аналізувати (практично все, з чого можна виділити більш-менш якісну ДНК може стати об'єктом дослідження), а також підібраних праймерів. Основні сфери застосування ПЛР:

клінічна медицина

  • діагностика інфекційних захворювань
  • діагностика спадкових захворювань
  • виявлення мутацій
  • генотипування
  • клітинні технології
  • створення генетичних паспортів

екологія

  • моніторинг стану довкілля
  • аналіз продуктів харчування
  • аналіз генетично-модифікованих організмів (ГМО)

судова медицина та криміналістика

  • ідентифікація особи
  • встановлення батьківства

фармакологія

ветеринарія

наукові дослідження (молекулярна біологія, генетика)

Організація лабораторії ПЛР

Інформація для замовлення
Найменування Об'ємВиробництвоМетод Кат.Номер

Зміст

Тим, хто цікавиться новими способами діагностики, слід дізнатися, що таке метод ПЛР. Сучасні технічні можливості в галузі лабораторних досліджень дають можливість виявляти безліч захворювань на початкових стадіях. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) вважається на даний момент найточнішим і новим методом.

Аналіз методом ПЛР

ПЛР аналіз – що це таке? Цей метод використовує принципи молекулярної біології. Для дослідження матеріалу застосовуються спеціальні ферменти, які багаторазово і швидко копіюють ДНК, фрагменти РНК збудників хвороби. Існує різні види ПЛР аналізу залежно від матеріалу, що досліджується (кров, сеча, кал і т.д.). Після обробки співробітники лабораторії порівнюють з базою даних отриманий результат, виявляють концентрацію тип збудника.

Аналіз на ПЛР поміщають у спеціальний ампліфікатор (прилад), який нагріває та охолоджує пробірки з біоматеріалом. Зміни температури необхідні реплікації фрагментів. Точність результату залежатиме від точності температурного режиму. Метод полімеразної ланцюгової реакції допомагає виявити:

  • інфекційний мононуклеоз;
  • цитомегаловірусну інфекцію;
  • вірусні гепатити G, C, B, A;
  • інфекції/захворювання, що передаються статевим шляхом (ІПСШ/ЗПСШ): гарднереллез, трихомоніаз, уреаплазмоз;
  • герпетичну інфекцію;
  • онкогенні віруси;
  • листеріоз;
  • хелікобактерну інфекцію;
  • кліщовий енцефаліт, бореліоз;
  • туберкульоз;
  • кандидоз.

Крові

На даний момент через новизну технології аналіз крові методом ПЛР все ще має високу ціну. Для підготовки біоматеріалу не потрібно дотримуватись певних вимог. Навіть спричинені фізичними навантаженнями, стресами, зміною раціону харчування зміни складу не впливають на результат дослідження. ПЛР аналіз крові може зіпсувати лише прийом антибактеріальних засобів, тому перед здаванням необхідно витримати паузу між лікуванням та тестом.

ПЛР дослідження крові – найпоширеніший варіант діагностики хронічних, гострих інфекційних патологій при вірусному чи атиповому прояві. Серологічні методи дослідження мають певні труднощі під час проведення – визначення наявності збудника проводиться за наявності антитіл в людини. Результат міг бути хибнонегативним, якщо стан хворого не давав час для їх вироблення.

Мазка

У сфері гінекології на дослідження наявності інфекційних мікроорганізмів використовують ПЛР аналіз мазка. p align="justify"> Робота з матеріалом проводиться за тим же принципом, що і з кров'ю: багаторазове збільшення фрагментів ДНК збудника, щоб з легкістю його ідентифікувати. Це ж допомагає виявити приховані інфекції у жінки. Для проведення аналізу можуть бути взяті різні біологічні рідини: слина, харкотиння, сеча, кров. У гінекології для точності визначення частіше використовується мазок зі слизової оболонки піхви з цервікального каналу.

Для ПЛР існують певні показання. Нерідко його потрібно зробити, щоб виявити стійкий до антибіотиків вид збудника. У жінок основними показаннями для діагностики за цим методом є:

  • вагітність, яка протікає тяжко;
  • гостра фаза ІПСШ;
  • якщо є підозра на перехід ІПСШ у хронічну стадію;
  • пошук причин безплідності.

Кала

Для виявлення інфекції може бути призначений з боку лікаря аналіз калу на ПЛР. Щоб отримати максимально достовірні результати після тесту, необхідно дотримуватися наступних правил перед забором біоматеріалу:

  • за кілька діб припинити прийом проносних препаратів: олії, свічки;
  • виключити медикаменти, що дають специфічне забарвлення калу, наприклад, із вмістом заліза.

Сечі

При необхідності для проведення тесту лікар може взяти на дослідження сечу. Висока точність відкриває можливість працювати з будь-якою біологічною рідиною, з якої вдається отримати ДНК вірусу. Щоб здати аналіз сечі ПЛР, потрібно дотримуватись таких обмежень перед забором матеріалу:

  • щонайменше за 1 день до процедури припинити статеві контакти;
  • за 3 тижні до здачі має бути закінчено будь-яке антибактеріальне лікування, тому що медикаменти змастить картину;
  • здавати аналіз потрібно натще (рідина теж заборонена);
  • брати потрібно першу ранкову порцію матеріалу.

Результати аналізів ПЛР

Зі вищенаписаного зрозуміло, що таке ПЛР аналіз і видно явні переваги такого методу дослідження. Ще один плюс цієї діагностичної процедури - простота розшифровки результатів. Враховуючи, скільки робиться аналіз ПЛР (сам процес займає близько 5 годин, але лабораторія видає дані через 1-2 доби), даний метод діагностики стає найкращим варіантом для визначення безлічі інфекцій. За результатами лікар може сказати вам, що тест:

  1. Негативний – у досліджуваному матеріалі був шуканого збудника.
  2. Позитивний – знайшли РНК, ДНК збудника.

Іноді проводиться кількісне визначення мікроорганізмів. Це необхідно при захворюваннях, що викликають умовно-патогенні збудники. Особливість цих вірусів у тому, що виявляються вони лише за надмірної кількості та знайти їх звичайними дослідженнями вкрай проблематично. Цей фактор є важливим для вибору терапевтичної тактики, щоб ефективно лікувати вірусні інфекції, наприклад, гепатит, ВІЛ.

На 12 інфекцій

Щоб зрозуміти, що таке ПЛР діагностика інфекцій і наскільки вона ефективна, потрібно дізнатися, що вона здатна виділяти до 12 збудників. Проводиться текст лише у лабораторних умовах. Для дослідження застосовують спеціальні ферменти, які багато разів збільшують кількість РНК, ДНК фрагментів вірусу. Аналіз ПЛР на 12 інфекцій здатний виявити:

  • мікобактерії туберкульозу;
  • цитомегаловірус;
  • гепатит C, G, B, A;
  • герпес 1, 2 типи;
  • вірус Епштейн-Барра (інфекційний мононуклеоз);
  • інфекції, що передаються статевим шляхом, наприклад, хламідії;
  • листеріоз;
  • кандидозну інфекцію;
  • хелікобактер пилори;
  • бореліоз, кліщовий енцефаліт.

На гепатит С

Цей діагностичний метод допомагає визначити наявність вірусу у крові. Це дає лікарям можливість говорити про його наявність чи відсутність. Аналіз ПЛР на гепатит З буває двох видів: якісний та кількісний. Перший варіант вказує тільки на його наявність і може мати формулювання «виявлено»/«не виявлено». Цей вид тесту має чутливо до 10-500 МО/мл. Це говорить про те, що за низького вмісту збудника в організмі аналіз буде «не виявлено».

Кількісний аналіз точніший і покаже концентрацію інфекції у крові. Позначається цей показник як «вірусне навантаження», що вимірюється в кількості вірусної РНК на конкретний об'єм крові. Розшифрування у різних лабораторіях може відрізнятися. Крім виміру в МЕ/мл використовуються одиниці виміру копії. Перерахувати копії на МО можна за такою формулою: 1 МО = 4 копії. Якщо в розшифровці значення присутності вірусу перевищує 800 000 МО/мл (або 800*103), це говорить про високий вміст збудника.

На туберкульоз

Робити тест слід у ранковий час. Це важливо для того, щоб не дати всьому масиву мокротиння, що утворився за ніч, вийти зі шлунка. Аналіз ПЛР на туберкульоз так само важливий як ІФА, Манту, томограф. Тест допомагає виділити наявність мікобактерій, стан сечі, загальний імуноглобулін, ШОЕ, визначити стан легень на даний момент. Для точності отримання результатів під час аналізу ПЛР необхідно проводити його з дотриманням наступних правил:

  1. Здійснюється посів 3 рази, але повну аспірацію вмісту шлунка слід проводити лише за умов стаціонару.
  2. Виявляє мікобактерії посів наявних мас у шлунку менш ніж у 50% діагнозів. Навіть при отриманні оптимальних умов рекомендується замість них УЗД.
  3. Навіть при негативному характері результату не може бути повністю виключена можливість розвитку туберкульозу зі зміною ШОЕ, імуноглобуліну або інших показників.
  4. Посів матеріалів при ПЛР менш сприйнятливий на патологічні стани, якщо отриманий він у рамках бронхоскопічного обстеження, що виключає підозри на ТБ у дитини.

На ВІЛ

Для багатьох людей цей діагноз вважається смертельним вироком. З цієї причини після частих статевих зв'язків людина стає більш уважною до сигналів, які подає його тіло (іноді вигадує їх). Найнадійніший варіант отримати підтвердження чи спростування цього захворювання – ПЛР аналіз на ВІЛ. Тест можна використовувати для визначення наступних можливих проблем зі здоров'ям:

  1. Спростування/підтвердження наявності ВІЛ у період серонегативного кону.
  2. Визначення генотипу ВІЛ-1, ВІЛ-2.
  3. Уточнення опису патологічного процесу за сумнівного результату імуноблоту.
  4. Зараження після переливання крові.
  5. Визначення ВІЛ-статусу у дітей, які народилися від матерів-носіїв захворювання.
  6. Допомагає встановити спостереження за вірусною завантаженістю організму.

На ВПЛ

Вірус папіломи може бути виявлений у будь-якої людини, тривалий час може перебувати в латентному стані. Розвиток провокує ослаблення імунітету, стресів або емоційних сплесків. Аналіз ПЛР на ВПЛ допомагає визначити концентрацію вірусу у крові. З цієї причини рекомендується проводити кількісне визначення, а не якісне. Ці дані допоможуть спрогнозувати можливість розвитку злоякісного характеру інфекції.

Методика діагностики наявності ВПЛ ґрунтується на основній властивості ПЛР виділяти з матеріалу ДНК вірусу. Через високу чутливість тесту навіть невелику кількість бактерій буде виявлено. Кількісне дослідження відкриває лікарям можливість встановити рівень небезпеки захворювання, скласти прогноз майбутнє. Ця діагностика є обов'язковою для всіх чоловіків і жінок, які виявили у себе кондиломи. Кількісний аналіз ПЛР допоможе визначити, що спричинило розвиток ВПЛ: тимчасове зниження імунітету або хронічне захворювання.

На герпес

Цей вид діагностики в мікробіології допомагає з високою точністю проводити аналіз ПЛР на герпес. Копіювання фрагментів ДНК вірусу відбуватиметься лише, якщо в матеріалі є потрібний ген. У разі тест за результатами проведення може зазначити наявність чи відсутність збудника. Виявити його вдасться навіть за низької концентрації у крові.

Ще один плюс аналізу ПЛР у тому, що він може визначити герпетичну вірусну інфекцію відразу після зараження, до появи клінічної симптоматики. Можна визначити тип герпесу (1 або 2), для здачі аналізу специфічної підготовки не потрібно, але лікарі рекомендують перед забором крові відмовитися від:

  • смаженого;
  • гострого;
  • алкоголю;
  • жирного.

При вагітності

При виношуванні дитини дуже важливо провести це дослідження, щоб поставити на облік стан жінки. ПЛР аналіз при вагітності входить до переліку найефективніших методів визначення різноманітних захворювань. Провести тест потрібно як виявлення патологій, а й визначення ймовірності зараження дитини внутриутробно. Тільки завдяки ПЛР-діагностики стало можливим виявити ступінь прогресування, розвиток безлічі інфекцій усередині утроби матері.

Складання аналізів ПЛР

Якщо вам цікаво, як беруть аналіз ПЛР, слід розглядати кожен окремий випадок, враховуючи тип біоматеріалу. Зішкріб, мазок або забір крові має свої особливості, наприклад:

  • плазма здається вранці;
  • сеча береться тільки перша вранці, в лабораторних умовах стерильний контейнер;
  • мазок або зіскрібок буде показовим тільки після утримання від статевих контактів не менше 3 діб;
  • не можна здавати мазок під час менструації та через 2 доби після неї.

Де здати аналізи на ПЛР

Даний вид дослідження відноситься до сучасних та високотехнологічних способів діагностики. Здавати аналізи методом ПЛР слід у лабораторіях, які мають весь необхідний комплекс для отримання повноцінних результатів. Не меншу роль відіграють кваліфіковані, підготовлені кадри. Віддайте перевагу великим, серйозним, відомим лабораторіям. Це допоможе не тільки отримати результати швидко, а й забезпечить їхню достовірність.

Ціна

Ще одне питання, яке часто цікавить пацієнтів: скільки коштує аналіз ПЛР? Через новизну методу, необхідність придбання дорогого обладнання ціна на тест відносно висока. На вартість ПЛР впливає вид інфекції, на яку перевірятимуть людину. Орієнтовна ціна та терміни виконання тестів наступна:

  1. ІПСШ перевірять за 1 день, ціна - 400-500 рублів.
  2. Герпес, ВПЛ, вірус Епштейна-Барра, цитомегловірус виявляють за добу, ціна – 300-500 грн.
  3. Аналіз на гепатит проводиться за 5 днів, ціна на якісний варіант – 500 грн., кількісний – 2000 грн.
  4. Хелікобактер пилори виявляють за добу, ціна – 400 грн.
  5. Антигени, антитіла ВІЛ, ціна – від 380 грн.
  6. Якісний аналіз РНК ВІЛ, ціна – від 3500 грн.
  7. Кількісний аналіз РНК ВІЛ, ціна – від 11 000 грн.

Відео

Увага!Інформація, подана у статті, має ознайомлювальний характер. Матеріали статті не закликають до самостійного лікування. Тільки кваліфікований лікар може поставити діагноз і дати рекомендації щодо лікування, виходячи з індивідуальних особливостей конкретного пацієнта.

Знайшли у тексті помилку? Виділіть її, натисніть Ctrl+Enter і ми все виправимо!

Федеральне агентство з освіти

Державний освітній заклад

Вищої професійної освіти

"Карельська державна педагогічна академія"


Курсова робота на тему:

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та її застосування


Виконала: студентка Корягіна Валерія Олександрівна

Перевірила: Карпікова Наталія Михайлівна


Петрозаводськ 2013


Вступ

Розділ 1. Літературний огляд

1.5.4 Ефект "Плато"

1.5.6 Ампліфікація

Висновок


Вступ


Останнє двадцятиріччя ознаменувалося широким впровадженням у біологічні, медичні та сільськогосподарські науки молекулярно-генетичних методів.

На початку 1970-х років здавалося, що молекулярна біологія досягла певної міри завершеності. У цей час головним об'єктом молекулярно-генетичних досліджень були мікроорганізми. Перехід до еукаріотів поставив перед дослідниками абсолютно нові проблеми, які не могли бути вирішені з використанням методів генетичного аналізу, що існували на той час. Прорив у розвитку молекулярної генетики став можливим завдяки появі нового експериментального інструменту – рестрикаційних ендонуклеаз. У наступні роки кількість методів безпосереднього аналізу ДНК, заснованих на підходах, що якісно різняться, почало стрімко збільшуватися.

Сучасні технології в багатьох випадках дозволили більш глибоко розпочати вивчення тонкої структурно-функціональної організації ядерних і позаядерних геномів різних організмів. Особливого значення це мало розробки нових методів діагностики та лікування різних захворювань. Не менш важливим виявилася можливість використання досягнення молекулярної генетики у популяційній біології та в селекції для виявлення та аналізу генетичної мінливості популяцій, сортів та штамів, ідентифікації та паспортизації господарсько цінних особин, створення генетично модифікованих організмів та для вирішення інших питань.

Кожен метод має свої переваги та недоліки. Немає універсального методу, який міг би дозволити вирішити всі проблеми, що виникають. Тому вибір конкретного методу для дослідження є одним з найважливіших етапів будь-якої наукової роботи.

Розділ 1. Літературний огляд


1.1 Історія відкриття полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)


У 1983 р. К.Б. Мюлліс та ін. опублікували і запатентували спосіб полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), якому судилося надати глибокий вплив на всі області дослідження та прикладного використання нуклеїнових кислот. Значення цього методу для молекулярної біології та генетики виявилося настільки велике і очевидне, що вже через сім років автору було присуджено Нобелівську премію з хімії.

На початку використання методу після кожного циклу нагрівання-охолодження доводилося додавати в реакційну суміш ДНК-полімеразу, оскільки вона інактивувалася при високій температурі, необхідної для поділу ланцюгів спіралі ДНК. Процедура проведення реакції була порівняно неефективною, вимагала багато часу та ферменту. У 1986 році метод полімеразної ланцюгової реакції був суттєво покращений. Було запропоновано використовувати ДНК-полімерази із термофільних бактерій. Ці ферменти виявилися термостабільними і здатні витримувати безліч циклів реакції. Їх використання дозволило спростити та автоматизувати проведення ПЛР. Одна з перших термостабільних ДНК-полімераз була виділена з бактерій. Thermus aquaticusі названа Taq-полімеразою.

Можливість ампліфікації будь-якого сегмента ДНК, послідовність нуклеотидів якого відома, та отримання його після завершення ПЛР в гомогенному вигляді та препаративній кількості роблять ПЛР альтернативним методом молекулярного клонування коротких фрагментів ДНК. При цьому не виникає необхідності застосування складних методичних прийомів, які використовують в генній інженерії при звичайному клонуванні. Розробка методу ПЛР багато в чому розширила методичні можливості молекулярної генетики, зокрема генної інженерії, причому настільки, що це кардинально змінило і посилило науковий потенціал багатьох її напрямів.


1.2 Різновиди полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)


· Вкладена ПЛР- застосовується зменшення кількості побічних продуктів реакції. Використовують дві пари праймерів та проводять дві послідовні реакції. Друга пара праймерів ампліфікує ділянку ДНК усередині продукту першої реакції.

· Інвертована ПЛР- використовується в тому випадку, якщо відома лише невелика ділянка всередині потрібної послідовності. Цей метод особливо корисний, коли потрібно визначити сусідні послідовності після вставки ДНК геном. Для здійснення інвертованої ПЛР проводять ряд розрізань ДНК – рестриктазами.<#"justify">полімеразна ланцюгова реакція праймер

· Груп-специфічна ПЛР- ПЛР для споріднених<#"center">1.3 Полімеразна ланцюгова реакція


Відкрита в середині 80-х років полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) здатна збільшити кількість копій вихідної проби в мільйони разів протягом декількох годин. У ході кожного циклу реакції вихідної молекули утворюються дві копії. Кожна із синтезованих копій ДНК може бути матрицею для синтезу нових копій ДНК у наступному циклі. Таким чином, багаторазове повторення циклів призводить до зростання кількості копій у геометричній прогресії. З розрахунків випливає, що навіть за наявності 30 циклів кількість копій вихідної молекули складе більше 1 мільярда. Навіть якщо врахувати, що в ході кожного циклу дуплікуються не всі амплікони, загальна кількість копій, незважаючи на це, становить досить велику цифру.

Кожен цикл полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) складається з наступних етапів:

· Денатурація – підвищення температури викликає розкручування та розщеплення дволанцюжкової молекули ДНК на дві одноланцюгові;

· Відпал - Зниження температури дозволяє праймерам приєднатися до комплементарних ділянок молекули ДНК;

· Елонгація – Фермент ДНК-полімеразу добудовує комплементарний ланцюг.

Для ампліфікації обраного фрагмента використовують два олігонуклеотидні праймери (затравки), фланкирующих певну ділянку ДНК. Праймери орієнтовані 3 -Кінцями назустріч один одному і у бік тієї послідовності, яку необхідно ампліфікувати. ДНК-полімераза здійснює синтез (добудову) взаємно комплементарних ланцюгів ДНК, починаючи з праймерів. При синтезі ДНК праймери фізично вбудовуються в ланцюг новосинтезуючих молекул ДНК. Кожен ланцюг молекули ДНК, що утворюється за допомогою одного з праймерів, може служити матрицею синтезу комплементарної ланцюга ДНК за допомогою іншого праймера.


1.4 Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)


Полімеразну ланцюгову реакцію проводять у спеціальних тонкостінних поліпропіленових пробірках, сумісних за розміром із використовуваним термоциклером (ампліфікатором) - приладом, який контролює температурні та часові характеристики етапів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).


1.5 Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції


Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод ампліфікації ДНК in vitro, за допомогою якого протягом кількох годин можна виділити та розмножити певну послідовність ДНК у мільярди разів. Можливість отримання величезної кількості копій однієї строго певної ділянки геному значно спрощує дослідження наявного зразка ДНК.

Для проведення полімеразної ланцюгової реакції необхідне дотримання низки умов:


1.5.1 Наявність у реакційній суміші ряду компонентів

Основними компонентами реакційної (ПЛР) суміші є: Трис-HCl, KCl, MgCl 2, суміш нуклеотидтрифосфатів (АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ), праймери (олігонуклеотиди), препарат аналізованої ДНК, термостабільна ДНК-полімераза. Кожен із компонентів реакційної суміші безпосередньо бере участь у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР), а концентрація реагентів безпосередньо впливає на перебіг ампліфікації.

· Трис-HCl – визначає pH реакційної суміші, створює буферну ємність. Активність ДНК-полімерази залежить від pH середовища, тому значення водневого показника безпосередньо впливає на перебіг полімеразної ланцюгової реакції. Зазвичай, значення pH знаходиться в межах 8 - 9,5. Високе значення pH береться через те, що при підвищенні температури pH Трил-HCl буфера падає.

· KCl – концентрація хлориду калію до 50 мМ впливає на перебіг процесів денатурації та відпалу, концентрація понад 50 мМ інгібує ДНК-полімеразу.

· MgCl 2- оскільки ДНК-полімераза є Mg 2+- залежним ферментом, то концентрація іонів магнію впливає активність ферменту (Mg 2+утворює комплекси з НТФ – саме ці комплекси є субстратом для полімерази). Висока концентрація призводить до збільшення неспецифічної ампліфікації, а низька веде до інгібування реакції, оптимум (для різних полімераз) знаходиться в області 0,5 - 5мМ. Крім того, концентрація солей магнію впливає на перебіг процесів денатурації та відпалу - підвищення концентрації Mg 2+викликає підвищення температури плавлення ДНК (тобто температури, при корій 50% дволанцюжкових ниток ДНК роз'єднуються на одноланцюгові).

· НТФ – нуклеотидтрифосфати є безпосередніми мономерами нуклеїнових кислот. Для запобігання ланцюговій термінації рекомендується рівнокількове співвідношення всіх чотирьох нуклеотидтрифосфатів. Низька концентрація цих компонентів у реакційній суміші збільшує ймовірність помилки при побудові комплементарного ланцюга ДНК.

· Праймери – найбільш оптимальним є використання праймерів з різницею температур плавлення не більше 2 – 4 o С. Іноді при тривалому зберіганні при температурі 4 o З або після великої кількості заморожувань - відтавань праймери утворюють вторинні структури - димери, знижуючи ефективність протікання ПЛР. Усунення цієї проблеми зводиться до інкубації на водяній бані (Т=95 o С) протягом 3 хвилин і наступного різкого охолодження до 0o З.

· Препарати ДНК - кількість та якість препарату ДНК (матриці) безпосередньо впливає на перебіг та параметри полімеразної ланцюгової реакції. Надмірна кількість зразка ДНК пригнічує полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Домішки різних речовин, що містяться в препараті ДНК, можуть також зменшити ефективність протікання полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР): ацетат натрію, хлорид натрію, ізопропанол, етанол, гепарин, фенол, сечовина, гемоглобін та ін.

· ДНК-полімераза - при використанні малої кількості ДНК-полімерази спостерігається зменшення синтезу кінцевого продукту прямо пропорційно до розміру фрагментів. Надлишок полімерази в 2-4 рази призводить до появи дифузних спектрів, а в 4-16 разів - низькомолекулярних неспецифічних спектрів. Діапазон використовуваних концентрацій – 0,5 – 1,5 одиниць активності у перерахунку на 25 мкл ПЛР суміші.

Крім основних компонентів ПЛР суміші, використовують ряд додаткових речовин, що покращують якісні та кількісні показники ПЛР: ацетамід (5%) – збільшення розчинності основних компонентів; бетаїн (натрієва сіль) - стабілізація ДНК-полімерази, зниження температури плавлення ДНК, вирівнювання температури плавлення; альбумін бичачий (10-100 мкг/мл) - стабілізація ДНК-полімерази; диметилсульфоксид (1-10%) – підвищення розчинності основних компонентів; формамід (2-10%) – збільшення специфічності відпалу; гліцерин (15-20%) - підвищення термостабільності ферменту, зниження температури денатурації зразка ДНК; сульфат амонію - зниження температури денатурації та відпалу.


1.5.2 Циклічний та температурний режим

Загальний вид програми полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) наступний:

етап. Тривала первинна денатурація препарату ДНК.1 цикл

етап. Швидка денатурація препарату ДНК. Відпал праймерів. Елонгація.30 – 45 циклів.

етап. Тривала елонгація. Охолодження реакційної смеси.1 цикл.

Кожен елемент етапу – денатурація, відпал, елонгація – має індивідуальні температурні та часові характеристики. Параметри температури та часу протікання кожного елемента підбирають емпірично, відповідно до якісних та кількісних показників продуктів ампліфікації.

Денатурація. В ході даного елемента полімеразної ланцюгової реакції відбувається розщеплення дволанцюгової молекули ДНК на дві одноланцюгові. Температурні параметри денатурації знаходяться в області 90-95 o С, але у випадку ДНК-зразка з великим вмістом гуаніну та цитозину, температура має бути збільшена до 98 o Температура денатурації повинна бути достатньою для повної денатурації - розщеплення ниток ДНК і уникнення "раптового охолодження" або швидкого відпалу, проте термостабільна ДНК-полімераза менш стійка при високих температурах. Таким чином, вибір оптимальних температурних параметрів денатурації для співвідношення праймер/зразок (препарат ДНК) є важливою умовою при проведенні ампліфікації. Якщо температура денатурації на першому етапі вище 95 o З, рекомендується додавати ДНК-полімеразу в реакційну суміш після первинної денатурації. Тривалість даного елемента етапу в ході полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) повинна бути достатньою для повної денатурації ДНК, але в той же час не впливати на активність ДНК-полімерази при даній температурі.

Відпал. Температура відпалу (Т а ) - один із найважливіших параметрів полімеразної ланцюгової реакції. Температура відпалу кожного конкретного праймера підбирається індивідуально. Вона залежить від довжини та нуклеотидного складу праймера. Зазвичай вона нижча на 2 - 4 o значення температури плавлення (Т m ) Праймер. Якщо температура відпалу системи нижча за оптимальну, то кількість неспецифічних ампліфікованих фрагментів зростає і, навпаки, більш висока температура зменшує кількість ампліфікованих продуктів. При цьому концентрація специфічних ампліконів може різко знижуватися, аж до пригнічення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Збільшення часу відпалу призводить до збільшення кількості неспецифічних ампліконів.

Елонгація. Зазвичай, кожен вид термостабільної ДНК-полімерази має індивідуальний температурний оптимум активності. Швидкість синтезу ферментом комплементарної нитки ДНК також є величиною специфічною для кожної полімерази (в середньому вона становить 30 - 60 нуклеотидів в секунду, або 1 - 2 тис. основ за хвилину), тому час елонгації підбирається залежно від типу ДНК-полімерази і довжини ампліфікується. регіону.


1.5.3 Основні засади підбору праймерів

При створенні ПЛР-тест-системи одним із основних завдань є правильний підбір праймерів, які повинні відповідати низці критеріїв:

Праймери мають бути специфічні. Особливу увагу приділяють 3 -Кінцям праймерів, т. До саме з них починає добудовувати комплементарну ланцюг ДНК Taq-полімераза. Якщо їхня специфічність недостатня, то, ймовірно, що в пробірці з реакційною сумішшю відбуватимуться небажані процеси, а саме синтез неспецифічної ДНК (коротких або довгих фрагментів). Вона видно на електрофорез у вигляді важких або легких додаткових смуг. Це заважає оцінці результатів реакції, тому що легко переплутати специфічний продукт ампліфікації із синтезованою сторонньою ДНК. Частина праймерів та дНТФ витрачається на синтез неспецифічної ДНК, що призводить до значної втрати чутливості.

Праймери нічого не винні утворювати димери і петлі, тобто. не повинно утворюватися стійких подвійних ланцюгів внаслідок відпалу праймерів самих на себе чи один з одним.


1.5.4 Ефект "Плато"

Слід зазначити, що процес накопичення специфічних продуктів ампліфікації геометричної прогресії йде лише обмежений час, а потім його ефективність критично падає. Це з так званим ефектом " плато " .

Термін ефект плато використовують для опису процесу накопичення продуктів ПЛР на останніх циклах ампліфікації.

Залежно від умов та кількості циклів реакції ампліфікації, на момент досягнення ефекту плато впливають утилізація субстратів (дНТФ і праймерів), стабільність реактантів (дНТФ і ферменту), кількість інгібіторів, включаючи пірофосфати та ДНК-дуплекси, конкуренція за реактанти неспецифічними продуктами або праймер-димерами, концентрація специфічного продукту і неповний.

Чим менша початкова концентрація ДНК-мішені, тим вищий ризик виходу реакції на плато". Цей момент може настати до того, як кількість специфічних продуктів ампліфікації буде достатньо, щоб їх можна було проаналізувати. Уникнути цього дозволяють лише добре оптимізовані тест-системи.


1.5.5 Підготовка проби біологічного матеріалу

Для виділення ДНК використовують різні методики в залежності від поставлених завдань. Їх суть полягає в екстракції (вилучення) ДНК з біопрепарату та видаленні або нейтралізації сторонніх домішок для отримання препарату ДНК з чистотою, придатною для постановки ПЛР.

Стандартною і вже класичною вважається методика отримання чистого препарату ДНК, описана Мрамором. Вона включає ферментативний протеоліз з подальшою депротеїнізацією і переосадженням ДНК спиртом. Цей метод дозволяє одержати чистий препарат ДНК. Однак він досить трудомісткий і передбачає роботу з такими агресивними речовинами, що мають різкий запах, як фенол і хлороформ.

Одним з найпопулярніших в даний час є метод виділення ДНК, запропонований Boom із співавторами. Цей метод заснований на використанні для лізису клітин сильного хаотропного агента - гуанідину тіоціонату (GuSCN), та подальшої сорбції ДНК на носії (скляні намисто, діатомова земля, скляне "молоко" і т.д.). Після відмивання в пробі залишається ДНК, сорбована на носії, з якого вона легко знімається за допомогою буфера, що елюює. Метод зручний, технологічний та придатний для підготовки зразка до ампліфікації. Однак можливі втрати ДНК внаслідок незворотної сорбції на носії, а також у процесі численних відмивок. Особливо велике значення це має при роботі з невеликою кількістю ДНК у зразку. Крім того, навіть слідові кількості GuSCN можуть інгібувати ПЛР. Тому при використанні цього методу дуже важливим є правильний вибір сорбенту та ретельне дотримання технологічних нюансів.

Інша група методів пробопідготовки заснована на використанні іонообмінників типу Chilex, які на відміну від скла сорбують не ДНК, а навпаки, домішки, що заважають реакції. Як правило, ця технологія включає дві стадії: кип'ятіння зразка та сорбція домішок на іонообміннику. Метод надзвичайно привабливий простотою виконання. Найчастіше він придатний до роботи з клінічним матеріалом. На жаль, іноді трапляються зразки з такими домішками, які неможливо видалити за допомогою іонообмінників. Крім того, деякі мікроорганізми не піддаються руйнуванню простим кип'ятінням. У таких випадках необхідно запровадження додаткових стадій обробки зразка.

Таким чином, до вибору методу пробопідготовки слід належати до розуміння цілей проведення передбачуваних аналізів.


1.5.6 Ампліфікація

Для проведення реакції ампліфікації необхідно приготувати реакційну суміш і внести до неї аналізований зразок ДНК. При цьому важливо враховувати деякі особливості відпалу праймерів. Справа в тому, що, як правило, в аналізованому біологічному зразку присутні різноманітні молекули ДНК, до яких праймери, що використовуються в реакції, мають часткову, а в деяких випадках значну, гомологію. Крім того, праймери можуть відпалюватись один з одним, утворюючи праймер-димери. І те, й інше призводить до значної витрати праймерів на синтез побічних (неспецифічних) продуктів реакції та, як наслідок, значно зменшує чутливість системи. Це ускладнює або унеможливлює читання результатів реакції при проведенні електрофорезу.


1.6 Склад стандартної реакційної ПЛР суміші


х ПЛР буфер (100 мМ р-р Трис-HCl, pH 9,0, 500 мМ р-р KCl, 25 мМ р-р MgCl2 ) …….2,5 мкл

Вода (MilliQ) ……………………………………………………….18,8 мкл

Суміш нуклеотидтрифосфатів (дНТФ)

мМ р-р кожного……………………………………….……….0,5 мкл

Праймер 1 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл

Праймер 2 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл

ДНК-полімераза (5 од. / Мкл) ………………………………………0,2 мкл

Зразок ДНК (20 нг/мкл) …………………………………………..1 мкл


1.7 Оцінка результатів реакції


Для правильної оцінки результатів ПЛР важливо розуміти, що цей метод не є кількісним. Теоретично продукти ампліфікації одиничних молекул ДНК-мішені можуть бути виявлені за допомогою електрофорезу після 30-35 циклів. Однак на практиці це виконується лише у випадках, коли реакція проходить в умовах, близьких до ідеальних, що в житті трапляється не часто. Особливо великий вплив ефективність ампліфікації надає ступінь чистоти препарату ДНК, тобто. наявність у реакційній суміші тих чи інших інгібіторів, яких позбутися в деяких випадках буває вкрай складно. Іноді через їхню присутність не вдається ампліфікувати навіть десятки тисяч молекул ДНК-мішені. Таким чином, прямий зв'язок між вихідною кількістю ДНК-мішені та кінцевою кількістю продуктів ампліфікації часто відсутній.

Глава 2: Застосування полімеразної ланцюгової реакції


ПЛР використовується в багатьох областях для проведення аналізів та в наукових експериментах.

Криміналістика

ПЛР використовують для порівняння так званих "генетичних відбитків пальців". Необхідний зразок генетичного матеріалу з місця злочину – кров, слина, сперма, волосся тощо. Його порівнюють із генетичним матеріалом підозрюваного. Досить малої кількості ДНК, теоретично - однієї копії. ДНК розщеплюють на фрагменти, ампліфікують за допомогою ПЛР. Фрагменти поділяють за допомогою електрофорезу ДНК. Отриману картину розташування смуг ДНК називають генетичним відбитком пальців.

Встановлення батьківства

Результати електрофорезу ДНК-фрагментів, що ампліфіковані за допомогою ПЛР. Батько. Дитина. Мати. Дитина успадкувала деякі особливості генетичного відбитка обох батьків, що дало новий, унікальний відбиток.

Хоча "генетичні відбитки пальців" унікальні, родинні зв'язки все ж таки можна встановити, зробивши кілька таких відбитків. Той самий метод можна застосувати, трохи модифікувавши його, для встановлення еволюційної спорідненості серед організмів.

Медична діагностика

ПЛР дає можливість суттєво прискорити та полегшити діагностику спадкових та вірусних захворювань. Потрібний ген ампліфікують за допомогою ПЛР із використанням відповідних праймерів, а потім секвенують для визначення мутацій. Вірусні інфекції можна виявляти відразу після зараження, за тижні чи місяці до того, як виявляться симптоми захворювання.

Персоналізована медицина

Іноді ліки виявляються токсичними чи алергенними для деяких пацієнтів. Причини цього - частково в індивідуальних відмінностях у сприйнятливості та метаболізмі ліків та їх похідних. Ці відмінності детермінуються генетичному рівні. Наприклад, в одного пацієнта певний цитохром може бути активнішим, у іншого - меншим. Для того, щоб визначити, який різновид цитохрому має даний пацієнт, запропоновано проводити ПЛР-аналіз перед застосуванням ліків. Такий аналіз називають попереднім генотипуванням.

Клонування генів

Клонування генів - це процес виділення генів і в результаті генноінженерних маніпуляцій отримання великої кількості продукту даного гена. ПЛР використовується для того, щоб ампліфікувати ген, який потім вставляється у вектор - фрагмент ДНК, що переносить чужорідний ген у той самий чи інший, зручний для вирощування організм. Як вектори використовують, наприклад, плазміди або вірусну ДНК. Вставку генів у чужорідний організм зазвичай використовують із отримання продукту цього гена - РНК чи, найчастіше, білка. Таким чином у промислових кількостях отримують багато білків для використання в сільському господарстві, медицині та ін.

Секвенування ДНК

У методі секвенування з використанням мічених флуоресцентною міткою або радіоактивним ізотопом дидезоксинуклеотидів ПЛР є невід'ємною частиною, оскільки саме в ході полімеризації в ланцюг ДНК вбудовуються похідні нуклеотидів, мічені флуоресцентною або радіоактивною міткою. Це зупиняє реакцію, дозволяючи визначити положення специфічних нуклеотидів після поділу синтезованих ланцюжків у гелі.

Мутагенез

Нині ПЛР стала основним методом проведення мутагенезу. Використання ПЛР дозволило спростити та прискорити процедуру проведення мутагенезу, а також зробити її більш надійною та відтворюваною.

Метод ПЛР дозволив проаналізувати наявність послідовностей вірусів папіломи людини у зрізах біопсій новоутворень шийки матки людини, залитих парафіном за 40 років до цього дослідження. Більш того, за допомогою ПЛР вдалося ампліфікувати і клонувати фрагменти мітохондріальної ДНК з викопних останків мозку людини віком 7 тисяч років!

На лізатах індивідуальних сперматозоїдів людини продемонстровано можливість одночасно аналізувати два локуси, розташовані на різних негомологічних хромосомах. Такий підхід забезпечує унікальну можливість тонкого генетичного аналізу і вивчення хромосомної рекомбінації, ДНК-поліморфізму та ін. генів головного комплексу гістосумісності людини;

Використовуючи ПЛР, можна виявляти правильність інтеграції чужорідних генетичних структур у заздалегідь визначений район геному клітин, що вивчаються. Сумарна клітинна ДНК відпалюється з двома олігонуклеотидними затравками, одна з яких комплементарна ділянці хазяйської ДНК поблизу точки вбудовування, а інша - послідовності інтегрованого фрагмента антипаралельного ланцюга ДНК. Полімеразна ланцюгова реакція у разі незміненої структури хромосомної ДНК у передбачуваному місці вбудови призводить до утворення фрагментів одноланцюжкової ДНК невизначеного розміру, а у разі запланованого вбудовування - дволанцюжкових фрагментів ДНК відомого розміру, що визначається відстанню між місцями відпалу двох праймерів. Причому ступінь ампліфікації аналізованого району геному в першому випадку перебуватиме в лінійній залежності від кількості циклів, а в другому - в експоненційній. Експоненційне накопичення в процесі ПЛР фрагмента, що ампліфікується, заздалегідь відомого розміру дозволяє візуально спостерігати його після електрофоретичного фракціонування препарату ДНК і робити однозначний висновок про вбудовування чужорідної послідовності в заданий район хромосомної ДНК.

Висновок


Найбільшого поширення метод ПЛР нині отримав як метод діагностики різних інфекційних захворювань. ПЛР дозволяє виявити етіологію інфекції навіть якщо в пробі, взятій на аналіз, міститься лише кілька молекул ДНК збудника. ПЛР широко використовується у ранній діагностиці ВІЛ-інфекцій, вірусних гепатитів тощо. На сьогоднішній день майже немає інфекційного агента, якого не можна було б виявити за допомогою ПЛР.

Список використаної літератури


1.Падутов В.Є., Баранов О.Ю., Воропаєв Є.В. Методи молекулярно – генетичного аналізу. – Мн.: Юніпол, 2007. – 176 с.

2.ПЛР "в реальному часі" / Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофімов Д.Ю. та ін; за ред. д. б. н. Д.В. Ребрикова; передисл. Л.А. Остермана та акад. РАН та РАСХН О.Д. Свердлова; 2-ге вид., Випр. та дод. - М: БІНОМ. Лабораторія знань, 2009. – 223 с.

.Патрушев Л.І. Штучні генетичні системи. - М.: Наука, 2005. - У 2 т

.Б. Глік, Дж. Пастернак Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування 589 стор., 2002 р.

5.Щелкунов С.М. Генетична інженерія. - Новосибірськ: Сиб. унів. видавничо, 2004. – 496 с.

За редакцією А.А. Ворб'єва "Полімеразна ланцюгова реакція та її застосування для діагностики в дерматовенерології"; Медичне інформаційне агентство - 72 стор.

http://ua. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - медичний журнал


Репетиторство

Потрібна допомога з вивчення якоїсь теми?

Наші фахівці проконсультують або нададуть репетиторські послуги з цікавої для вас тематики.
Надішліть заявкуіз зазначенням теми прямо зараз, щоб дізнатися про можливість отримання консультації.