Оптимальним етапом вивчення хромосом є стадія метафази, коли хромосоми досягають максимальної конденсаціїі розташовуються в однієї площини,що дозволяє їх ідентифікувати із високою точністю. Для вивчення каріотипу потрібно виконання кількох умов:
Стимуляція клітинних поділів для отримання максимальної кількості діляться клітин,
- Блокування клітинного поділуу метафазі;
- гіпотонізації клітинта приготування препарату хромосом для подальшого дослідження під мікроскопом
Для вивчення хромосом можна використовувати клітини з активно проліферуючих тканин(клітини кісткового мозку, стінок сім'яників, пухлин) або клітинні культури,які одержують шляхом культивування в контрольованих умовах на спеціальних живильних середовищах клітин, виділених з організму (клітини периферичної крові*, лімфоцити Т, клітини червоного кісткового мозку, фібробласти різного походження, клітини хоріону, пухлинні клітини)
* Техніка отримання хромосомних препаратів з лімфоцитів периферичної крові, що культивуються в ізольованих умовах є найбільш простим методом і складається з наступних етапів:
Забір венозної крові в асептичних умовах;
Додавання гепарину для запобігання згортанню крові;
Перенесення матеріалу у флакони зі спеціальним живильним середовищем;
Стимуляція клітинних поділів додаванням фітогемаглютиніну;
Інкубація культури протягом 72 годин при температурі 37°С.
Блокування клітинного поділу на стадії метафазидосягається введенням у середу колхіцину або колцеміду – речовин - цитостатиків, що руйнують веретено поділу. Отримання препаратів для мікроскопічногоаналізу включає такі етапи:
- гіпотонізацію клітин,яка досягається додаванням гіпотонічного розчину хлориду калію; це призводить до набухання клітини, розриву ядерної оболонки та дисперсії хромосом;
- фіксацію клітиндля зупинки життєдіяльності клітин із збереженням структури хромосом; для цього використовуються спеціальні фіксатори, наприклад, суміш етилового спирту та оцтової кислоти;
- фарбування препаратуза Гімзою або використання інших способів фарбування;
- аналіз під мікроскопомз метою виявлення чисельних порушень (гомогенні або в мозаїці)і структурних аберацій;
- фотографування та вирізування хромосом;
- ідентифікацію хромосом та складання каріограми (ідіограми).
Етапи каріотипування Диференційне забарвлення хромосом
В даний час поряд з рутинними методами вивчення каріотипу використовуються методи диференціального забарвлення, що дозволяють виявити в хроматидах чергування пофарбованих та незабарвлених смуг. Вони називаються бендами і маютьспецифічне іточне розподіл, зумовлений особливостями внутрішньої організації хромосоми
Методи диференціального забарвлення були розроблені на початку 70-х років ХХ століття і стали важливою віхою у розвитку цитогенетики людини. Вони мають широке практичне застосування, тому що:
Чергування смуг не має випадкового характеру, а відображає внутрішню структуру хромосом,наприклад розподіл еухроматинових та гетерохроматинових ділянок, багатих AT або GC послідовностями ДНК, ділянок хроматину з різною концентрацією гістонів та негістонів;
Розподіл бендів ідентичний для всіх клітин одного організму та всіх організмів даного виду, що використовується для точну ідентифікацію виду;
Метод дозволяє точно ідентифікувати гомологічні хромосоми,які є однаковими з генетичної точки зору та мають подібний розподіл бендів;
Метод забезпечує точну ідентифікацію кожної хромосоми,т.к. різні хромосоми мають різний розподіл бендів;
Диференційне забарвлення дозволяє виявити багато структурні порушення хромосом(делеції, інверсії), які важко виявляються методами простого забарвлення.
Залежно від способу попередньої обробки хромосом і техніки фарбування розрізняють кілька методів диференціального забарвлення (G, Q, R, T, C). Використовуючи їх, можна отримати чергування пофарбованих та незабарвлених смуг - бендів, стабільних та специфічних для кожної хромосоми.
Характеристика різних методів диференціального фарбування хромосом
|
Назва методу |
Використовуваний барвник |
Природа бендів |
Практична роль |
|
Пофарбовані - гетерохроматин; незабарвлені - еухроматин |
Виявлення чисельних та структурних аномалій хромосом |
||
|
Куїнакрин (флюоресцентний барвник) |
Пофарбовані - гетерохроматин; незабарвлені - еухроматин | ||
|
Метод R (реверс) |
Пофарбовані – еухроматин; незабарвлені - гетерохроматин |
Виявлення чисельних та структурних аномалій хромосом |
|
|
Giemsa або флюоресцентний барвник |
Пофарбовані центромірний гетерохроматин |
Аналіз поліморфізму хромосом |
|
|
Giemsa або флюоресцентний барвник |
пофарбовані - теломірний гетерохроматин |
Аналіз поліморфізму хромосом |
У одноклітинних організмів, таких як дріжджі, бактерії чи найпростіші, відбір сприятиме тому, щоб кожна окрема клітина росла і ділилася якнайшвидше. Тому швидкість поділу клітин зазвичай лімітується лише швидкістю поглинання поживних речовин із навколишнього середовища та переробки їх у речовину самої клітини. На відміну від цього у багатоклітинної тварини клітини спеціалізовані та утворюють складне співтовариство, так що головне завдання тут – виживання організму, а не виживання чи розмноження окремих його клітин. Для того щоб багатоклітинний організм вижив, деякі його клітини повинні утриматися від поділу, навіть якщо не бракує поживних речовин. Але коли виникає потреба в нових клітинах, наприклад при репарації пошкодження, клітини, що раніше не ділилися, повинні швидко перемикатися на цикл поділу; а у випадках безперервного «зносу» тканини швидкості новоутворення та відмирання клітин завжди мають бути збалансовані. Тому тут мають існувати складні регуляторні механізми вищого рівня, ніж той, що діє у таких простих організмів, як дріжджі. Цей розділ і присвячений такому соціальному контролю на рівні окремої клітини. У гол. 17 і 21 ми познайомимося з тим, як він функціонує в багатоклітинній системі для підтримки та оновлення тканин тіла та які його порушення відбуваються при раку, а в гол. 16 побачимо, як ще складніша система управляє клітинним розподілом у процесах індивідуального розвитку.
13.3.1. Відмінності в частоті поділу клітин обумовлені різною тривалістю паузи після мітозу
Клітини людського тіла, кількість яких досягає 1013, діляться з дуже різними швидкостями. Нейрони чи клітини скелетного м'яза не діляться зовсім; інші, наприклад клітини печінки, зазвичай діляться лише раз на один або два роки, а деякі епітеліальні клітини кишечника,
Мал. 13-22. Розподіл та міграція клітин в епітеліальній вистилці тонкої кишки миші. Всі клітинні поділки відбуваються тільки в нижній частині трубчастих вп'ячування епітелію, званих криптами.Новоутворені клітини перемішуються вгору та утворюють епітелій кишкових ворсинок, де вони здійснюють перетравлення та всмоктування поживних речовин із просвіту кишки. Більшість епітеліальних клітин має короткий період життя і злущується з кінчика ворсинки не пізніше ніж через п'ять днів після виходу з крипти. Однак кільце приблизно нз 20 «безсмертних» клітин, що повільно діляться (їх ядра виділені більш темним кольором) залишаються пов'язаними з основою крипти.
Ці так звані стовбурові клітини дають при розподілі дві дочірні клітини: в середньому одна з них залишається на місці і далі знову функціонує як недиференційована стовбурова клітина, а інша мігрує вгору, де диференціюється і входить до складу епітелію ворсинки. (Зі змінами з S. S. Pptten, R. Schofield, L G. Lajtha, Biochim. Biophys. Acta 560: 281-299, 1979.)
щоб забезпечити постійне оновлення внутрішньої вистилання кишки, діляться частіше ніж двічі на добу (рис. 13-22). Більшість клітин хребетних розташовується десь у цих часових межах: вони можуть ділитися, але зазвичай роблять це не так часто. Майже всі відмінності у частоті поділу клітин обумовлені різницею в довжині проміжку між мітозом та S-фазою; клітини, що повільно діляться, зупиняються після мітозу на тижні і навіть роки. Навпаки, час, за який клітина проходить ряд стадій від початку S-фази до закінчення мітозу, дуже коротко (у ссавців зазвичай від 12 до 24 год) і завжди, яким би не був інтервал між послідовними поділами.
Час перебування клітин у непроліферуючому стані (так званої фазі G0) змінюється залежно як від їх типу, а й обставин. Статеві гормони спонукають клітини у стінці матки швидко ділитися протягом кількох днів у кожному менструальному циклі, щоб заміщати тканину, втрачену при менструації; втрата крові стимулює проліферацію попередників кров'яних клітин;
пошкодження печінки змушує клітини цього органу, що вижили, ділитися раз або два на добу, поки не буде відшкодовано втрату. Так само епітеліальні клітини, що оточують рану, приступають до посиленого поділу для відновлення пошкодженого епітелію (рис. 13-23).
Для регулювання проліферації клітин кожного типу відповідно до потреби існують ретельно налагоджені та високоспецифічні механізми. Однак, хоча важливість такого регулювання
Албертс Би., Брей Д., Льюїс Дж., Рефф М., Робертс К. Вотсон Дж. Д. Молекулярна біологія клітини: У 3-х т. 2-ге вид. перероб. та дод. Т. 2: Пер. з англ. - М.: Світ, 1993. - 539 с.
Мал. 13-23. Проліферація клітин епітелію у відповідь на поранення. Епітелій кришталика пошкоджували за допомогою голки та через певний час додавали 3Н-тимідин для мічення клітин у фазі S (виділені кольором); потім знову фіксували та готували препарати для р.діоавтографії. На схемах зліва ділянки з клітинами у фазі S виділені кольором, а з клітинами у фазі М - відзначені хрестиками; чорна пляма в центрі – місце нанесення рани. Стимуляція клітинного поділу поступово поширюється від рани, залучаючи до поділу клітини, що покоїться у фазі G0, я це призводить до надзвичайно сильної реакції на відносно мале пошкодження. На 40-годинному препараті клітини, далеко віддалені від рани, вступають у фазу S першого циклу поділу, тоді як клітини біля рани вступають у S-фазу другого циклу поділу. Малюнок праворуч відповідає ділянці, укладеній на схемі зліва прямокутник; він зроблений за фотографією 36-годинного препарату, пофарбованого виявлення клітинних ядер. (За С. Harding, J. R. Reddan, N. J. Unakar, M. Bagchi, Int. Rev. Cytol. 31: 215-300, 1971.)
очевидно, її механізми важко аналізувати у складному контексті цілого організму. Тому детальне вивчення регуляції клітинного поділу зазвичай проводять на культурі клітин, де легко змінювати зовнішні умови та тривалий час спостерігати за клітинами.
13.3.2. Коли умови для зростання стають несприятливими, клітини тварин, так само як і дріжджові клітини, зупиняються в критичній точці G1 - у точці рестрикції
При вивченні клітинного циклу in vitro здебільшого використовуються стабільні клітинні лінії (розд. 4.3.4), здатні розмножуватися невизначено довго. Це лінії, спеціально відібрані дляпідтримки у культурі; багато хто з них - так звані нетрансформованіклітинні лінії - широко використовуються як моделі проліферації нормальних соматичних клітин.
Фібробласти (такі, як різні типи мишачих клітин ЗТЗ) зазвичай діляться швидше, якщо розмістити їх у культуральній чашці не надто щільно і використовувати культуральне середовище, багате на поживні речовини і містить сироватку -рідина, що отримується при згортанні крові та очищену від нерозчинних згустків та кров'яних клітин. При нестачі будь-яких важливих поживних речовин, наприклад амінокислот, або при додаванні в середу інгібітора білкового синтезу клітини починають поводитися приблизно так само, як описані вище дріжджові клітини при нестачі харчування: середня тривалість фази Gtзростає, але на решті клітинного циклу все це майже не позначається. Як тільки клітина пройшла через G1, вона вже неминуче і без затримки проходить фази S, G2 та М незалежно від умов середовища. Цю точку переходу в пізній фазі G1 часто називають точкою рестрикції(R), тому що саме тут клітинний цикл може призупинитися, якщо зовнішні умови перешкоджають його продовженню. Точка рестрикції відповідає точці старту у клітинному циклі дріжджів; так само як і у дріжджів, вона може служити частково механізмом, що регулює розміри клітини. Однак у вищих еукаріотів її функція більш складна, ніж у дріжджів, і у фазі G 1 може бути кілька точок рестрикції, що злегка розрізняються, пов'язаних з різними механізмами контролю клітинної проліферації.
Албертс Би., Брей Д., Льюїс Дж., Рефф М., Робертс К. Вотсон Дж. Д. Молекулярна біологія клітини: У 3-х т. 2-ге вид. перероб. та дод. Т. 2: Пер. з англ. - М.: Світ, 1993. - 539 с.
Мал. 13-24. Розкид величин тривалості клітинного циклу, що спостерігається зазвичай вгомогенної популяції клітин in vitro Такі дані одержують, спостерігаючи окремі клітини під мікроскопом і прямо відзначаючи час між послідовними поділами.
13.3.3. Тривалість циклу проліферуючих клітин, мабуть, має імовірнісний характер
Індивідуальні клітини, що поділяються на культурі, можна безперервно спостерігати за допомогою цейтраферної кінозйомки. Такі спостереження показують, що у генетично ідентичних клітин тривалість циклу дуже мінлива (рис. 13-24). Кількісний аналіз показує, що час від одного поділу до наступного містить компоненту, що випадково змінюється, причому змінюється вона головним чином за рахунок фази G1. Очевидно, у міру того як клітини наближаються до точки рестрикції в GJ (рис. 13-25), вони повинні деякий час «вичекати», перш ніж перейти до частини циклу, що залишилася, причому для всіх клітин ймовірність в одиницю часу пройти точку R приблизно однакова. Таким чином, клітини поводяться подібно до атомів при радіоактивному розпаді; якщо в перші три години через точку R пройшла половина клітин, у наступні три години через неї пройде половина клітин, що залишилися, ще через три години - половина тих, що залишаться, і т. д. Можливий механізм, що пояснює таку поведінку, був запропонований раніше, коли йшлося про утворення активатора S-фази (розд. 13.1.5). Однак випадкові зміни тривалості клітинного циклу означають, що спочатку синхронна клітинна популяція через кілька циклів втратить свою синхронність. Це незручно для дослідників, але може бути вигідно для багатоклітинного організму: інакше великі клони клітин могли б проходити мітоз одночасно, а оскільки клітини під час мітозу зазвичай округляються і втрачають міцний зв'язок один з одним, це серйозно порушувало б цілісність тканини, що складається з таких клітин.
З розвитком кількість клітин, у тому числі складається зародок, збільшується. Розподіл клітин (дроблення яйця) на ранніх стадіях розвитку відбуваються рівномірно (синхронно). Але в одних видів раніше, в інших пізніше ця синхронність порушується і клітини, з яких утворюються зачатки різних органів, починають ділитися з різною швидкістю. Ці відмінності у швидкості поділу можна як одне з перших проявів їх диференціювання.
У зародків ссавців вже після стадії 16-32 бластомерів більшість клітин починає ділитися швидше і утворює трофобласт - зачаток майбутньої плаценти. Сам майбутній зародок складається з цих ранніх стадіях лише з кількох клітин. Однак пізніше в ході розвитку та зростання зародок і потім плід стають у багато разів більшими за плаценту.
У амфібій на стадії бластули, що складається з кількох тисяч клітин, майбутня мезодерма становить менше третини всіх клітин. Але в міру розвитку мезодермальні похідні - всі м'язи, майже весь скелет, система кровообігу, нирки та ін - займають не менше 80% всієї маси пуголовка.
Особливо наочний неоднаковий темп розподілу клітин у морфогенезі багатьох безхребетних. У видів з мозаїчним розвитком вже на стадії 30-60 клітин зачатки всіх основних органів визначені і представлені небагатьма клітинами (іноді всього двома). Далі поділу клітин у кожному зачатку суворо програмуються. Так, наприклад, ранній зародок асцидій містить 52 клітини ектодерми, 10 клітин ентодерми та всього 8 клітин мезодерми. Протягом подальшого розвитку число клітин ектодерми зростає у 16 разів, ентодерми – у 20, а мезодерми – у 50. Завдяки програмованості поділів кількість клітин у деяких дорослих безхребетних (наприклад, у нематод) строго постійно і кожен орган представлений певною кількістю клітин. Не завжди місце розташування органу і місце, де діляться складові його клітини, збігаються. Часто мітози відбуваються тільки в особливій зоні розмноження і звідти клітини мігрують до свого диференціювання. Приклади такого роду ми вже бачили при розгляді системи стовбурових клітин. Те саме відбувається, наприклад, і за розвитку головного мозку.
Програма клітинних поділів не завжди дуже строга і визначає точне число. Найчастіше, ймовірно, розподіли відбуваються до тих пір, поки кількість клітин або розмір органу не досягне певної величини. Йдеться, таким чином, про два принципово різні механізми регуляції клітинних поділів.
В одному випадку (як у яйцях з мозаїчним розвитком) він, мабуть, укладений у клітині, що сама ділиться, яка повинна «вміти відраховувати» свої поділки. В іншому випадку повинна існувати деяка «петля зворотного зв'язку», коли маса органу або кількість клітин, досягаючи деякої величини, починає гальмувати подальші поділу.
Виявилося, що кількість поділів у нормальних клітинах, не трансформованих у злоякісні, взагалі не безмежна і зазвичай не перевищує 50-60 (більшість клітин ділиться менше, оскільки якби яйце рівномірно розділилося 60 разів, то число клітин в організмі (260) виявилося б у тисячі разів вище, ніж насправді). Однак ні механізм такої межі числа клітинних поділів (називається на ім'я вченого, що його відкрив, межа Хайфліка), ні його біологічний сенс поки незрозумілий.
Що ж є «датчиком» у системі регуляції – розмір органу чи кількість клітин? Однозначну відповідь на це питання дають досліди з отриманням тварин із зміненою плоїдністю – гаплоїдні, триплоїдні чи тетрапоїдні. Їхні клітини відповідно в 2 рази менші або в 1,5 або 2 рази більші за нормальні диплоїдні. Тим не менш і розмір самих тварин, і розмір їх органів, як правило, нормальні, тобто вони містять більше або менше клітин, ніж норма. Регульованою величиною, отже, не кількість клітин, а маса органу чи всього організму.
Інакше справа у рослин. Клітини тетраплоїдних рослин, як і у тварин, відповідно більше диплоїдних. Але й розміри частин тетраплоідних рослин – листя, квіток, насіння – часто виявляються більшими за звичайні майже в 2 рази. Схоже, що з рослин «датчиком» щодо кількості клітинних поділів не розмір органу, а саме число клітин.
Механізми, що регулюють клітинні поділу - проліферацію клітин, вивчаються дуже інтенсивно і з різних боків. Одним із стимулів такої активності вчених є те, що відмінності ракових клітин від нормальних багато в чому полягають у порушенні регуляції клітинних поділів, у виході клітин з-під такої регуляції.
Прикладом однієї з механізмів регуляції клітинних поділів може бути поведінка клітин, посіяних на дно флакона з живильним середовищем, – клітинної культури. Їхні поділки в хороших умовах відбуваються до тих пір, поки вони не покриють все дно і клітини не торкнуться одна одної. Далі настає так зване контактне гальмування, або гальмування, залежне від густини клітин. Його можна порушити, як це робив Ю. М. Васильєв, розчистивши від клітин невелике віконце лежить на поверхні скла. У це віконце з усіх боків спрямовуються клітини, навколо нього проходить хвиля клітинних поділів. Можна думати, що і в організмі контакти із сусідніми клітинами є механізмом, що стримує клітинні поділки.
У пухлинних клітин ця регуляція порушується - вони не підкоряються контактному гальмування, а продовжують ділитися, нагромаджуючись один на одного. Аналогічно, на жаль, вони поводяться і в організмі.
Але контактне гальмування не є єдиним механізмом регуляції: її бар'єр може бути подоланий і у цілком нормальних клітин. Так, наприклад, щільно притиснуті один до одного клітини печінки у молодої тварини проте діляться і печінка росте разом із зростанням всієї тварини. У дорослих тварин ці поділи практично припиняються. Однак якщо дві частки печінки видалити, то в частці, що залишилася, дуже швидко почнуться масові поділу клітин - регенерація печінки. Якщо видалити одну нирку, то протягом кількох днів друга нирка за рахунок клітинних поділів збільшиться вдвічі. Очевидно, що в організмі існують механізми, здатні стимулювати клітинні поділи в органі, активувати його зростання і наводити розміри органу тим самим у кількісну відповідність з розмірами всього організму.
У цьому випадку діють не контактні механізми, а якісь хімічні фактори, які можуть бути пов'язані з функцією печінки або нирок. Можна уявити, що недостатність функції цих органів, при віддаленні їх частини або при відставанні їх зростання від зростання всього організму, так порушує весь метаболізм в організмі, що це викликає компенсаторну стимуляцію клітинних поділів саме в цих органах. Є й інші гіпотези, які пояснюють, наприклад, подібні явища дією спеціальних інгібіторів клітинних поділів – кейлонів, що виділяються самим органом; якщо орган менший, то менше і кейлонів і більше клітинних поділів у цьому органі. Якщо такий механізм і існує, то він діє не скрізь. Наприклад, втрата однієї ноги не призводить сама по собі до збільшення розмірів іншої ноги.
Розподіли стовбурових і диференційованих клітин крові стимулюються гормонами, такими, як, наприклад, еритропоетин. Гормони стимулюють клітинні поділу та у багатьох інших випадках. Наприклад, стимуляція зростання кількості клітин яйцеводи у курей активується жіночим статевим гормоном. Існують хімічні чинники – зазвичай це невеликі білки, які діють не як гормони, тобто не розносяться з кров'ю по всьому організму, а впливають більш обмежено на сусідні тканини. Це відомі зараз чинники зростання – епідермальний та інших. Проте найчастіше конкретні хімічні чинники регуляції клітинних поділів і механізми їхньої дії нам невідомі.
Ще менше ми знаємо про регулювання клітинних поділів під час основних процесів морфогенезу – в ембріональному розвитку. Ми вже говорили, що тут здатність одних клітин ділитися швидше за інші є проявом їх диференціювання. У той самий час мушу помітити, що диференціювання і клітинні поділу у сенсі протистоять одне одному і іноді навіть виключають одне одного. У деяких випадках це пов'язано з неможливістю розподілу при далеко зайшлий, термінальної диференціювання клітин. Чи може, наприклад, розділитися еритроцит з його спеціалізованою структурою, жорсткою оболонкою і майже повною втратою більшості клітинних функцій, а в ссавців ще й із втратою ядра? Нервові клітини хоч і зберігають дуже високий темп метаболізму, але їх довгий аксон і дендрити, пов'язані з іншими клітинами, є очевидними перешкодами до поділу. Якби такий поділ у нервової клітини все ж таки відбувся, це призвело б до втрати зв'язку цієї клітини з іншими і, отже, до втрати її функції.
Тому звичайною послідовністю подій є спочатку період проліферації клітин, а потім диференціювання, що носить термінальний характер. Більше того, ряд вчених припускають, що саме під час клітинних поділів хромосоми як би «звільняються» для наступного етапу диференціювання, – останньому мітозу перед диференціюванням надається особливе значення. Ці уявлення носять поки що багато в чому умоглядний характер не мають на молекулярному рівні хороших експериментальних підстав.
Але і не знаючи конкретних механізмів регуляції клітинних поділів, ми маємо право розглядати їх програмований характер як такий самий прояв програми розвитку, яким є й інші його процеси.
На закінчення ми коротко зупинимося і явище, хіба що зворотному розмноженню клітин, – їх загибелі, що у певних випадках формоутворення є необхідним етапом розвитку. Так, наприклад, при утворенні пальців у зачатках кисті передніх і задніх кінцівок клітини мезенхіми збираються в щільні тяжі, з яких формуються потім хрящі фаланг. Серед клітин, що залишилися між ними, відбувається масова загибель, за рахунок якої частково пальці відокремлюються один від одного. Щось схоже відбувається і при диференціювання зачатку крила у птахів. Механізми загибелі клітин у випадках – чинники, зовнішні стосовно клітин, і події всередині клітин – залишаються маловідомими. А. С. Уманський передбачає, наприклад, що загибель клітини починається з деградації її ДНК.
Розмноження клітин, незважаючи на всю його важливість, не можна вважати основним механізмом морфогенезу: у створенні форми воно бере все ж таки побічно, хоча такі важливі параметри, як загальна форма органу та його відносні розміри, можуть регулюватися саме на рівні клітинних поділів. Ще меншу роль грає у морфогенезі програмована загибель клітин. Проте вони є в нормальному розвитку абсолютно необхідними компонентами. У регуляції цих явищ беруть участь практично всі компоненти клітини та її генетичний апарат. Це показує нам, що у розвитку немає простих процесів. Спроба остаточно розібратися у кожному їх змушує нас звертатися до основним молекулярним механізмам роботи клітини. А тут ще багато невирішеного.
Для того щоб оцінити всю складність розвитку багатоклітинного організму, треба уявити цей процес, що відбувається як би в багатовимірному просторі. Одну вісь складає довгий ланцюг етапів реалізації генетичної інформації - від гена до ознаки. Другою такою віссю можна назвати всю сукупність генів у хромосомах. У результаті розвитку продукти різних генів взаємодіють друг з одним. Розгортання подій але двом осям утворює мережу на площині. Однак існує п третя вісь - різноманітність подій, що відбуваються в різних частинах зародка. Ці події можуть відбуватися відносно автономно, як у тварин з мозаїчним розвитком. Але частково і в них, а повною мірою у видів з регуляційним типом розвитку між частинами організму здійснюються більші або менші взаємодії та завжди складні переміщення клітин. Розглядати їх усі як одну вісь можна лише йдучи на значні спрощення. І нарешті, весь розвиток (гаметогенез, ембріогенез та постембріональний розвиток) відбувається в часі, масштаб якого зовсім інший, ніж час, що вимірюється на шляху від гена до білка. По цій (умовно четвертій) осі вся багатовимірна картина радикально змінюється - яйце перетворюється на організм, що розмножується. Ця багатовимірність ілюструє складність всіх процесів та їх взаємовідносин та труднощі їхнього розуміння.
У частини вірусів роль спадкової речовини виконує не ДНК, а подібна до неї за будовою РНК.
До кінця ХІХ ст. цитологи мали у своєму розпорядженні майже вичерпні знання про морфологічний бік мітозу. Подальше поповнення даних про клітинному розподілі йшло головним чином за рахунок вивчення найпримітивніших організмів.
Був детально вивчений процес поділу у прокаріотних (яких не мають оформленого ядра) організмів (бактерій), генетично близький до мнтозу (М. А. Пєшков, 1966), а також мітоз у найпростіших (І. Б. Райков, 1967), де були знайдені вкрай своєрідні форми цього процесу. У вищих організмів морфологічне вивчення мітозу йшло переважно з лінії дослідження цього процесу у поступовій динаміці на живих об'єктах з допомогою мікрокінозйомки. У цьому відношенні велике значення мали роботи А. Байєра та Дж. Моле-Байєр (1956, 1961), виконані на клітинах ендосперму деяких рослин.
Проте переважна більшість робіт XX ст. стосувалося фізіології клітинного поділу, і саме в цьому розділі проблеми було досягнуто найбільших успіхів. По суті, невивченим залишалося питання про причини та контролюючі фактори мітозу. Основоположником цього напряму досліджень був А. Г. Гурвіч.
Вже в монографії «Морфологія і біологія клітини» (1904) Гурвіч висловив думку, що повинні існувати фактори, що зумовлюють виникнення мітозу, причому вони швидше за все пов'язані зі станом клітини, що сама приступає до поділу. Ці ще дуже загальні уявлення отримали розвиток у серії подальших досліджень Гурвіча, узагальнених у монографії «Проблема клітинного поділу з фізіологічної погляду» (1926). Першим важливим теоретичним висновком Гурвіча стало уявлення про дуалізм факторів, що викликають мітоз тільки при їх поєднанні. Один із цих факторів (або група факторів) пов'язаний з ендогенними процесами підготовки клітини до поділу (фактор можливості або готовності). Інший є екзогенним по відношенню до цієї клітини (фактор здійснення). Подальші дослідження Гурвіча були присвячені переважно вивченню другого чинника.
Експерименти та теоретичні міркування привели Гурвіча у 1923 р. до відкриття, що більшість екзотермічних реакцій як в організмі, так і в пробірці супроводжується УФ-випромінюванням. Найважливішим біологічним наслідком такого явища виявилася стимуляція клітинних поділів, чому ці промені одержали назву мітогенетичних, тобто викликають мітози. Протягом наступних років Гурвічем (1948, 1959) та його співробітниками було виконано велику кількість досліджень, присвячених проблемі мітогенетичного випромінювання. Стимулюючий вплив випромінювання було з'ясовано найрізноманітніших об'єктах - від бактерій і дріжджових грибків до зародків і клітин культури тканини ссавців (А. А. Гурвич, 1968).
У першій чверті XX ст. стали накопичуватися дані щодо впливу на мітоз зовнішніх впливів – променистої енергії, різних хімічних речовин, температури, концентрації водневих іонів, електричного струму тощо. буд. Особливо багато досліджень було виконано на культурі тканини. В даний час встановлено, що мітотичний поділ є наслідком довгого ланцюга причин.
На противагу цитології початкового періоду, яка приділяла основну увагу самому мітозу, сучасна цитологія набагато більше цікавиться інтерфазою. Користуючись термінологією Гурвіча, можна сказати, що на першому плані стоїть вивчення факторів готово-
сті, що забезпечують можливість вступу клітини у розподіл.
Це стало можливим завдяки новим методам дослідження, насамперед завдяки радіоавтографії.
А. Говард та С. Пелк (1951) запропонували весь мітотичний цикл розбити на чотири періоди: постмітотичний, або пресинтетичний (Gi); синтетичний (S), під час якого відбувається реплікація ДНК; постсинтетичний, чи премітотичний (G2); і, нарешті, мітоз (М). Накопичено великий фактичний матеріал за тривалістю у різних організмів окремих періодів і всього мітотичного циклу загалом у нормі і за впливу різноманітних зовнішніх і внутрішніх чинників - променистої енергії, вірусів, гормонів тощо.
Ряд досліджень (М. Суонн, 1957, 1958) присвячений енергетиці клітинного поділу, і хоча багато деталей залишаються ще нез'ясованими, стало очевидним, що важлива роль належить у цьому відношенні макро-ергічних сполук, зокрема АТФ. Ця речовина не тільки бере участь у підготовці клітини до поділу, але, за даними Г. Гофман-Берлінга (1959, 1960), відповідальна за механічні процеси, що лежать в основі розходження хромосом до полюсів.
У з'ясуванні механізму різних етапів клітинного поділу особливо велику роль зіграли роботи американського дослідника Д. Мезія (1961), який вивчав різні сторони фізіології мітозу, особливо роль мітотичного апарату, що здійснює процес поділу. Створено різні уявлення про механізм поділу клітинного тіла та про фізико-хімічні зміни клітин при розподілі. Вивчення хромосом виросло в самостійну галузь досліджень, яка виявилася органічно пов'язаною з генетикою та дала початок цитогенетиці.
Поряд з вивченням окремих мітозів значна кількість досліджень була присвячена з'ясуванню закономірностей мітотичної активності тканин, зокрема вивченню залежності клітинної проліферації від фізіологічного стану організму та впливу різних ендогенних та екзогенних факторів.
Перші дослідження такого характеру були виконані на рослинних об'єктах на початку XX ст. у зв'язку з вивченням періодичності біологічних процесів (А. Льюїс, 1901; В. Келлікот, 1904). У 20-х роках з'явився ряд фундаментальних досліджень, присвячених добовому ритму клітинних поділів у проростку рослин (Р. Фрізнер, 1920; М. Столфелд, 1921). У 30-40-х роках була проведена серія досліджень (А. Карлетон, 1934; Ч. Блюменфельд, 1938, 1943; 3. Купер, Г. Франклін, 1940; Г. Блюменталь, 1948; та ін), в яких вивчалася Мітотична активність у вогнищах клітинного розмноження різних лабораторних тварин. Значно менше таких робіт виконано на осередках клітинного розмноження людини (3. Купер, А. Шифф, 1938; А. Бродерс, В. Дублін, 1939; та ін).
У СРСР перше дослідження щодо впливу на мітотичний режим фізіологічних факторів було опубліковано у 1947 р. Г. К. Хрущовим. Починаючи з 50-х років інтерес до проблеми мітотичного режиму організму значно зріс (С. Я. Залкінд, І. А. Уткін, 1951; С. Я. Залкінд, 19,54, 1966; В. Н. Доброхотов, 1963; І .А. Алов, 1964; та ін). Найбільш повно було вивчено добовий ритм мітотичної активності у ссавців.
Перші спроби проаналізувати механізми, що регулюють мітотичну активність, були зроблені в 1948 англійським дослідником В. Буллоу. Радянські цитологи (JI. Я. Бляхер, 1954; І. А. Уткін, 1959; Г. С. Стрелін, В. В. Козлов, 1959) приділили велику увагу нейрогуморальної регуляції мітотичної активності, встановивши рефлекторний характер регуляції клітинних ділень. Виявилося, що вплив на нервову систему впливає опосередковано через зсув гормональної рівноваги. З'ясувалося також, що при цьому різко посилюється секреція адреналіну, що гальмує активність мітотику. Видалення надниркових залоз призводить до виключення ефекту гальмування мітозів (А. К. Рябуха, 1955, 1958). Ряд досліджень присвячений вивченню складних взаємин між мітотичною та фізіологічною активністю організму (С. Я. Залкінд, 1952; І. А. Алов, 1964).
Підвищення інтересу до проблеми мітотичних циклів та широке застосування радіоавтографії призвело до того, що в даний час переважна більшість робіт присвячена вивченню закономірностей мітотичного циклу, аналізу закономірностей переходу з одного періоду до іншого, впливу на мітоз різноманітних ендогенних та екзогенних факторів. Це, безсумнівно, один із найбільш перспективних напрямів у вивченні проблеми клітинної проліферації (О. І. Єпіфанова, 1973).
Цитологія спадковості
У першій половині XX ст. у зв'язку з розквітом генетики інтенсивно розроблялися цитологічні проблеми щодо спадковості. Так виникла нова галузь цитології – каріологія.
Піонером каріологічних досліджень був російський ботанік
С. Г. Навашин. Навашин по справедливості може бути названий творцем цитогенетики, не випадково перший період розвитку цієї науки часто називають «російським» або «навашинським». Вже в класичних роботах з ембріології рослин, особливо з цитології запліднення (1898), він зосередив свою увагу на морфології хромосом у деяких клітинах лілейних, зокрема, кінського гіацинту (Galtonia candicans). У 1916 р. Навашин опублікував роботу, де навів ретельний опис хромосомного набору цієї рослини. Йому вдалося знайти на хромосомі (в центрі або на її полюсі) особливу незабарвлену ділянку (названу ним «хроматичною перервою»), що називається зараз центроміром або кінетохором, в області якого хромосома прикріплюється до веретена. Центромірам належить надзвичайно важлива роль у процесі розщеплення хромосом та їх розбіжності до полюсів клітини, що ділиться. Навашин вперше показав, що будова хромосом зовсім не є незмінною, але схильна до змін у філогенезі і за деяких особливих умов існування (наприклад, у клітинах насіння при їх тривалому зберіганні). На низці рослинних об'єктів (Crepis, Vicia, Muscari та ін.) учні Навашина показали, що каріолотичний аналіз може бути використаний для філогенетичних висновків. Дещо пізніше почалися каріологічні дослідження на клітинах тварин і людини. У цих роботах також брав участь Навашин. Вже після його смерті, в 1936 р., було опубліковано працю, присвячену зменшенню (димінуції) хроматину при розвитку яйця кінської аскариди, що підтвердила висновки Т. Бовері (1910).
Грунтовні каріологічні роботи були виконані в 20-30-х роках радянським цитологом П. І. Живаго. Він та його співробітники досліджували каріотип свійських птахів (кури, індички; 1924, 1928), дрібної рогатої худоби (1930) та людини (1932). Живаго не тільки з'ясував низку каріо-типів, а й почав розробку питання про сталість числа хромосом у межах одного організму. На підставі літературних даних (за двокрилими) і дослідження низки об'єктів (ему, нанду, людина) Живаго (1934) дійшов висновку, що у окремих клітинах і цілих тканинах (особливо в ембріонів) спостерігаються значні коливання серед хромосом. Він надавав цим відмінностям велике значення, оскільки вони ведуть зміну геному, отже, і спадкових властивостей організму. Він висловлював також припущення, що наявність клітин з різним числом хромосом може мати пристосувальне значення, оскільки збільшує можливі варіанти каріотипів для подальшого відбору. Ця думка, висловлена понад 30 років тому, розділяється нині багатьма дослідниками.
Велику роль розвитку розглянутого напрями зіграла книга До. Белара «Цитологічні основи спадковості» (1928, російський переклад 1934). Розділу, присвяченому зв'язку хромосом зі спадковістю, передують власне цитологічні розділи, що містять дані про будову ядра та цитоплазми, про клітинний поділ, запліднення та дозрівання статевих клітин, про партеногенез. Дуже детально й у порівняльному аспекті розглядається будова хромосом у вищих хребетних, а й безхребетних, найпростіших і рослин. Містяться цінні дані, що стосуються індивідуальності та мінливості хромосом, обміну фрагментами при кросинговері, димінуції хроматину, патології мітозу. Книга Белара протягом тривалого часу залишалася найкращою монографією з цитології спадковості.
Поступово, у зв'язку з інтенсивним розвитком генетики, цитологія спадковості перетворилася на цитогенетику, історію якої коротко викладено разом із історією генетики (див. глави 13 і 24). У другій половині XX ст. виникло кілька абсолютно нових, перспективних напрямів досліджень.
Насамперед слід назвати цитоекологію, вивчає роль клітинного рівня організації у пристосуванні організму до умов середовища. У цей напрям, тісно пов'язане з біохімією клітини і особливо з вивченням властивостей клітинних білків, набув широкого розвитку на роботах У. Я. Александрова і Б. П. Ушакова.
За останні 10-20 років велику увагу привертає вивчення загальної фізіології клітини і, зокрема, закономірностей синтезу та витрачання речовин, що беруть участь в основних життєвих процесах, так і є її специфічними продуктами (секрети). До цього ж кола питань відноситься вивчення відновлювальних процесів у клітині, тобто фізіологічної регенерації, що забезпечує відновлення зруйнованих або втрачених клітинних структур і речовин, що відбувається на молекулярному рівні.
Велике значення у цитології набули проблеми детермінації, диференціації та дедиференціації клітин. Вони відіграють важливу роль в ембріональних клітинах та різних категоріях клітин, що культивуються поза організмом (А. Де-Рейк, Дж. Найт, 1967; С. Я. Залкінд, Г. Б. Юровська, 1970).
Своєрідний розділ цитології склала цитопатологія - область, прикордонна із загальною патологією і зробила значні успіхи останні десятиліття XX ст. Термін «цитопатологія» використовується для позначення галузі біології, в якій вивчення загальнопатологічних процесів ведеться на клітинному рівні, і як система знань про патологічні зміни окремої клітини. Щодо першого напряму, то після класичних робіт Р. Вірхова спроби звести сутність патологічного процесу до зміни мікроскопічних та субмікроскопічних структур робилися неодноразово. Багато прикладів подібного використання цитологічного аналізу розуміння патологічних процесів у організмі міститься у роботах Р. Камерона (1956, 1959).
Другий напрямок може розглядатися як суто цитологічний. Воно ставить за мету вивчення патології самої клітини та її органоїдів, т. е. морфологічних, біохімічних і фізіологічних відхилень від норми, які спостерігаються при різних патологічних процесах, що відбуваються в клітині, незалежно від їх впливу на стан тканини, органу або всього організму. Розвиток цього напряму пов'язаний насамперед із накопиченням даних про зміну клітин, що відбувається внаслідок їх природного старіння, а також різних різких цитопатологічних змін, що спостерігаються при впливі тих чи інших несприятливих факторів (фізичних, хімічних, біологічних) зовнішнього середовища. Особливо значний розвиток набуло вивчення патологічних змін під впливом несприятливих впливів на клітину в експерименті та дослідження механізму дії таких факторів. Ці дослідження набули широкого розвитку насамперед у радіобіології, де всебічне вивчення реакції клітини на вплив променистої енергії можливе як на клітинному чи субклітинному, а й на молекулярному рівні.
Проти моєї хвороби — псоріазу, але так само по кілька разів на рік з'являються червоні плями. Потім вони проходять після двох-трьох тижнів. Через якийсь час все знову повторюється. Розкажіть докладніше про цю хворобу і про те, як її позбутися", — просить читачка MedPulse. Що відповість лікар-дерматолог?
Лікар-дерматолог, к. м.н., Олексій Левін
З чого починається псоріаз?
Псоріаз - хронічне, незаразне захворювання шкіри, відоме ще в допетровській Русі, де цей дерматоз називали "трояндами диявола". Але не стільки через високу небезпеку для життя (навіть сверблячка тут з'являється не у всіх пацієнтів, а серйозні ускладнення — менш ніж у 10% разі), скільки через надзвичайно підступний і завзятий характер цієї недуги. Шкірні "троянди" можуть раптом зникнути, потім спати роками і раптом розпуститися знову. І досі псоріаз залишається одним із найзагадковіших недуг.
Наприклад, вже давно припустили, що це аутоімунне захворювання. Але нещодавно американські вчені відкрили два гени, відповідальні за поділ епідермальних клітин. Мутації у цих генах, на думку дослідників, і порушують порядок клітинного поділу, що призводить до утворення бляшок. Ось вам ще одна можлива причина – генетична. Але хіба не може бути й інша інфекційно-вірусна? Шведські вчені виділили ретровірус, які вважають специфічним збудником псоріазу. Словом, причина хвороби поки невідома.
У групі найбільшого ризику - недовірливі, тривожні люди з підвищеною емоційністю, які і до початку псоріазу у відповідь на стрес "зривалися" на якісь захворювання. Тому, якщо говорити про профілактику недуги, то порадив би таким людям простіше ставитися до життєвих проблем.
У північних країнах цей дерматоз зустрічається вдвічі частіше, ніж у південних. Таку залежність пов'язують із кількістю сонячного світла. Тому ще одна порада, як уберегтися від псоріазу — не перестаратися у захисті від сонячних променів. Існують гігієнічні правила здорової та безпечної природної засмаги. Слідуйте їм, але й не ховайтеся від сонця як Снігуронька!
Стіна висока, але квола
При псоріазі клітини верхнього епідермального шару шкіри поділяються на 30 швидше ніж у нормі. Але дозрівати не встигають, через що між ними не встановлюються міцні зв'язки. У результаті шкіра при псоріазі нагадує поспіхом побудовану цегляну стіну, високу, та неміцну.
Зовні ця "стінка" виглядає як сріблясто-білі бляшки. Якщо їх потерти, вони легко зіскоблюються, як краплі стеаринової свічки. Це називають симптомом стеаринової плями. При подальшому пошкрібанні виділяються точкові крапельки крові (симптом кров'яної роси). Він обумовлений тим, що епідерміс був зішкріб до поверхневих судин шкіри. У глибших шарах при псоріазі відбувається запалення та розширюються судини шкіри. Цим зумовлений рожевий чи червоний колір бляшок.
Звичайний (бляшковий) псоріаз, якому і присвячена наша стаття, зустрічається в більшості (85%) випадків. Інші форми, разом узяті, становлять близько 15%. Ці різновиди не схожі на звичайний псоріаз, і в їхньому лікуванні є багато особливостей. Але у будь-яких видів цієї недуги найчастіше ускладнення — псоріатичний артрит. Якщо його не лікувати, хворий стає інвалідом. Пам'ятайте про це, і не рідше, ніж раз на рік здайтеся артролога або ортопеда.
Вперше почувши діагноз "псоріаз", багато людей відчувають потрясіння та почуття приреченості. Що ж, їх можна зрозуміти... Адже повністю викорчувати "троянди диявола" медицина ще не вміє. І такі хворі скрізь стають об'єктом стривожених поглядів, оскільки захворювання очевидно для оточуючих через явні зовнішні прояви.
Моїм пацієнтам я даю спеціальні поради щодо адаптації до хвороби:
- Дізнайтеся про неї якомога більше, більше спілкуйтеся з іншими хворими на псоріаз,
— не соромтеся розповідати людям про своє захворювання, завжди починаючи з того, що воно незаразне,
- знайдіть лікаря, з яким у вас встановився хороший психологічний контакт, лікуйтеся тільки у нього, і ставтеся критично до обіцянок інших лікарів, а тим більше знахарів, повністю позбавити вас псоріазу,
- не таїться від друзів і сім'ї, заспокойте їх, пояснивши, що псоріаз, якщо його ретельно лікувати, небезпечний для життя,
- Якщо Ви не справляєтеся з переживаннями з приводу недуги, зверніться до психотерапевта негайно, адже на тлі псоріазу розвиваються особливо швидко, часто у важких формах.
Як лікують псоріаз
Найбільш уживані проти псоріазу – препарати зовнішнього застосування, і серед них кортикостероїди. Ці гормональні ліки, що зменшують запалення та пригнічують аутоімунні реакції у шкірі, випускаються у формі мазей, кремів, лосьйонів. Кортикостероїди починають діяти швидко, проте згодом втрачають ефект. Тому вони добре підходять для короткочасного лікування, а за тривалого — обов'язково зробіть перерву на кілька тижнів. Корисні у боротьбі з псоріазом і креми, що включають кальципотріол. За хімічною будовою – це похідне вітаміну D. Препарат зменшує швидкість поділу клітин шкіри, нормалізує їх дозрівання. Найдавнішим засобом народної медицини для лікування псоріазу є дьоготь (кам'яновугільний або березовий), який зараз входить до складу кремів та шампунів.
Проти псоріазу застосовують також штучне ультрафіолетове опромінення. Залежно від довжини хвилі воно ділиться на УФ-А та УФ-В.
Джерела УФ-В-випромінювання є лише у спеціалізованих центрах для лікування псоріазу. Це дуже ефективний, але, на жаль, дорогий метод.
Не входить до стандартів державної страхової медицини та ПУВА-терапії, тобто УФ-А у поєднанні з прийомом фотосенсибілізуючих (збільшують чутливість до сонця) речовин. Але джерела УФ-А найбільш поширені та доступні. Саме УФ-А викликає засмагу. Тому лампи соляріїв та побутових ультрафіолетових ламп випромінюють УФ-А. Однак при псоріазі це світлолікування стає дієвим лише при комбінації його з фотосенсибілізуючими ліками.
Не забувайте і про можливі побічні ефекти світлолікування. Це передчасне старіння шкіри та збільшення ризику раку шкіри.
З ліків для прийому внутрішньо та ін'єкцій сильним дієм мають метотрексат - цитостатичний препарат, що пригнічує прискорене поділ клітин шкіри при псоріазі; ацитретин, що відноситься до похідних вітаміну А і нормалізує поділ клітин шкіри; нарешті, циклоспорин. Це найпотужніший імунодепресант, який, зокрема, застосовують при пересадці органів для запобігання їх відторгненню.
Але ці препарати мають цілу низку побічних ефектів, про які вас повинен попередити лікар, причому частину їх можна послабити, проте інші неминучі.
Потрібні розвантажувальні дні
Щоб зменшити ризик загострень псоріазу, треба пам'ятати про кілька правил.
Приймаючи душ або ванну, використовуйте не жорстку губку або мочалку, як і тверде мило, а тільки м'яку губку або бавовняну серветку. Після душу застосуйте пом'якшувальний крем, щоб шкіра була гладкою. Носіть легкий, просторий, бавовняний одяг.
Влітку обмежте час, що проводиться в умовах кондиціювання. Якщо ж ви повинні знаходитися в такому приміщенні, то поставте біля себе ємність з водою.
Захищайте шкіру від порізів та пошкоджень, оскільки вони можуть стати причиною загострення захворювання, зведіть до мінімуму стресові ситуації.
Ваше харчування має бути багатим тваринними білками, вітамінами і виключати занадто жирне, гостре та солоне. Під час загострень не можна приймати антибіотики, спиртні напої, а також продукти, які можуть спричинити алергію (яйця, копченості, цитрусові, мед, спеції).
Віддайте перевагу вегетаріанським супам, а ось другі страви нехай будуть м'ясними (краще відварена або тушкована кролятина, курятина, індичка). Також корисні молочні продукти, причому звичайній (2,5-3,0%) жирності. Доповніть основне меню гречаною, перловою та рисовою кашами. На гарнір найкраще картопля, квасоля, капуста, але не борошнисті продукти. Сирі овочі та фрукти повинні бути присутніми на столі щодня протягом усього року: яблука, огірки, помідори, морква, буряк, цибуля, свіжий часник, кріп, петрушка.
Дуже корисні при псоріазі 2 розвантажувальні дні на тиждень. Меню у такі дні можна урізноманітнити.
М'ясний день: 400 г відвареної яловичини ділять на 5 прийомів. Додатково 2 рази на день по 100 г гарніру (сира білокачанна капуста, морква, огірки) та 2 склянки відвару шипшини.
Сирно-кефірний день: 400 г сиру та 500 г кефіру приймаються протягом дня у 5 прийомів.
Яблучний день: 1,5 кг яблук, краще за кислі сорти (антонівські) протягом дня. Нічого пити цього дня не можна.
Кефірний день: 1,5л кефіру протягом дня.
Овочевий день: 1,5 кг овочів (за винятком картоплі) краще у тушкованому вигляді. Додатково - 2 склянки відвару шипшини або неміцного несолодкого чаю. Овочі поділяються на 5 прийомів.
Якщо у вас є досвід лікування народними засобами, будь ласка, пишіть у коментарях нижче.